自动化组织工程系统的制作方法

专利名称：自动化组织工程系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于组织工程产物的自动化培养、增殖、分化、生产和养护的设备、方法和系统。这种系统、方法和产物在各种临床和实验室装置中具有用途。
背景技术：
贯穿本申请文本中，各种参考文献均以括号方式引用，以更充分描述本发明所属领域的现状。这些参考的公开内容此处均以参考文献方式引入本公开内容。
过去几年中，研究人员已开发和使用了不同的细胞培养和组织工程技术，用于各种类型细胞植入物的培养和生产。这些系统如美国专利5,041,138，5,842,477，5,882,929，5,891,455，5,902,741，5,994,129,6,048,721和6,228,635中所描述。也有将生物反应器系统开发用于细胞和细胞植入物的培养，例如美国专利5,688,687，5,728,581，5,827,729和6,121,042中所描述。
前述方法和系统通常采用常规实验室培养技术，该技术采用标准培养设备用于将选择的细胞群体接种至支架上。由此产生的植入物只含有生长于某一类型生物高分子支持物上的增殖细胞群，其中对细胞环境的任何操作都受限于任何标准细胞培养中存在的细胞因子的内源性细胞生产，以及由于细胞培养基循环所致的剪切和/或物理应力的应用，及接种有细胞的支持物的物理操作。该系统并没有致力于也不能够产生组织植入物，所述组织植入物含有代表体内发育组织的增殖和分化细胞，并且进一步整合入一个可成功整合于体内的选择支架。并且，已知方法和系统不能在单个自动化组织工程系统中多功能性地实施下列所有步骤活检组织消化以获得分离细胞，随后的细胞接种于增殖基片(substrate)上，细胞数量扩增，控制性分化，组织生成以及组织植入物的产生。这主要因为已知培养系统不够高级，在于它们不能自动化评测及操作发育中的植入物周围的变化环境，从而使细胞逐渐增殖与分化成所期望的植入物。
而且，常规培养方法和系统是劳动密集型的，会遭致污染及由于人为错误和缺少持续的性能评价而导致的培养成功程度变动的缺点。常规培养系统要求，在用于接种的细胞制备中的大部分初始步骤(即组织消化、细胞选择)需要人工操作，这很耗费时间，所产生组织的质量也不可靠，并且易引起培养污染问题。由于固有的设计限制，限制了细胞和组织培养过程，不能充分监视和改变环境以支持组织发育，以及缺少能够实施有效质量控制检测的技术，因而该系统不能支持从原代或前体细胞中自动化制备组织工程植入物。
由此，对用于在组织工程植入物的发育和生产中可连贯满足与不同步骤有关的操作需求的离体和体外组织工程的改进系统仍存在实际和尚未满足的需求。具有特别重要性的是产生功能性组织结构的能力，其中存在的细胞具有活性，已分化并表达有胞外基质。这不仅仅包括，且显著不同于对存在于宿主位置处的成熟体内环境的简单模拟。这是因为功能性新生组织的制备基本要求为细胞能通过一系列发育阶段而发展，作为离体工序的一部分。
为了同时解决临床和研究需求，已开发了新设备、方法和系统，避免了一些常规离体培养技术和系统的缺点和限制。
发明概述本发明涉及一种用户友好的细胞培养和组织工程自动化系统，可用于供人和家畜使用的各种临床和研究装置。
此处使用的“组织工程”可定义为“应用工程学和生命科学的原理和方法，用于生物替代品的基础理解和开发，以恢复、维持和改善组织功能”。该定义旨在包括多步操作，操作中的生物替代品是可植入在由生物相容性材料组成的基片或支架上以生成组织，尤其是可植入组织结构的细胞或不同细胞的组合。而且需要指出，组织工程过程中包含的细胞可以是自身的，同种异体的或异种的。
本发明的组织工程系统设计成在无菌操作条件下实施所有活动。该系统在操作中是充分自动化，便携，多功能的，并且可履行/提供一种或多种以下功能-组织活检的无菌接收/贮存；-消化过程的自动监测；-消化活检组织以得到分离细胞；-细胞分拣和选择，包括安全的废物收集；-细胞接种于增殖基片或支架上或者其内；-增殖细胞以扩增细胞群体；-细胞洗涤与细胞收集；-细胞接种于组织工程支架或基质上或者其内；-细胞分化以达到细胞活动专门化；-组织生成；-机械和/或生物化学刺激以促进组织成熟；-收获组织工程结构/植入物用于重构建手术；以及-可植入组织的贮存和转运。
本发明组织工程系统可进行预编程，以单独地、按顺序地或按期望和要求以特定的预先确定的部分顺序执行上述每一步骤。而且，每一步骤或任何其组合，是在组织工程模块上的一个或多个生物反应器内完成的。该组织工程系统在操作中是预编程以及自动化控制的，由此需要的用户干预可达最小，作为结果，可增加细胞培养和/或组织工程过程的效率和重现性，同时使污染风险减至最小。本发明的组织工程系统及其组件在微重力和/或零重力条件下可操作，该条件下这种系统和组件用于太空研究。
本发明系统设计成使得原代或前体细胞可从给体组织中分离用于组织植入物的进一步繁殖，分化及生产。作为替代，也可单独或与其他来源细胞结合采用细胞系。
本发明是一种自动化组织工程系统，该系统包含支托有至少一个生物反应器的外壳，所述生物反应器可促进生理细胞功能及来自细胞和组织来源的组织结构的产生。外壳还支托与生物反应器有流体连通的流体安全系统(fluid containment system)。与外壳和/或生物反应器相关联的是监视流体安全系统内流体的生理学参数的传感器。安置于外壳内的微处理器与生物反应器和流体安全系统连接，作用在于控制它们的运行。微处理器也可独立控制系统内的环境条件。
本发明的另一方面提供了一种用于细胞和组织工程的系统，含有便携且无菌的带有一个或多个生物反应器的组织工程模块，所述生物反应器提供了下列基础组织消化、细胞接种于增殖基片、细胞增殖、细胞接种于分化支架、细胞分化和组织生成以及随后成熟为用于植入的功能性组织。生物反应器与培养基流动和贮藏系统可操作连接，用于非回流方式的试剂运送和废液收集。生物反应器和/或培养基流动系统任选地包括采用半渗透膜的气体交换组件，以允许气体产物的传递，从而控制培养基中的溶解气体水平。组织工程模块与中央微处理器控制的基本单元可操作地相互作用，所述基本单元自动化监视生物反应器内细胞培养或组织工程过程的进程并调节环境条件以满足不同阶段的细胞培养和组织发育的需要。对理想条件的偏离可被生物反应器内存在的各种传感器检测出，所产生的信号被中央微处理器所监视。由此，环境条件的变化可被自动化监视，并按所需进行改变，所述环境条件例如但不限于pH、温度以及溶解气体。另外，细胞增殖的状态通过检测作为时间函数的代谢周转率(例如pH，O2，CO2，乳酸和葡萄糖消耗)进行间接评价。组织工程模块自身可任选地包括与中央微处理器操作一致的二级随车携带的微处理器，以进一步地通过中央微处理器控制处理条件。通过在组织工程模块上直接执行特定功能，组织工程模块微处理器扩展了组织工程系统的数据处理能力，从而使对中央微处理器的需求减至最小。
各种生长因子、细胞因子、实验试剂、药物、化学物质、培养液及其任意组合可以装载并贮存于位于组织工程模块上的任一贮罐内，并根据预编程顺序或按发育中的组织植入物所需自动传递至一个或多个生物反应器。单个组织工程模块可从系统中移除用于转运，而不会对生物反应器内存在的组织工程结构的无菌性产生危害。这种移除不会影响组织工程系统中存在的任何其他模块的处理。而且，组织工程工序完成后，组织工程模块认为是可以置换的，这种实践防止了由在先使用而引起的污染。
在本发明的各种实施方案中，设备和系统可用以消化由手术活检获得的组织。在另一实施方案中，可对细胞进行过滤并选择和分离特定群体。在另一实施方案中，可对消化细胞进行增殖，以扩增细胞群体。在进一步的实施方案中，细胞可接种并培养于所期望的支架或基片(也称为基质)上。在进一步的实施方案中，细胞可在所需支架或基片上分化，和/或遍布所需支架或基片，直到获得合适的组织生成。在进一步的实施方案中，可对组织进行刺激以促进组织成熟。在另一实施方案中，产生了适合用于重构建手术的组织植入物。在进一步的实施方案中，可在细胞增殖和发育进程的每一阶段以无菌方式进行细胞取样，而不会对培养物本身产生副作用。前述每一实施方案可按所需单独或按次序完成。可通过中央微处理器和/或基于组件的微处理器对这些处理事件进行追踪，用于并入质量控制记录中。
一方面，组织工程系统任选地采用一种合成的生物材料化合物SkeliteTM，如在本申请人的美国专利6,323,146中所描述(其内容此处引入作为参考)，以增强生物性能。简单的说，SkeliteTM是一种绝缘的可生物重吸收的生物材料化合物，含有钙、氧和磷，其中至少一种所述元素的一部分为具有接近0.1-0.6埃离子半径的元素所取代。在一个实施方案中，SkeliteTM作为生物反应器壁上的包被，作为增殖基片上的薄膜，或作为三维且高表面积的增殖支架，用于增强细胞增殖。SkeliteTM在增殖阶段的用途可陈述为-增加增殖速率；-增加增殖步骤后的细胞产量；-减少用于目标细胞产量所需的表面积；-减少增殖过程中出现细胞表型去分化问题的趋势；以及-增强生长因子对增殖基片的结合。
在进一步实施方案中，SkeliteTM可用作可重吸收支架，以增强细胞的分化和随后的组织结构的生成。SkeliteTM在分化阶段的用途可陈述为-通过改进分化阶段的可靠性，增加产率；-增加组织结构的完整性，由此增加其生物成活力；-在各种支架物格式的基础上，容许结构构造的挠性；-容许增殖、分化和组织生成阶段在共同基片上出现；-增强生长因子对分化支架的结合；以及-改进手术植入过程中组织结构的操作属性。
另一方面，本发明提供了通过原代或前体细胞的消化、增殖、接种和分化的自动化步骤，用于组织结构制备的方法和系统，所述细胞来源于患者由此可以免去免疫和疾病传染问题。植入物可由各种细胞类型的控制培养而生成，包括但不限于软骨细胞，基质细胞，成骨细胞，神经细胞，上皮细胞及其混合物。
在一个实施方案中，本发明系统可结合一种或多种可分离的、便携的以及可独立操作的组织工程模块，所述组织工程模块支托一个或多个生物反应器，培养基贮罐和流体/培养基流动系统。每一模块以及生物反应器都在中央微处理器的自动化控制之下。模块和关联的生物反应器可加以配置用于各种专业化应用，例如但不限于-组织活检的无菌接收/贮存；-消化试剂的自动化混合和运送；-消化过程的自动化监视；-活检组织的消化以获得分离细胞；-细胞分拣和选择，包括安全的废物收集；-细胞洗涤和细胞收集；-细胞在增殖基片或支架上或在其内的接种；-增殖试剂的自动化混合和运送；-细胞增殖以扩增细胞群体；-细胞条件的自动化监视，包括汇合的检测；-细胞从增殖基片或支架上的控制性释放；-在选择的表面积尺寸上重复增殖步骤，以增加细胞数量；-细胞群体朝一个或多个组织工程支架或基质的沟道作用；-细胞在增殖基片或支架上或在其内的接种；-分化试剂的自动化混合与运送；-细胞/组织培养条件的自动化监视；-细胞分化，使细胞活性得以专门化；-组织生成；-机械和/或生物化学刺激，以促进组织成熟；-收获组织工程结构/植入物，用于重构建手术；以及-细胞和/或可植入组织的贮存和转运。
当系统内装备有两个或更多个生物反应器，所述生物反应器直接支托于系统外壳内，或支托于可插入外壳内的组织构成模块上时，该生物反应器可以串联形式连接，可单独操作并受微处理器控制，或者作为替代，可以根据使用者对微处理器的编程进行独立操作控制，并达到所期望的结果。而且，当系统内装备有两个或更多个生物反应器时，生物反应器可与内室连接，从而从生物反应器到生物反应器之间有细胞和/或组织的交换。
生物反应器可按要求以任何尺寸和构造制作，以支持增殖和分化支架或基片的数量和尺寸变化。生物反应器可作为组织工程模块的结构组件的一部分而并入其内。可替代地，生物反应器可以是可分离的，对于组织工程模块的剩余组件而言，生物反应器可作为独立组件。如果作为分离组件，生物反应器可单独包封装于无菌封装内，并在使用时采用无菌通路法连接至组织工程模块。而且，在组织工程过程完成后，为了便于转运至操作室，无菌通路法使得生物反应器可从模块分开，所述操作室是为新生成的可植入组织结构的回收作准备的。
经由控制传动装置，生物反应器和/或组织工程模块可在整个组织工程系统内旋转或搅拌。旋转使得能有益利用重力来完成特殊的生物加工工序，例如基于沉降的细胞接种以及生物反应器内的流体交换。
组织工程模块可以是条形编码的，或拥有一个既在组织工程系统内部又在其外部作为临床或实验环境一部分的快速和精确追踪的内存芯片。这种引入组织工程设备内的追踪技术也使得能进行用于患者记录的电子追踪，所述电子追踪经由基于临床的信息系统实现。这就确保了对组织工程模块及由此的相关细胞或组织植入物的正确编码，以保证施用于正确患者，并确保了该过程的记录，以用于医院结帐的目的。组件和/或生物反应器也可以类似方式使用条形码和/或内存芯片，用于患者和样品的快速与精确追踪。
本发明的一方面是一种自动化组织工程系统，含有-外壳；-至少一个为所述外壳支托的生物反应器，所述生物反应器促进了生理学细胞功能和/或来源于细胞和/或组织的一种或多种组织结构的产生；-为所述外壳支托的流体安全系统，与所述生物反应器流体连通；-一个或多个与一个或多个所述外壳、生物反应器或流体安全系统相关联的传感器，用于监视涉及所述生理学细胞功能和/或组织结构产生的参数；以及-与一个或多个所述传感器连接的微处理器。
本发明的另一方面是一种自动化组织工程系统，包含-外壳；-至少一个容纳于所述外壳内的可去除的组织工程模块，所述组织工程模块含有支托结构，所述支托结构支撑至少一个生物反应器，所述生物反应器促进了生理细胞功能和/或一种或多种源自细胞和/或组织的组织结构的产生，还含有与所述生物反应器有流体连通的流体安全系统，以及一个或多个传感器，用于监视涉及所述细胞培养和/或组织工程功能的参数；以及-位于所述外壳内并与所述组织工程模块连接的微处理器，所述微处理器控制所述组织工程模块的操作。
进一步地，本发明的一方面是便携和可灭菌的组织工程模块，所述模块包含-支撑至少一个生物反应器的结构支持物，所述生物反应器促进了细胞培养和组织工程功能；-与所述生物反应器流体连通的流体安全系统；以及-一个或多个传感器，用于监视涉及所述细胞培养和组织工程功能的参数。
在本实施方案的某些方面，生物反应器含有生物反应器外壳，所述外壳带有用于培养基流动的一个或多个进料口及一个或多个出料口，以及至少一个限定于所述生物反应器外壳内的室，用于接收细胞和/或组织以及促进所述的细胞培养和组织工程功能。所述室可选自细胞培养/增殖室，细胞分化/组织形成室，组织消化室以及其组合。而且，所述室内装有一种或多种基片和/或支架。在本发明实施方案中，生物反应器内装备的两个或多个室可操作连接。作为替代，两个或多个生物反应器可独立操作或可进行协力操作。进一步的某些方面，室和/或生物反应器可操作连接，从而为室和/或生物反应器之间的流体、细胞和/或组织提供交换。本发明中使用的支架选自多孔支架、带有梯度孔隙率的多孔支架、多孔网状支架、纤维状支架、膜环绕支架及其组合。室也可进一步细分成多个区域。例如，分化/组织形成室可拥有多个区域，以容纳数个支架。生物反应器内的室之间拥有漏斗或类似的通道。而且，可在生物反应器内任一位置装备一个或多个过滤器。
本发明的另一方面是一种生物反应器，所述生物反应器提供了用于细胞培养和/或组织工程功能的环境，所述细胞培养和/或组织工程功能选自组织活检的贮存，组织活检的消化，细胞分拣，细胞洗涤，细胞浓缩，细胞接种，细胞增殖，细胞分化，细胞贮存，细胞转运，组织生成，植入物生成，可植入组织的贮存，可植入组织的转运以及其组合。
本发明的另一方面是一种生物反应器，用于促进和支持细胞功能和可植入的组织结构的产生，所述生物反应器包含-生物反应器外壳；-用于培养基流动的一个或多个进料口及一个或多个出料口；-限定于所述生物反应器外壳内的至少一个室，用于促进和支持细胞功能和/或源自细胞和/或组织的一种或多种组织结构的产生；以及-一个或多个传感器，用于监视与所述至少一个室内的所述细胞功能和/或组织结构的产生相关的参数。
在本发明实施方案中，生物反应器外壳含有一个盖子，所述盖可以是可分离的盖或与生物反应器外壳形成整体。
细胞和组织可以选自骨、软骨、相关的骨和软骨前体细胞及其组合。更特殊地，适合在本发明的生物反应器、组件和系统内使用的细胞选自胚胎干细胞、成人干细胞、成骨细胞、前成骨细胞、软骨细胞、髓核细胞、前软骨细胞、来自骨、骨髓或血液的包括干细胞在内的骨祖细胞，以及其组合，但不限于此。相对由本发明的细胞培养和组织工程功能生成的植入物的接受者而言，细胞或组织来源可以是自身的，同种异体的或异种的。
本发明的另一方面是于本发明的生物反应器内产生的组织植入物。
本发明的另一方面是通过本发明的组织工程系统而产生的组织植入物。
本发明的另一方面是组织工程可植入结构，用于骨损伤的修复，其中植入物含有骨生物材料的多孔支架，并与活性骨细胞和组织工程矿化基质相结合。
本发明的另一方面是组织工程植入物，包括-含有组织工程软骨的软骨区，所述软骨不含任何基于矿物的支架；-含有多孔支架的骨生物材料区；以及-所述软骨区与所述骨生物材料区域之间的界面区域。
体内植入时，软骨区促进与宿主软骨的侧面整合，而骨生物材料区域促进了与软骨下骨板的侧面和垂直整合。界面区域则提供了软骨区和骨生物材料区域之间的结构联合。软骨区可另外掺入次级非矿物支架，用以辅助组织工程软骨的生成，并使得用于具有某种形状的表面轮廓的形成，所述表面轮廓与植入位点的特定解剖学特性相一致。
本发明的另一方面是用于消化组织活检的方法，所述方法包含-将组织活检载入与培养基贮罐和流动系统相连的生物反应器内，所述生物反应器带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；-提供组织消化酶；以及-监视并维持所述生物反应器内合适的消化条件，持续足够的时间段，以达到组织消化的期望水平。
本发明的另一方面是用于细胞增殖的方法，所述方法包含-将细胞接种至支托于生物反应器内的增殖基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内合适的培养条件，持续足够的时间段，以达到细胞增殖的期望水平。
本发明的另一方面是用于细胞分化的方法，所述方法包含-将细胞接种于支托于生物反应器内的分化基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内合适的培养条件，持续足够的时间段，以达到细胞分化的期望水平。
本发明的另一方面是一种方法，用于消化组织活检，以提供原代细胞，所述原代细胞包括诸如干细胞在内的前体细胞，然后增殖和分化细胞使能够生成组织植入物，所述方法包含-将组织活检载入与培养基贮罐和流动系统相连的生物反应器内，所述生物反应器带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；-提供组织消化酶；
-监视并维持所述生物反应器内合适的消化条件，持续足够的时间段，以获得分离细胞。
-将分离细胞接种至支托于生物反应器内的分化基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内合适的培养条件，持续足够的时间段，以获得细胞增殖和扩增的期望水平；-将扩增细胞从增殖基片或支架上释放；-将扩增细胞接种至支托于生物反应器内的分化基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，以检测和传递所述生物反应器内的生理学条件至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适培养条件，持续足够的时间段，以获得组织植入物。
本发明的另一方面是提供骨骼植入物的方法，所述方法包含-将成骨和/或骨祖细胞接种至骨生物材料的多孔支架上，所述多孔支架支托于与培养基贮罐和流动系统连接的生物反应器内，所述生物反应器带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适条件，持续足够的时间段，使成骨和/或骨祖细胞增殖和/或分化于整个支架，从而提供用于整形术应用的组织植入物。
本发明的另一方面是用于提供软骨植入物的方法，所述方法包含-将软骨生成细胞和/或软骨祖细胞接种至生物材料的多孔支架上，所述多孔支架支托于与培养基贮罐和流动系统连接的生物反应器内，所述生物反应器带有一个或多个传感器，以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适条件，持续足够的时间段，使软骨生成细胞和/或软骨祖细胞增殖和/或分化于整个支架，从而提供软骨植入物。
本发明的另一方面是用于洗涤细胞的方法，所述方法包含-于室内载入含有一种或多种非期望化学物质的细胞悬浮液；-通过错流过滤模块将来自室的细胞悬浮液连续再循环，所述错流过滤模块含有所述细胞不能透过而所述不期望的化学物质可以透过的膜，从而提供洗涤后的细胞悬浮液；以及-收集洗涤后的细胞悬浮液。
本发明的另一方面是用于细胞富集的方法，所述方法包含-于室内载入含有过量细胞悬浮液体积的细胞悬浮液；-通过错流过滤模块将来自室的细胞悬浮液连续再循环，所述错流过滤模块含有所述细胞不能透过的膜，而所述膜允许过量的细胞悬浮液体积被去除并收集。
本发明的另一方面是一种提供用于脊椎盘内核重建的植入物的方法，所述方法包含-将髓核细胞接种至支托于连接有培养基贮罐和流动系统的生物反应器内生物材料的支架或多孔支架上，所述生物反应器带有一个或多个传感器，用以检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适条件，持续足够时间段，以使髓核细胞增殖和/分化并表达具有髓核特性的胞外基质组分。
本发明的进一步方面是用于临床组织工程中的质量评价样品的制备方法，所述方法包含-采用此处描述的本发明系统并行制备初级和次级植入物，其中初级植入物用于植入，一种或多种次级植入物用于试验目的，以推断初级植入物的口径。
在各种实施方案中，本发明组织工程系统均在一个或多个微处理器的控制之下，所述微处理器可以预编程使得使用者可在生物反应器内选择特定类型的环境(或环境工序)，诸如组织消化，细胞增殖，细胞分化和/或组织结构生成。这就消除了操作者的干预并减少了不经意污染的可能性。
本发明组织工程系统可以“成套部件(kit)”的方式供应。设备、组织工程模块、生物反应器及其任何组件可以这种方式进行包装，并与使用说明书和质量控制方法一并出售。
本发明系统对于医院临床使用是理想的，尤其是用于由于损伤和/或疾病而需要组织工程植入物的手术装置中。采用本发明系统，从经由患者活检获得的自身组织、同种异体细胞或异种细胞中，可安全制备组织工程的可植入结构。这种组织工程可植入结构的规格可与植入位点的类型、尺寸和条件相匹配。而且，由本系统产生的植入物含有活性细胞，可促进与宿主的整合，从而改善患者的恢复。
实际上，采用自身细胞模型时，可在手术室内从患者身上获得组织活检，并直接置于组织工程模块上的生物反应器内。根据所需组织结构的类型和尺寸可选择特定生物反应器设计。组织工程过程完成后，产生的组织结构仍容纳于无菌生物反应器内，可转运至手术室，用于植回患者身上。该系统对于以安全和有效治疗方式提供“定制”的自身组织植入物是理想的。
本发明系统和方法并不限于提供自动化的细胞培养方法。所描述的组织工程系统已远超出细胞治疗中的细胞扩增范围。组织工程系统可用于产生功能性组织结构，结构内的细胞是有活性的，分化的并且表达胞外基质。因而，由此产生的组织结构处于高度发育状态，从而加快了植入位点处组织修复的速度，并改善了组织修复质量。
本发明系统也适用于药理学研究。特别地，本系统在药物开发领域也具有用途。新的潜在药物和分子可在细胞和组织上进行试验，以确定对细胞事件和组织发育的影响。这种试验可在患者自体细胞/组织上完成，使得在施用前评价和可能的避免不利的副作用。此外，在药物发现过程中，以本发明系统作为关键工具，可采用专门化的细胞系或组织。系统可进行编程，以监视和评价生物反应器内细胞/组织的各种生理学条件，并由此提供所选药物或分子的生物学效应的快速指示。
对于常规组织工程技术难以采用和实施的领域，和/或在需要广泛诊断记录的条件中，也可采用本系统用于研究和开发。例如，包含组织工程的微重力研究由于该环境的独特属性而很难施行。由于流体安全问题和基于重力的细胞转运的缺乏，常规的细胞和组织培养技术在这种环境中是不可行的。然而本系统是完全密封的从而防止了流体损失，并且作为组织工程过程一部分的细胞迁移可通过受控的流体流动而达到，因此本发明的系统和方法可很容易地适应微重力环境。
本发明的其他特征和优点可从如下发明详述、实施例和附图中明显看出。然而，应当理解的是，对于本领域技术人员而言，由于本发明主旨和范围内的各种变化和修改可从所述详述中明显看出，因而在说明本发明实施方案时，发明详述、具体实施例和附图仅仅是以例证方式给出。
附图简述参考附图从如下描述中可进一步理解本发明，图中

图1图解了用于临床组织工程的常规方法，如采用自身软骨细胞进行软骨修复的实施例中所应用的；图2所示为本发明的一种一体化组织工程设备；图3所示为图2组织工程设备的进一步实施方案；
图4所示为图2组织工程设备的进一步实施方案；图5所示为图2组织工程设备的剖视图，图解了内部组件和插入设备内的组织工程模块；图6所示为图2组织工程设备的放大剖视图，图解了插入的组织工程模块；图7所示为组织工程模块及其与设备外壳组件的接口的放大透视图；图7(a)所示为生物反应器和泵单元的放大透视图；图7(b)所示为泵单元和相关泵管道的放大透视图；图8所示为图7组织工程模块背侧以及与其相连的流动板内部构造的剖视图；图9所示为与配备仪表的生物反应器设计相关的混合与微载组件的放大剖视图；图10所示为基本的组织工程液体流动示意图；图11所示为基本的组织工程液体流动示意图的进一步实施方案；图12所示为备用的生物反应器，增殖基片或支架，分化基片及过程监视设计，如在不同组织工程方案中可适用的；图13所示为组织工程模块的生物反应器的放大剖视图，图解了生物反应器和流体流动通道的内部构造；图14所示为组织工程模块的生物反应器的进一步实施方案，图解了生物反应器的内部构造；图15所示为可旋转的生物反应器设计；图16所示为组织工程模块的无菌取样实施方案；图17所示为组织工程流体流动示意图的进一步实施方案；图18所示为组织工程流体流动示意图的进一步实施方案；以及图19所示为适于组织消化和细胞收集的生物反应器设计；图20所示为适于细胞增殖的生物反应器设计；图21所示为适于细胞分化和组织结构生成的生物反应器设计；图22所示仍为组织工程流体流动示意图的进一步实施方案；以及图23所示为组织工程模块的进一步实施方案，所述组织工程模块带有用于组织消化/细胞收集、细胞增殖以及细胞分化/组织生成的单独生物反应器。
发明详述本发明涉及一种成套、自动化的组织工程设备，用于细胞，尤其是自身细胞的离体处理，使之以有效和一致的方式进行细胞增殖，细胞分化和组织生成，对人为干预的需要减至最小。在该设备内生成的组织结构可整合入宿主，从而帮助组织重建过程和随后的患者恢复。而且，本发明提供了所述组织工程采用得自许多不同来源的各种细胞(例如经由患者活检获得的自身细胞，同种异体细胞或异种细胞)用于组织工程的自动化方法。而且，所述细胞可以是前体细胞，原代细胞，来自永生细胞系的细胞以及其组合。
结合了本发明组织工程系统和方法的用于临床组织工程的常规方法学和原理如图1所示，该图采用自身软骨组织工程作为代表实例。在该实例中，细胞(即软骨细胞)从患者手术活检获得，并以人工或自动化接种至合适的基片或支架上(即SkeliteTM支持物)。软骨细胞和支持物存在于自动化组织工程模块的生物反应器部分，所述模块构成组织工程系统临床基地的一部分。组织工程系统内存在一个中央微处理器，用以控制和定制生物反应器的内部环境，从而促进其内的组织生长，导致刺激细胞生长于支持物内部和上面，以产生植入物。生物反应器内的传感器提供对微处理器的反馈，以保证细胞以期望和受控的方式进行接种、扩增和分化，从而提供自身的组织植入物。植入物一旦产生即从生物反应器移去用于患者的手术植入。本发明提供了一种有利途径，用于以无菌、安全、方便和有效方式提供自身的组织工程植入物。而且，在临床装置中制备组织工程植入物的能力允许进行组织工程过程的场所具有相当灵活性。虽然系统可在集中化场所使用，系统的设计和操作则使得能够在区域化中心进行临床应用。这种广泛的可利用性消除了生物材料转运至和自集中化细胞/组织处理设备，从而改进了组织工程过程的成本效果和效率，同时避免了运输、跟踪和调控的复杂情况。
本发明的一个实施方案是如图2所示的组织工程系统，通常以标号100标识。系统100(作为替代，可称其为设备)含有外壳102，外壳102带有用于接收组织工程模块的插槽104。插槽104带有可移动门106和锁定机构108。装备有诸如接触式屏幕、键座及此二者组合的用户界面110，用于系统操作的控制及用于系统状态的显示。存在有数据储存系统112，使通过本领域人员熟知的各种介质(即ZIP，CDROM，磁盘，闪速卡)记录信息。计算机/通信链接114提供了上载新软件，采用外部计算机修改控制参数，下载数据以及故障检修和测试设备的能力。该链接也使系统能与临床中存在的电子信息系统相连接。系统100由电源输入116提供电源。图3所示为系统100的进一步实施方案，带有几个弯状门106以容纳若干组织工程模块。图4所示为系统100的进一步实施方案，带有以水平方式朝向的弯状门106，使得组织工程模块相对重力向量能够优先取向。
图5所示为图2和图3描述的系统100的内部构造，其弯状门为垂直取向，用于组织工程模块垂直插入。所示组织工程模块118用于插入弯状门106的插槽104内。组织工程模块118经由导轨系统(guiderail system)120而进入系统外壳102。插入后，模块118与一个或多个泵单元122(即蠕动的、活塞的、隔板的或旋转的)，电子连接器(即DIN，AMP，PCB，实验电路板插口)以及阀传动装置126(即伺服电机、线性驱动器，线性传动装置)接合。任何能够使模块正确插入系统内的合适引导系统认为都是为本领域人员所能理解的。
如图6中可以更好的看出，组织工程模块118被插入外壳102，模块上一系列阀传动装置126与阀(如图7和7a更详细图示)连接以提供流动控制。电子连接器124经由电子底板130提供了模块118和中央微处理器单元(CPU)128之间的电子连接。CPU128控制操作顺序，液体和气体的转运，过程数据的管理，系统状态的监视，用户界面以及外部数据通信端口。CPU128通过与有源和无源电子组件电子链接提供控制，所述有源和无源电子组件存在于底板130和每一插入的组织工程模块118上。
温度传感器132(即热电偶，RTD或热敏电阻)，气体传感器134(即O2和CO2)以及环境控制单元(ECU)136通过CPU128进行控制，以采用本领域人员已知标准方法维持外壳102内的环境(即温度和气氛)。可对环境进行调节以满足组织工程过程的需要，包括冷藏温度(即4℃)下的试剂贮存，对名义体温(即37℃)的模拟，以及在模块装备有气体交换组件(即膜)时，用于转运进出模块118的气体混合物的可利用度。气体条件为处于外壳102内的气体传感器134所监视，所得数据经由电子底板130传至CPU128。对ECU的气体输入可经由气体供应入口140而进行，所述气体供应入口140设在装配有标准接头配件的外壳102内。在其他实施方案中，气体可贮藏于ECU内。设备内使用的气体包括但不限于氧气、二氧化碳、氮气以及其混合物。为了在外壳102内充分容纳这些气体，对弯状门106进行了配置，使得关闭时能提供密封。外壳102采用绝缘材料142进行绝缘，以使能对内部温度(即4℃-37℃)进行有效调节，所述绝缘材料142例如聚苯乙烯泡沫塑料，气凝胶，玻璃纤维等等。
虽然本发明组织工程系统通常所示为含有方框形外壳，但本领域人员可以理解外壳可做成各种构型，只要它能容纳此处描述的组件。例如，这包括但不限于开放式构型，可以不需要顶部和/或侧边部分。
组织工程模块118在图7-9中有更详细图解。组织工程模块118含有刚性结构脊骨(structural spine)200，该脊骨200上附接有生物反应器202。生物反应器202含有带有盖子204的生物反应器外壳，并可以根据其内所含基片或支架进行定制，从而进行组织消化、细胞培养、细胞增殖、细胞分化、组织植入物生成以及其组合。生物反应器盖可以是可分离的，或者作为替代，可与生物反应器外壳形成整体。相对结构脊骨200，结构生物反应器202可以是单独可分离的及可置换的。为能实现这种分离，生物反应器202和结构脊骨200可采用流体分离配件，包括输入和输出线路自我封闭的构造，以避免流体损失及预防生物反应器内含物的污染。在组织工程工序完成后，整个组织工程模块认为是可以置换的，因为该实践可防止由前次使用引起的污染。作为替代，模块118中只有选定的组件由于与流体接触而认为是可置换的，而留下不容易污染的组件用于再使用。
如图7、7a和7b中所见，组织工程模块118的结构脊骨200上附接有流体安全系统206。流体安全系统206由一系列无菌的挠性贮罐208和挠性管210构成，所述挠性管210用于为生物反应器202供应，以及从生物反应器202取回各种类型的组织及细胞培养液和药物。贮罐208的构造和数量可按需要进行变化，并且可以容纳不同类型的细胞和组织培养基，生长因子，药物试剂，而且也可以容纳来自生物反应器202的废弃培养基和/或培养基样品。流体经由一系列流体进入孔212载入流体安全系统206或从流体安全系统206中去除。管210提供了各种贮罐208和流体控制组件之间的流体连接，所述流体控制组件例如流体流动控制阀214。流体流动控制阀214通过阀传动装置126进行开启和关闭。类似地，泵单元122与模块上存在的可置换泵组件进行连接。这些泵组件可以是活塞、隔板、旋转元件或蠕动管218，条件是在细胞悬浮液的转运过程中，对这些组件的操作不会产生危害细胞成活力的苛刻条件，例如过度剪切应力。泵单元122和阀传动装置126位于外壳102内。作为替代，传动装置和泵单元可以形成组织工程模块的一部分，然而，这可导致患者使用后对这些组件的处置。流体通过泵单元122在泵管218上的程序性作用而转运出贮罐208。流体经由管210从挠性流体贮罐208行至流体阀214。流体流动板220(如图8中所示)指引不同流动控制阀214和泵单元122的泵管218之间的流体流动。流体返回选择的空贮罐208用于储存。挠性印刷电路板(PCB)222提供了用于结构脊骨200和/或生物反应器202上存在的电子组件(即传感器)的电子接口。当传感器指示被监视参数(如pH)超出可接受水平时，CPU可触发控制性干预，例如替换生物反应器内的培养基。
组织工程模块可任选地包括微处理器224，使得在模块上直接进行数据处理和数据储存。当模块插入外壳102内时，该信息可传送至中央CPU128，一旦模块除去时，信息可保留在电子内存中，用于下一次的访问。除了经由微处理器或安置于组织工程模块上的内存芯片进行数据储存外，该模块还可以任选地包括条形码226，磁条228，电子内存(图中未示出)和/或ID标签230，以便利临床内的管理跟踪。
如图8中所见，流体流动板220固定于组织工程模块118的结构脊骨200。连接流体流动板的方法可以是压配合，滑入配合(snap fit)，超声焊接，溶剂粘合等等，但不限于此，这是鉴于所采用方法必须使得装配件密封，以避免流体损失和预防污染。如图8a中分解视图所示，流体流动板220带有整体流体通道232，从而为与流体阀214的致动相关的流动指引提供了手段。新的流动通道可经由对流动板220上存在的通道进行修正而得以容纳。在一个实施方案中，流动板220可整合形成结构脊骨200，以形成单个组件。包括流体加热与混合室234，以确保导向至生物反应器的流体处于合适温度并被充分混合，从而不会中断生物反应器内进行中的生物学过程。而且，组织工程模块118上存在热电元件236，使生物反应器202内的温度对比模块操作温度而改变，正如按ECU136的操作所规定。当组织工程模块的剩余组件，尤其是试剂和/或样品，处于降温(即冷藏)状态以维持物理、化学和/或生物学成活力时，这种温度改变对于模拟生物反应器内的名义生理学条件是必要的。热电元件的电源和控制由CPU128执行。除了生物反应器上存在的传感器，组织工程模块上存在的传感器238给CPU128提供反馈。传感器和热电经由电缆240和连接器124进行连接。
图9所示为组织工程模块118的混合和微载方面。生物反应器202带有混合驱动器260，所述混合驱动器260与混合传动装置262可操作连接并连至混合隔板264。混合隔板整合作为生物反应器202或生物反应器盖204的一部分，如图所示。操作中，混合驱动器260结合混合传动装置262提供了混合隔板的转换或脉冲，以对生物反应器202内含物实施控制性混合。理想的混合性质应能避免高流体剪切，所述高流体剪切会破坏生物反应器内存在的细胞的物理整体性。对于特定的组织工程方案，适度水平的流体剪切对于组织结构的成功发育是真正有益的。除了混合组件，还存在冲击驱动器266和冲击传动装置268。当增殖工序完成时，这些组件用于对生物反应器组件进行控制性冲击，以辅助细胞从位于生物反应器内的增殖基片或支架上释放。同时还装备有微载驱动器270，可与微载传动装置272和微载隔板274可操作连接。微载隔板274整合作为生物反应器202或生物反应器盖204的一部分，如图所示。微载隔板的位置和取向使其与基片或支架以及生物反应器202内存在的任何相关细胞或组织有密切接触。已经知道微载的应用对于特定组织工程方案是有利的。混合驱动器260，冲击驱动器266以及微载驱动器270可以是一系列机电设备的任一种，例如螺线管，线性驱动器，旋转驱动器或压电组件。而且，混合驱动器260，冲击驱动器266，微载驱动器270，以及相关的传动装置也可安装于外壳200上。作为替代，驱动器和传动装置可安装于组织工程模块或生物反应器上，条件是驱动器的设计应与组织工程模块的可置换性质一致。除了提供机械刺激，也可对生物反应器进行配置，以引入对组织结构的电和/或化学刺激。特别地，可在生物反应器区域内产生电场，以增强细胞转运和/或组织形成。电场的产生方法是本领域人员已知的，包括但不限于电线圈的提供。
图10所示为用于组织工程模块118的基本流体流动示意图，其中生物反应器202内有一单个细胞或组织培养室(多室生物反应器的进一步信息可参阅图12和17的说明)。流动通道将生物反应器202连接至贮罐208，所述贮罐208用于供给流体和收集废弃物。流体进入孔212可用来装载试剂或去除样品或废液。在泵单元122的操作下产生流动，流向由特定流动控制阀214的致动所规定。对生物反应器的灌注可以是连续的或脉动的，条件是相关流动不会导致含细胞区域的高流动剪切，因为这种情况会伤害细胞或新兴组织结构。再循环回路280使得生物反应器的液体内含物可被外部组件监视或更改，而不需要从流体贮罐208运送新流体，所述外部组件例如内嵌的气体交换膜282。用于储藏流体的组织工程模块118的组件(即贮罐208)在接近4℃下冷藏，以便于在用来模拟体温的高温(即37℃)下会分解的流体的储存。根据预编程的程序，CPU128控制流体阀214的操作，以使贮存于贮罐208内的流体在进入生物反应器室300(如图13，14和15详细图解)之前，经由泵单元122可运送至加热混合室234。流体经由进料口302供给生物反应器，经由出料口304从生物反应器移出。为了模拟正常体温以进行最优化的细胞和组织培养，生物反应器202，泵单元122和加热混合室234通过热电元件236的操作维持在接近37℃。对本领域人员显而易见的是，可采用备用的热调节设备，以获得期望的用于组织工程模块118的热效应。
图11所示为基本流体流动示意图的变更图，其中流体流动控制阀为多个泵元件122所取代。这种构造增强了操作冗余，并减少了组件数。这种系统的操作要求任何休止泵单元都应防止无调节的贯通流动，因为出现这种情况会破坏对流体的控制性运送。
图12a-12d图解了各种生物反应器构造，以及用于增殖和分化步骤的基片和支架的备用格式，所述增殖和分化步骤包含于组织工程系统的操作中。图12a所示为一系列可互换的生物反应器设计，所述设计解决不同的生物加工方案。I型方案所指为生物反应器202内的基本单独室300，所述室300容纳有增殖支架或基片310，或分化支架或基片(图中未示出)，并理想地应适合于增殖或分化。细胞可人工接种于支架310上，或经由组织工程模块的流体通道进行自动化运送。
II型方案包含多室生物反应器，所述生物反应器为支架310(或基片)和可植入分化支架312的使用提供准备，所述支架310用于细胞群体的增殖，所述可植入支架312促进组织结构的形成。培养/增殖室300经由漏斗314与分化/组织形成室306连接。漏斗用作将从增殖支架310释放的细胞引导至可植入分化支架312内。生物反应器内几个位置上的过滤器316用作调控能自由地从一个室通过进入下一室的细胞或细胞聚集体的尺寸。过滤器316a存在于增殖支架上游，目的在于调节进入的细胞群体，所述细胞群体用于细胞扩增步骤。另一过滤器316b存在于分化支架的上游，仍是控制进入该步骤组织工程工序的细胞群体。另外，在出料口304上面还有一个过滤器316c，用于防止细胞在操作过程中从分化/组织形成室中损失，所述操作过程包含通过生物反应器的流体传递。过滤器316可以是滤膜或筛孔或本领域人员熟知的相似类型的过滤材料。
III型方案将组织消化与随后的增殖、分化和组织结构形成相结合。在该方案中，组织活检320被载入生物反应器202内存在的消化室322内。通过将消化酶从一个流体贮罐208运送至生物反应器内，而出现组织活检的消化，所述流体贮罐208存在于组织工程模块上。在重力沉降和/或流体穿流培养/增殖室300的影响下，分离细胞离开消化室322并随后聚集于增殖支架310上。通过消化室322和培养/增殖室300之间流动通道中存在的滤膜/筛孔316a，组织聚集体被阻止转运出消化室322。增殖后，细胞被释放并经由细胞漏斗314传递至可植入的分化支架312。可植入分化支架312的上游316b和下游316c也存在膜/筛孔滤器，以保证将合适的细胞群体接种至支架上，以及在流体传递操作中不会使细胞不经意地流失至废弃物中。
在前述几种方案中，可存在各种构造的增殖基片310或支架，例如图12b中所示。例如，某一个构造是带有相对平均孔梯度的多孔支架310a。孔梯度支架310b是带有孔梯度的多孔支架，其中的孔径随细胞穿行支架而减小。这就在细胞接种过程完成时，促进了细胞在整个支架中更均匀的分布。可采用带有相反取向的孔梯度支架310c。作为替代，可采用纤维过滤支架310d，所述支架是具有纤维基质特点的有机化合物，例如胶原。也可以使用微载体(例如CytodexTM)的包容悬浮液(contained suspension)作为增殖基片。而且，生物反应器可带有为CPU128所支持的光学探头324(以与多孔支架310a连接示出)，使得能够对增殖支架内发生的细胞接种过程进行检查，以及进一步评价增殖事件，特别是朝向获得汇合细胞层的进程。
与增殖一样，存在各种可植入的分化支架312，所述分化支架可以不同构造和不同材料(即无机的基于矿物的支架例如磷酸钙，有机生物高分子支架例如胶原，等等)形成，并于组织工程过程中被采用。图12c所示为多区域分化/组织形成室306，含有多达三个可植入分化支架312，所有可植入分化支架312可同时进行组织结构形成。这使得可进行不同尺寸可植入组织的制备，以及使得可采用备用的可植入分化支架以评估组织产量并使之最大化。例如，支架312a是多孔网状结构，由诸如SkeliteTM的骨生物材料形成，用于骨和软骨的应用中，所述应用中的组织结构在骨内需要硬质组织锚定物。支架312a可通过支架膜/筛孔326的使用而进一步增强，所述支架膜/筛孔326环绕植入物从而产生膜环绕的支架312b，使得细胞接种过程中的细胞流失出支架312a减至最小，从而使组织工程过程更有效率。所述膜可优选地仅部分环绕支架或者作为替代，更充分地环绕支架。由于支架膜/筛孔326的主要目的是容纳可植入分化支架312上或内部的细胞，如本领域人员所了解，对支架膜/筛孔326属性的仔细选择既可允许也可限制特定分子实体的通行，所述特定分子实体对细胞水平上的组织工程过程具有显著影响。
进一步实施方案是梯度孔隙率和膜环绕的支架312c，它结合了支架膜/筛孔326和孔梯度的优点。对梯度进行配置，以有意引起细胞聚集于顶面，而只有极微量细胞繁殖入支架内。一定程度的表面孔隙率认为对于组织稳定性以及营养物经由支架表面供应至发育中的组织是有利的。该方法导致带有不同分层区域的双极组织结构的发育。顶部区域基本上由新生组织构成。底部区域基本上不含细胞或组织，只残存开放的多孔支架。中间界面区域代表了开放支架和全新组织层之间的结构性稳定过渡。这种双极组织结构对于关节软骨中病灶缺陷的修复是理想的，因为顶层是为宿主软骨的侧面整合提供准备的组织工程软骨，而底层则为软骨下骨头的侧面和轴向整合提供准备。在手术植入过程中，通过将骨髓施用于开放支架，可进一步增强底层与周围软骨下骨头的整合。在软骨修复应用中，重要的一点是基于矿物的支架不会延伸至关节表面，因为这可能危害关节功能。相应地，在新生软骨的顶部区域中可采用继发性非矿物支架(图中未示出)，以辅助形成足够尺寸的组织结构，用以治疗大块软骨损伤(即直径达到10cm2且厚度2-3mm)。而且，可对继发性支架进行定型，以产生带有关节表面轮廓的具一定形状的结构，所述表面轮廓与植入位点上存在的特定解剖学特性匹配更接近。用于继发性支架的候选材料有合成生物高分子(如PGA，PLA)或天然生物高分子(如藻酸盐，琼脂糖，纤维蛋白，胶原，透明质酸)。这些继发性支架可以是水凝胶或预先成型的三维支架的形态。
组织工程系统中可存在用于双极组织结构制备的备用方法。可植入分化支架312可用可生物再吸收聚合物进行部分浸润，所述可生物再吸收聚合物限制细胞接种至支架的特定区域。这就在组织结构的制备过程中产生了新组织形成的优选区域。植入后，聚合物被吸收，从而在多孔支架内留下空隙，所述空隙促进了宿主组织内的锚定。进一步的构造包含带有相对开放孔隙度的可植入支架，其位置远离分化/组织形成室的出口。在细胞接种过程中，这种开放空间可为迁移穿越开放支架的细胞的聚集提供准备。由于细胞在分化/组织形成室内累积，开放空间和一部分支架均为细胞所浸润，从而产生新组织形成的优选区域。所产生的组织结构含有不带支架的新生组织区域，同时含新生组织和支架的中间过渡区域或界面区域，以及开放的且基本不带细胞或组织的多孔支架区域。
图12d所示为生物反应器监视图，其中传感器216(即温度、pH、溶解气体等)整合入生物反应器202的盖204，以给CPU128提供组织工程过程进度的反馈。另外，可采用CCD摄像仪330来监视增殖支架310(或基片)的光学属性，以搜集即将发生的汇合迹象(例如作为细胞密度函数的光学密度和/或光散射)，使得能进行定时的细胞释放，从而使增殖步骤的细胞产量最大化。
图13更好的展示了生物反应器202内的流动通道和流体循环。所示生物反应器202带有进料口302，出料口304和内部空穴，所述内部空穴限定了基本室300。流体经由进料口302从流体流动板220流入生物反应器202，而通过出料口304流出。生物反应器盖204连接至生物反应器202。可采用各种不同的装配硬件使生物反应器盖204和生物反应器202固定在一起。室300可设计成容纳一个或多个基片或支架310。而且，生物反应器202可细分成能进行组织消化、增殖、分化和组织形成步骤的单独室。每一室可装配有进料口和出料口，所述端口经由流动控制阀而得以独立控制，为了更好地控制组织工程工序。在CPU128的控制信号的基础上，通过一个或多个流动控制阀214以及泵单元122的启动而实现流体循环。根据特定的被启动阀，泵单元122的操作将流体从一个流体贮罐208输入生物反应器202，或使生物反应器内的流体进行再循环。再循环对于需要稳定溶解气体浓度的生物过程是有利的，因为它使流体能够穿过促进气体交换的膜。交换的性质基于与外部条件相对的生物反应器内溶解浓度，所述外部条件为ECU136所建立。所示生物反应器盖204带有取样端口332和传感器探头216，所示传感器探头216可与生物反应器的内室可操作连接。作为替代，取样端口可装备于生物反应器外壳上的其他位置。取样端口使得能将原料添加入生物反应器内，或将原料去除出生物反应器。根据需要，取样端口可为气体交换膜替代，或添加气体交换膜。
图14图解为多室生物反应器202，为了图解清楚除去了生物反应器盖204。进料口302连接至组织消化室322。组织消化室322的构造使患者活检组织能载入生物反应器内，用于随后的自动化消化以获得分离细胞。消化室内的循环通道促进了活检组织的轻微搅拌以避免产生不流动区域，所述不流动区域可潜在性地导致活检组织过度暴露于循环中的消化酶。而且，消化室的入口和/或出口可内装有孔隙率不同的滤膜/筛孔316(未示出)，从而为细胞分拣提供准备以及阻止部分消化组织聚集体的释放。生物反应器含有容纳了增殖基片或支架310的第二室300，用于接收增殖细胞。增殖支架可形成各种几何学形态，所述几何形态可同时支持二维和三维增殖，并可由各种生物相容的促进细胞增殖的材料构成，诸如磷酸钙生物材料(例如SkeliteTM)，生物高分子或天然基质(例如胶原)。从组织消化室322或经由任选的细胞接种口334运送来的细胞分散于增殖基片或支架310之上或之内并进行增殖，由此增加了用于随后的细胞分化和组织形成的细胞群体。需指出的是如果目标仅为扩增细胞群体而无需进一步分化的话，则增殖后过程即可终止。在生物反应器202基部，分化/组织形成室306内存在可植入分化支架312。和增殖支架310一样，可植入分化支架312可形成不同的几何形态，并可由各种生物相容材料构成，所述生物相容材料可加以适合选择以满足植入位点的生物学需求(例如SkeliteTM是一种用于骨骼位点的理想植入物)。
在操作中，细胞通过自动化工序从增殖基片或支架310上释放，所述自动化工序例如酶(如胰蛋白酶)的运送，以及经由冲击驱动器226(未示出)对生物反应器定时施加冲击。在生物反应器内存在的控制性流动条件下，细胞悬浮液经由细胞漏斗314迁移入可植入支架312，于是细胞停留于可植入支架312上并开始分化和组织形成工序。该工序完成后，由此生成的组织可从生物反应器移去，以用于随后的植入。本领域人员可以理解，图14生物反应器的特别实施方案仅仅是一个代表性的设计实例。通常，生物反应器在总形状、尺寸和内部构造方面可以各种方式进行装配，而对功能不会产生不利影响。例如，生物反应器上存在的气体交换膜336可以是单独的和不连续的组件，与一个或多个组织工程模块118的流体运送管210或流动板220串联连接。而且，生物反应器的室经由控制阀可彼此分开，以避免所有流体穿过所有室的必要性。需要时，室间的通道可打开，以进行流体的传递和细胞悬浮。这种变更能增加生物加工条件和工序中的柔性，其一个实例如图17所示。一种能使可植入分化支架312可控制的暴露于生物反应器内含物的备用构造是采用了梭子318，所述梭子318隔离了可植入支架，直到需要进行作为分化步骤一部分的细胞接种。为能使细胞接种，梭子318将可植入支架从生物反应器内的受保护位置移动至流体流中。所述梭子可以是各种构造，包括基于旋转的移动或采用隔离可植入支架直至需进行细胞接种的可移动载体。
图15所示为旋转生物反应器设计，所述设计采用了重力矢量的方向，以在组织工程过程不同阶段通过沉降进行细胞转运。需要指出，虽然该解了生物反应器的旋转，然而通过组织工程模块的旋转或实际上通过整个外壳102的旋转，可同样获得该技术目的。如图15所示，生物反应器202连接至旋转轴350，所述旋转轴350固定于组织工程模块118的结构脊骨200。这就提供了用于生物反应器202旋转的机构，使得在培养/增殖室300内所选定的增殖表面上，经由沉降可出现细胞接种。生物反应器的增殖表面上可任选地包被有增强增殖的生物材料(例如SkeliteTM)，或可于室300内插入专用增殖基片或支架以提供这种功能。作为消化室322用途的另一选择，在生物反应器202侧边装备有第二接种口352，使得能够进行直接的细胞接种。细胞可初始接种于相对较小的增殖表面354(图15a)上。在所耗增殖时间或检测汇合的基础上，细胞可自动被释放，生物反应器经由旋转轴350旋转使得从增殖表面354释放的细胞可沉降于表面356的增加区域上(图15b)，从而进行进一步的增殖。第二增殖步骤完成后，扩增的细胞被释放，生物反应器再次旋转使能进行可植入支架312的接种(图15c)。由此旋转轴350和相关的挠性管358使生物反应器202能按要求进行旋转，以在随后增殖阶段最大化地应用重力沉降。在这些条件满意时，以某一方式采用旋转轴使生物反应器搅拌或振摇是在本发明范围内的。
现在参看图16，可对组织工程模块118进行修改，以包括用于悬浮细胞、组织培养液和/或废弃产物的无菌取样的技术。在本实施方案中，于组织工程模块118的结构脊骨200内集成入注射器歧管400和无菌卸料口402。微镗孔管道406经由取样口332将注射器歧管400连接至生物反应器202。注射器404在歧管400处与卸料口402连接，使能进行流体样品或细胞悬浮液的收集和去除以用于随后分析，而不会危害组织工程过程的操作，整体性或无菌性。还提供了一个备用的取样技术，通过该技术可熔生物反应器取样管线408与生物反应器盖204连接。由于该管线与生物反应器的内部物理连接，并且与其内进行中的生物学事件非常接近，因而管线内含有的流体与生物反应器内存在的流体的组成基本相同。由此，通过熔化取样管线的末端即可得到生物反应器流体的代表性样品，然后将管线从组织工程模块去除以用于随后分析。本领域人员显然可看出，通过外壳102内密封组件的自动化操作，这种可熔管线可用作取样技术的基础。
图17所示为用于组织工程模块118的更复杂的流体流动示意图，其中单独的生物反应器室可提供用于消化、增殖和分化的不同需求。这些室可存在于一系列不连续生物反应器内，或结合于单个生物反应器内，所述单个生物反应器可对每一室内的条件维持单独控制。存在有容纳组织活检320的组织消化室322。存在有增殖室300，该室配置成接收来自消化室322的细胞，并能进行增殖基片或支架310的接种。还存在分化/组织形成室306，该室配置成接收来自增殖室300的扩增细胞数量，并能进行可植入支架312的接种。
组织工程试剂(即培养基，酶溶液，洗涤溶液等)载入流体贮罐208a-208e内。废弃产物收集于流体贮罐208f内，该贮罐可采用进入孔218f进行手动抽吸，以用于取样目的。其他流体贮罐可构成流体贮罐系统206的一部分，并可按需要容纳于组织工程模块上，以用于不同的组织工程过程。流体在流体泵122a-122k，流动控制阀214a-214c，单向流动阀410a-410c(即流体流动检查阀)的操作指引下流穿系统。而且，根据来自中央微处理器的控制输入，泵212a-212k装配成可作为有源泵或无源阀(开/关)进行操作。过滤器316a-316d用以在组织工程过程的洗涤和过渡阶段选择性地控制系统内细胞悬浮液的运动，以及限制细胞聚集体的通行。培养基中溶解气体水平经由内嵌的气体交换膜282a和282b而得以维持。存在任选的注射器404a和404b，以使能经由无菌卸料口402a和402b进行细胞收集和培养基取样。
在操作中，组织活检320插入过滤器316a和316b之间的组织消化室322。将含有酶的消化培养基从流体贮藏系统206泵入组织消化室322，以开始消化过程。通过混合隔板轻微搅拌消化室内消化培养基可增强消化作用，以使试剂最大化地暴露于活检组织。消化培养基可经由泵122g进行连续或周期性再循环。再循环期间，流体流动被逆重力矢量地引导至消化室底部，以悬浮和跌落(tumble)组织活检，从而使消化过程的效力最大化。过滤器316a阻止了细胞和细胞聚集体迁移入流体通道。再循环通道包括内嵌的气体交换膜282a，所述气体交换膜282a为消化培养基内溶解气体水平的一致性提供准备。将含于流体贮藏系统206内的洗涤溶液引入消化室322底部，可冲洗消化室并有效地将消化培养基从分离细胞和任何残余细胞聚集体洗去。单个或多个洗涤工序后，采用逆向流动将细胞悬浮液转运至增殖室300或任选的注射器404a，以用于外部检查或分析。通过过滤器316b阻止了部分消化组织转运出消化室，所述过滤器316b的大小做成使分离细胞通过，而使细胞聚集体截留。
从活检消化过程产生的细胞或经由细胞悬浮液直接加载得到的细胞，通过流体流动和/或重力沉降接种至增殖室300内存在的增殖基片或支架310上。经过一个静止期使细胞附着于增殖基片或支架310(用于附着依赖细胞的实例)，将增殖培养基从流体贮藏系统206引入增殖室300内。在增殖阶段的特定时间，该培养基周期性地为来自贮藏系统206的新鲜增殖培养基所替换。在培养基替换步骤之间，在泵122g，122h和122i加上控制阀214a和214b的控制之下，增殖室内的流体连续地或周期性地再循环。流体运送和再循环通道包括内嵌的气体交换膜282a，所述气体交换膜282a为增殖培养基内溶解气体水平的一致性提供准备。在培养基替换步骤过程中，来自流体贮藏系统206的新鲜培养基的供给通过经由泵122f去除流体至废弃物贮罐208f而得以平衡。由此，通过周期性的培养基替换步骤和控制性再循环的结合，组织工程系统在整个增殖过程中保持了增殖室内的最优条件。
一旦细胞培养物接近汇合，增殖室300内的培养基即通过泵122f排空至废物贮罐208f。在该过程中，流体从增殖室的去除为进入的无菌空气或从流体贮藏系统206进入的PBS洗涤溶液所平衡，所述无菌空气经由增殖室(未示出)上的无菌过滤口运送。细胞通过两个连续的洗涤步骤用PBS洗涤溶液进行广泛洗涤，以去除残留的增殖培养基。随后通过自动化工序，例如酶(如胰蛋白酶)的运送以及经由冲击驱动器定时给生物反应器施加的冲击，细胞从增殖基片或支架310上释放。细胞释放后，可通过运送含血清的培养基来停止酶法过程，所述血清抑制了酶活性。为了收集细胞用于最后接种至分化/组织形成室306内的可植入支架312上，将细胞悬浮液从增殖室300传递至过滤器316c。在泵122f控制下，过滤器316c阻止了细胞的通行，但却允许培养基经由阀214b继续通行至废物贮罐208f。然后通过施加逆向流动，被收集的细胞从过滤器316释放并运送至分化/组织形成室306或任选的注射器404b，用于外部检查或分析。
经由泵122j，通过将细胞从过滤器316c传递至支架顶面，可实现细胞在可植入分化支架312c上的接种。通过任选的采用支架膜或筛孔326，可使细胞从支架的流失减至最小。细胞接种后，可通过泵122k的操作，经二次输入将新鲜分化培养基引入分化/组织形成室。该二次输入位于远离接种有细胞的可植入支架的区域，以使损害性剪切应力的潜在性减至最小，所述剪切应力可破坏细胞聚集体的形成。在分化阶段过程的特定时间，分化培养基周期性地为来自贮藏系统206的新鲜分化培养基所替代。在培养基替换步骤之间，在泵122j或122k加上控制阀214b的控制之下，分化/组织形成室内的流体连续地或周期性地再循环。用于新鲜分化培养基和再循环培养基运送的通道包括内嵌的气体交换膜282b，所述气体交换膜282b为分化培养基内溶解气体水平的一致性提供准备。在培养基替换步骤过程中，来自流体贮藏系统206的新鲜培养基的供给通过经由泵122f去除流体至废物贮罐208f而得以平衡。在对组织结构成功形成必要的阶段，对分化/组织形成室内的环境条件进行监视和控制，组织结构成功形成时，打开生物反应器的分化/组织形成室并回收结构用于随后的临床或研究用途。
图18所示为图17流体流动示意图的变种，其中增殖室300内的增殖支架或基片310替换为具有相对较大表面积的平面增殖基片。基片的取向使得重力下的细胞沉降能将细胞均匀分布于增殖表面上。假若增殖室能维持正确的取向，则增殖基片的形态可以是刚性聚合物培养板或挠性壁容器。
图19所示为含有组织消化室322的组织消化生物反应器500，所述组织消化室322带有合适尺寸，以容纳一个或多个诸如组织活检320的组织样品。生物反应器500由四个主要组件组成基本构成组织消化室322的生物反应器基部502，可移除的生物反应器盖504，端口过滤器316b，以及任选的端口过滤器316a(未示出)。
生物反应器盖504为带有任选的端口过滤器316a(未示出)的培养基端口506以及空气出料口508提供准备。生物反应器底部500容纳有过滤器316b，所述过滤器316b允许分离细胞通过并经由培养基端口510移出组织消化室322，而组织聚合体和活检组织碎片则被截留。
组织活检320插入后，在自动控制下，通过端口506或端口510，生物反应器充满酶溶液。酶溶液加入至组织消化室322，通过经由端口508的空气排出而得以平衡。在连续或间歇的酶溶液再循环下发生活检组织消化，由此保持释放细胞处于悬浮，并使活检组织最大化地暴露于酶试剂。再循环过程中，酶溶液通过端口510进入生物反应器，经由端口506离开。这就产生与重力矢量相反方向的流体流动通道，从而使活检组织被悬浮和跌落，以使酶试剂的效力最大化。通过混合隔板(未示出)轻微搅拌消化室内消化培养基可增强消化作用。端口508在任一再循环步骤中可关闭，因为存在于流体流动系统中的空气气泡被捕获于生物反应器的上半部分，在端口506的入口512之上。消化工序完成后，通过端口506施加空气或培养基的逆向流动，将分离细胞通过端口510传递至增殖室或细胞收集容器。
图20所示为增殖室300提供准备的增殖生物反应器520。增殖室的底部由适合用于细胞附着和生长的增殖基片310组成。为了调节或维持培养基内溶解气体水平，可于增殖室顶面集成入气体可透过的膜(未示出)，以使能进行诸如O2和CO2的气体转运。分离壁522将增殖室内部空间分成通道系统，从而迫使培养基沿着预定通道从进料口524到出料口526运送。
增殖生物反应器的设计具有一些重要的操作特征。细胞悬浮液通过通道系统的注入可得到相对均一的细胞接种。而且，通道构造保证了培养基流动很好地分布于整个增殖表面上，由此减少了潜在的低流动区域，所述低流动区域由于减少了营养供给或废弃产物的去除，可能危害局部细胞活力。增殖工序完成后，合适酶溶液通过通道系统的连续或间歇再循环，由于酶反应的作用和由流体流动产生的低水平剪切应力，诱导出均一的细胞分离。相应地，无需机械振摇或增殖室的旋转即可完成细胞收获。
图21所示为设计用以促进细胞分化和随后的组织结构形成的分化生物反应器530。该生物反应器由四个主要组件组成基本构成分化/组织形成室306的生物反应器基部532，可移除的生物反应器盖534，可透过的膜管326，以及分化支架312。可透过膜管326紧密环绕网状支架以在支架上方形成组织生长隔室536。根据支架的孔尺寸以及膜管内支架的布置，组织生长隔室可在支架内延伸。膜管也固定于端口542的入口540上，从而使膜真正位于分化/组织形成室306内的中心。这就把生物反应器分成两个独立隔室，一个细胞和组织生长隔室536以及一个外部的不含细胞的培养基隔室538，两隔室都在整个分化/组织形成室306内。膜管的孔尺寸的选择基础是细胞不透过，而培养基内的营养物、废弃产物、生长因子等可透过。如果需要的话，膜孔尺寸可按某一方式进行选择，以阻止具有特定分子量的分子通过膜。
生物反应器盖534带有两个空气出料口542和544，以及一个培养基进料口546。生物反应器基部532进一步容纳有两个端口548和550。进料口546对于细胞悬浮液载入组织生长隔室536和用培养基灌注生成的组织结构是必需的。在细胞悬浮液运送至空组织生长隔室内过程中，被捕获的空气允许通过端口542排出。以类似方式，外部不含细胞的隔室538经由端口548或端口550装载培养基，而被捕获的空气经由端口544排出。
分化生物反应器的设计使得能通过将培养基运送至端口546，或者间接地将培养基经由端口548供给至周围的不含细胞的隔室538，来进行组织结构的直接灌注。典型地，在灌注过程中端口542和544关闭，端口550用作为培养基出口；然而，在特定组织工程需求的基础上，可采用各种备用的培养基供给方案。培养基灌注策略的一个重要方面是构成组织生长隔室一部分的可透过膜326，它使得新鲜培养基可透过组织生长隔室，而没有任何细胞从支架流失。而且，营养物几乎从所有方向供给细胞，没有来自任何不透过的生物反应器壁的限制。
图22所示为流体流动示意图的进一步实施方案，其中可采用图19-21中的生物反应器。存在有组织消化室322用以容纳组织活检。存在有增殖室300，装配成用以接收来自消化室322的细胞并能进行增殖基片的接种。气泡捕获器560去除从输入管线到增殖室的空气气泡，由此防止这些气泡进入增殖室300并潜在性地危害局部细胞群体。贮罐562用以接收来自增殖室300的扩增细胞数量，并在错流过滤模块564辅助下进行的细胞洗涤和细胞浓缩工序过程中，用作为临时性支持容器(holding container)。还存在分化/组织形成室306，装配成用以接收洗涤和浓缩步骤后来自贮罐562的细胞，并能进行可植入支架312的接种。
组织工程试剂(即培养基、酶溶液、洗涤溶液等)储藏于流体贮罐208a-208e。废弃产物收集于流体贮罐208f。根据来自中央微处理器的控制输入，通过流体泵122a和122b，流动控制阀214a-214v的操作指引，流体得以流穿系统。在操作过程中，空气过滤器566a-566c使空气按需要传递进入或传递出系统，而不会危害系统的无菌性。而且，内嵌的气体交换膜(未示出)可装配于流体流动通道内的多种位置，以方便培养基内溶解气体的控制。
操作中，将组织活检320插入组织消化室322。含有酶的消化培养基从流体贮罐208泵入组织消化室322，以开始消化过程。消化培养基可经由泵122a连续或周期性地再循环，由此保持释放细胞处于悬浮状态，并使试剂最大化地暴露于活检组织。增殖培养基从一个流体贮罐208引入消化室322顶部，从而将细胞悬浮液传递至增殖室300，并同时将增殖室300内的酶溶液稀释成细胞增殖可承受的浓度。通过端口过滤器316b阻止了部分消化组织传递出消化室，所述端口过滤器316b的大小做成使分离细胞通行，而使细胞聚集体截留。通过经由阀214h，214j，214I和泵122a的启动再循环细胞悬浮液，或通过增殖生物反应器轻微振摇的自动化施用，使从活检消化过程产生的细胞均一散布于整个增殖室300。
经过一段静止期使细胞附着于增殖基片后，增殖培养基周期性地或连续地为来自一个流体贮罐208的新鲜增殖培养基所替换。在培养基替换步骤过程中，来自流体贮藏系统208的新鲜培养基的供给通过流体经由阀214i去除入废弃物贮罐208f而得以平衡。
一旦细胞培养物接近汇合，增殖室300内的培养基即排空入废弃物贮罐208f。在该过程中，来自增殖室的流体的去除通过进入的无菌空气或通过进入的PBS洗涤溶液得以平衡，所述无菌空气经由无菌过滤器566a进行运送，所述PBS洗涤溶液来自一个流体贮罐208。
随后通过一个自动化工序，例如酶(例如胰蛋白酶)的运送以及细胞悬浮液的定时再循环，或经由冲击驱动器定时给生物反应器施加冲击或搅拌，使细胞从增殖基片释放。为了去除酶，以及收集相对较小培养基体积的细胞，以用于随后传递至细胞分化室306，将细胞悬浮液从增殖室300传递至贮罐562。然后经由阀214m，214j，214q和泵122a，通过错流过滤模块564使细胞悬浮液持续再循环。错流过滤模块564中的膜可防止细胞损失，但允许一定百分比的培养基(渗透)经由阀214o去除至废物贮罐208f。其结果是悬浮液体积的减少和/或存在的任何酶的稀释，前提是渗透物的去除通过来自一个流体贮罐208的新鲜培养基的供给而得以补偿。持续流动减少了细胞被捕获入错流模块564的膜内的可能性。
通过将来自贮罐562的洗涤后细胞经由阀214m，214j，214p和泵122a传递至支架顶面，可完成细胞于可植入分化支架312上的接种。通过任选采用支架膜或筛孔326可使细胞从支架的流失减至最小。细胞接种后，通过泵122b的操作将新鲜分化培养基引入分化/组织形成室306。分化培养基周期性或持续性地被来自贮藏系统的新鲜分化培养基所替换。在培养基替换步骤过程中，来自一个流体贮罐208的新鲜培养基的供给通过流体经由阀214u去除入废物贮罐208f而得以平衡。在培养基替换步骤之间，在泵122b，阀214t和阀214r(对通过组织结构进行灌注而言)或阀214s(对运送出支架膜326而言)的控制之下，分化/组织形成室内的流体持续或周期性地再循环。该支架膜外的第二流体运送通道位置处于远离接种有细胞的可植入支架的区域，从而使破坏性剪切应力的可能减至最小，所述破坏性剪切应力可能危害细胞聚集体的形成。与前述流体流动示意图实施方案一样，在组织结构成功形成的必要阶段，分化/组织形成室内的环境条件需进行监视和控制，在组织结构形成时，打开生物反应器的分化/组织形成室，并回收结构用于随后的临床或研究用途。
图23所示为本发明的一个实施方案，其中如此处描述的组织工程模块包含三个生物反应器。图23例解了如下生物反应器的结合使用带有内部组织消化室322的图19的组织消化生物反应器，带有增殖室300的图20的增殖生物反应器，以及带有分化室306的图21的分化生物反应器。这些生物反应器可操作连接于组织工程模块上，从而为涉及组织消化、细胞增殖、细胞分化和组织形成工序的自动化步骤提供准备。
本领域人员可以理解，自动化组织工程系统可包含一个或多个生物反应器，所述生物反应器通过结构支持物或通过同等手段支托于外壳上。当含有两个或更多个生物反应器时，生物反应器可进行有效连接，或作为替代地，可独自操作和/或可进行协作操作。而且，每一生物反应器可含有不同的内部室或相同类型的室。在进一步实施方案中，室和/或生物反应器可操作连接，从而为室和/或生物反应器之间的流体、细胞和/或组织的交换提供准备。
本发明的自动化组织工程系统很容易制备备用。以下工序是用于软骨植入物制备的典型实施例，所述实施例基于本发明组织工程系统的使用，用于关节软骨病灶缺陷的修复。该应用需要组织消化、细胞增殖和细胞分化/组织形成阶段。该组织工程过程的三个阶段可通过带有多室的单个生物反应器完成，或通过三个单独和不连续的生物反应器完成，如图17，18和22所示。
开始组织工程工序之前，经由贮罐注射口212，在组织工程模块中将如下试剂组合物载入贮罐208a至208e内。试剂A用于消化源自小块人体关节软骨活检组织的软骨细胞。试剂B，D和E用于细胞增殖。试剂C用于分化和组织结构形成。
·试剂A-消化培养基DMEM/F-12，5％FCS或自身血清，1μg/mL胰岛素，50μg/mL维生素C，100IU/100μg/mL Pen/Strep，2.5％Hepes缓冲液，0.1％(1mg/ml)链霉蛋白酶和0.025％(0.25mg/ml)胶原酶，pH7.4·试剂 B-增殖培养基DMEM/F-12，10％FCS或自身血清，10μg/mL维生素C，100IU/100μg/mL Pen/Strep，2.5％Hepes缓冲液，pH7.4·试剂 C-分化培养基DMEM/F-12，10％FCS或自身血清，1μg/mL胰岛素，50μg/mL维生素C，100IU/100μg/mL Pen/Strep，2.5％Hepes缓冲液，pH7.4·试剂 D-PBS洗涤溶液137mM NaCl，3.7mM KCl，8mMNa2HPO4*2H2O，1.5mM KH2PO4的水，pH7.4·试剂E-细胞释放溶液1×胰蛋白酶溶液当4℃下将上述试剂贮存于系统外壳内的组织工程模块上长达几个星期的时间，名义上讲是稳定的。酶可冻干储存于组织工程模块内，使用时进行水合。这就使得可对酶进行定制，以适用于特定的组织工程应用。
通过关节镜检查手术，从内侧股骨髁上部的非承重区域得到人软骨活检组织(100-500mg)。将活检组织载入消化室前，对活检组织称重并记录质量，随后数据输入用于基本单元的编程工序。确定质量后，将活检组织置于消化室内，关闭生物反应器，准备将组织工程模块插入组织工程系统的基本单元。一旦安装好组织工程模块，即经由用户界面，根据活检组织尺寸和所需的组织工程工序对基本单元的CPU进行编程。
程序性自动化工序开始后，通过所需流动阀的开启和流体传送泵的操作，将试剂A注入生物反应器的消化室，从而开始活检组织的链霉蛋白酶/胶原酶消化作用。在试剂A的持续或间歇再循环作用以保持细胞处于悬浮及使试剂最大化暴露于活检组织的条件下，消化作用在37℃下进行16小时以上。然后可用试剂D进行两个连续的洗涤步骤。在该消化工序末尾，每100mg活检组织得到接近200,000-500,000个细胞。
此时，经由取样口可回收消化细胞的样品，以用于评测细胞数量和成活力。该生物学评测典型地在系统外用台盼蓝染色后通过血细胞计数器进行评测。
在基本单元的自动化控制之下，分离细胞被运送至生物反应器的增殖室内存在的增殖基片或支架上，以建立2000细胞/cm2到15000细胞/cm2之间的细胞接种密度。为了实现继续增殖至汇合，根据预编程的流动图供给试剂B，所述试剂B来自组织工程模块上的贮罐。对培养基的温度和pH各自进行监视，以检测其对37℃和pH7.4的偏离。另外，通过检测作为时间函数的代谢周转率(例如pH，O2，CO2，乳酸和葡萄糖消耗)，间接地评测细胞增殖状态。通过连接至增殖探头的CCD摄像仪的光学监视，可进一步地验证汇合水平，所述增殖探头嵌入增殖室内。一旦由经验或通过基于传感器的监视确定汇合即将发生，即用试剂D通过两个连续洗涤步骤对细胞进行广泛洗涤，以去除所有培养基。
将来自组织工程模块内的贮罐的试剂E传递至增殖室内，开始繁殖细胞从增殖基片或支架的分离。该胰蛋白酶溶液在生物反应器内存在5分钟，于是通过试剂B的自动加入终止反应，所述试剂B含有抑制酶活性的FCS或自身血清。通过经由冲击驱动器给生物反应器施加低频率冲击，或者通过胰蛋白酶溶液的再循环，可进一步增强细胞从增殖基片或支架的释放。细胞一旦释放，即进行细胞洗涤和过滤步骤，从而去除胰蛋白酶并浓缩细胞悬浮液，以用于随后传递至分化/组织生成生物反应器内存在的支架上。
双极构造对于该应用是理想的，因为这为关节表面的软骨层提供了准备，所述软骨层连接至由诸如SkeliteTM的骨生物材料构成的多孔支架层，用于与软骨下骨头整合。双极结构可通过几个备选操作之一而制备得到。形成的分化支架可带有孔密度梯度，优先在一端捕获细胞，产生高细胞浓度区域，从而促进软骨层的形成。交替地，支架可先在一端包被纤维蛋白凝胶，以消除该区域的细胞附着和软骨基质形成。对任一种方法，通过任选采用环绕膜或筛孔可使细胞从支架的流失减至最小。细胞运送的流动速率较低，以保证流体剪切不会损伤增殖的细胞群体。细胞接种步骤完成后，停止流体流穿分化/组织形成室，使能形成细胞聚集体，因为已知这对成功分化是至关重要的。该重要步骤之后，在组织形成和成熟所必需的整个阶段灌注试剂C，以最优化地供给细胞营养物并去除废弃产物。该培养阶段后，细胞将产生胞外基质，所述胞外基质与天然人体关节软骨基本相同。所生成组织的属性可通过独立的外部生化方法进行确认，所述生化方法例如经由SDS-PAGE和基因表达进行的胶原分类。作为该过程的最后步骤，组织工程系统通过用户界面告知工序完成，可去除组织工程模块以收获植入物。可将组织工程模块或可分离形式的生物反应器转运至手术室，从而在无菌环境下移除生物反应器盖，并回收植入物用于手术使用。
需要指出的是，本发明系统并不限于特定类型的细胞或组织。例如，可制备骨骼植入物，用于骨头缺陷的重建。在该应用中，骨髓可用作为组织工程过程所需的原代和/或前体细胞的来源。相应地，无需进行组织消化；因此，生物反应器类型只需支持增殖和分化。根据可利用的细胞群体和植入物的所需尺寸，甚至连增殖都可以不需要。这种情况下，生物反应器的配置只涉及单个细胞分化阶段和进行中的组织形成。最终组织结构包含可植入支架，所述可植入支架可由诸如SkeliteTM的骨生物材料构成，同时活性骨细胞填衬支架的开孔以及有效敷设新矿化基质(骨样)，这种植入物可在植入位点很快整合，由此加快了恢复过程。
作为本系统适应性的进一步实施例，采用培养扩增的内皮细胞可制备组织工程血管，所述培养扩增的内皮细胞于最终分化阶段接种至管状几何形状的挠性支架上。
相比较于现有技术的方法和系统，本发明的集成组织工程系统具有一些有点。特别地，该设备的交钥匙操作(turnkey operation)使临床中在自动化控制下可进行复杂的组织工程操作，由此消除了将细胞转运至一体式设施用于生物学加工的必要。本系统使用简便，避免了现有的耗时和昂贵的人体组织培养操作，所述人体组织培养操作常导致植入物污染和失败。组织工程模块和相关的子系统成套装置可按待培养的细胞或组织类型进行定制，并可用任何合适的生物相容和灭菌耐受性材料进行制造。整个组织工程模块或其特定组件均可替换，并且认为是可以置换的。组织工程模块可以单独用途的无菌封装进行提供，由此简化了临床设置中的系统安装和操作。
本领域人员可以理解，本发明的组织工程模块和设备可按各种尺寸、形状和取向进行制造。设备可制造成以垂直或水平格式整合入单个组织工程模块或多个模块。相应地，可按与用于组织工程设备的所选立体格式相对应的方式制造子部件。由此，可在单个设备内同时实施不同类型的组织工程，每一组织工程工序可在单独进行自动化监视和控制。在远程计算机控制之下，使多个自动化组织工程系统运行以及网络化也在本发明的范围之内。
虽然此处详细描述了本发明优选实施方案，但本领域技术人员可以理解，可对实施方案进行变换，而并不背离本发明主旨或所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种自动化组织工程系统，含有-外壳；-至少一个为所述外壳支托的生物反应器，所述生物反应器促进了生理细胞功能和/或源自细胞和/或组织的一种或多种组织结构的产生；-为所述外壳支托的流体安全系统，并与所述生物反应器进行流体连通；-一个或多个与一个或多个所述外壳、生物反应器或流体安全系统相关联的传感器，用于监视涉及所述生理细胞功能和/或组织结构产生的参数；以及-与一个或多个所述传感器连接的微处理器。
2.权利要求1的系统，其中所述生物反应器含有-生物反应器外壳；-用于培养基流动的一个或多个进料口和一个或多个出料口；以及-至少一个限定于所述生物反应器外壳内的室，用于接收各种细胞和/或组织。
3.权利要求2的系统，其中所述生物反应器外壳含有盖子，所述一个或多个进料口和出料口装配于所述生物反应器外壳内和/或所述盖子内。
4.权利要求1、2或3的系统，其中所述室选自组织消化室，培养/增殖室，分化/组织形成室及其组合。
5.权利要求2、3或4的系统，其中生物反应器内装备的两个或多个室可操作连接。
6.权利要求2、3、4或5的系统，其中所述室内装有一个或多个基片和/或支架。
7.权利要求6的系统，其中所述支架选自多孔支架、带有梯度孔隙率的多孔支架、多孔网状支架、纤维支架、膜环绕支架及其组合。
8.权利要求7的系统，其中所述支架选自天然生物陶瓷、合成生物陶瓷、天然生物高分子、合成生物高分子、可植入生物陶瓷、可植入生物高分子及其混合物。
9.权利要求8的系统，其中所述材料是绝缘的生物可再吸收生物材料化合物，含有钙、氧和磷，其中至少一种所述元素的一部分为离子半径约0.1-0.6埃的元素所取代。
10.权利要求6的系统，其中所述基片是微载体的包容悬浮液。
11.权利要求2-10任一项的系统，其中所述室含有多个区域。
12.权利要求11的系统，其中所述多个室每一个均可容纳支架和/或基片。
13.权利要求1-12任一项的系统，其中两个或多个生物反应器可操作连接。
14.权利要求5-13任一项的系统，其中所述两个或多个室和/或生物反应器可独立操作和/或可协力操作。
15.权利要求5-14任一项的系统，其中所述室和/或生物反应器可操作连接，从而为所述室和/或所述生物反应器之间的流体、细胞和/或组织的交换提供准备。
16.权利要求15的系统，其中所述室和/或生物反应器经由通道、管道、连接器、阀、泵、过滤器、流体进入孔、内嵌的气体交换膜、内嵌的传感器和/或分离壁内空隙进行连接。
17.权利要求2的系统，其中所述生物反应器进一步含有与一个或多个所述室有效连接的取样口。
18.权利要求1-17任一项的系统，其中所述生物反应器经由所述进料口和所述出料口可移除地容纳有所述流体安全系统。
19.权利要求1-18任一项的系统，其中所述生物反应器和所述流体安全系统通过操作连接至固定于所述外壳的结构支持物上。
20.权利要求1-18任一项的系统，其中所述生物反应器和所述流体安全系统通过操作连接至可移除地容纳于所述外壳内的结构支持物上。
21.权利要求1-20任一项的系统，其中所述流体安全系统进一步含有一个或多个流动控制阀，以及与所述生物反应器和流体安全系统可操作连接的一个或多个泵单元。
22.权利要求1-21任一项的系统，其中所述系统进一步含有另外的微处理器和/或逻辑控制器，其中对所述微处理器和/或逻辑控制器进行编程，以便利、监视和控制所述至少一个生物反应器中不同方面的组织工程。
23.权利要求1-22任一项的系统，其中所述生物反应器提供了用于所述生理细胞功能和/或组织结构产生的环境，所述功能所自组织活检储存、组织活检消化、细胞分拣、细胞洗涤、细胞浓缩、细胞接种、细胞增殖、细胞分化、细胞储存、细胞转运、组织形成、植入物形成、可植入组织的储存，可植入组织的转运及其组合。
23.权利要求22的系统，其中所述细胞和组织选自骨、软骨、相关的骨和软骨前体细胞及其组合。
24.权利要求22的系统，其中所述细胞选自胚胎干细胞，成人干细胞，成骨细胞，前成骨细胞，软骨细胞，前软骨细胞，髓核细胞，骨骼细胞，源自骨、骨髓或血液包括干细胞在内的骨骼祖细胞，及其组合。
25.权利要求1-24任一项的系统，其中所述系统是便携的。
26.一种自动化组织工程系统，含有-外壳；-可移除地容纳于所述外壳内的至少一个组织工程模块，所述组织工程模块含有支持结构，所述支持结构固定至少一个生物反应器，所述生物反应器促进了细胞培养和/或组织工程功能，与所述生物反应器进行流体连通的流体安全系统，以及一个或多个传感器，用于监视涉及所述细胞培养和/或组织工程功能的参数；以及-布置于所述外壳内并与所述组织工程模块连接的微处理器，所述微处理器控制所述组织工程模块的操作。
27.权利要求26的组织工程系统，其中所述生物反应器含有-生物反应器外壳，带有用于培养基流动的一个或多个进料口和一个或多个出料口；以及-限定于所述生物反应器外壳内的至少一个室，用于接收细胞和/或组织以及促进所述细胞培养和组织工程功能。
28.权利要求27的组织工程系统，其中所述室选自组织消化室，培养/增殖室，分化/组织形成室及其组合。
29.权利要求28的组织工程系统，其中所述室内装有一个或多个基片和/或支架。
30.权利要求27、28或29的组织工程系统，其中所述生物反应器内装备的两个或多个室可操作连接。
31.权利要求26-30任一项的组织工程系统，其中的两个或多个生物反应器可操作连接。
32.权利要求30或31的组织工程系统，其中所述两个或多个室和/或生物反应器可独立操作和/或可协力操作。
33.权利要求26的组织工程系统，其中所述生物反应器是可分离的。
34.权利要求26-33任一项的组织工程系统，其中所述室和/或生物反应器可操作连接，从而为所述室和/或生物反应器之间的流体、细胞和/或组织的交换提供准备。
35.权利要求29的组织工程系统，其中所述支架选自多孔支架，带有梯度孔隙率的多孔支架、多孔网状支架、纤维支架、膜环绕支架及其组合。
36.权利要求35的组织工程系统，其中所述室含有多个区域，以容纳多个基片和/或支架。
37.权利要求26-36任一项的组织工程系统，其中所述生物反应器提供了用于所述细胞培养和/或组织工程功能的环境，所述功能所自组织活检储存、组织活检消化、细胞分拣、细胞洗涤、细胞浓缩、细胞接种、细胞增殖、细胞分化、细胞储存、细胞转运、组织形成、植入物形成、可植入组织的储存、可植入组织的转运及其组合。
38.权利要求37的组织工程系统，其中所述组织工程模块带有与所述流体安全系统相连接的流动控制阀，所述组织工程模块通过操作可与装配在所述外壳内的一个或多个阀传动装置、泵单元和连接器接合。
39.权利要求38的组织工程系统，其中所述连接器提供了所述组织工程模块和所述微处理器之间的电子连接，所述连接经由装备于所述外壳内的电子底板而实现。
40.权利要求26的组织工程系统，其中所述流体安全系统含有多个通过挠性管连接的挠性贮罐，用于向所述生物反应器和自所述生物反应器供给和回收流体。
41.权利要求26-40任一项的组织工程系统，其中所述外壳含有一个或多个环境传感器以及环境控制单元，用以维持一个或多个所述外壳、组织工程模块、生物反应器、流体安全系统和/或挠性贮罐内的所述环境条件。
42.权利要求41的组织工程系统，其中所述生物反应器内的所述环境条件的维持独立于所述流体安全系统。
43.权利要求41的组织工程系统，其中在所述流体安全系统内，一个或多个挠性贮罐内的所述环境条件的维持是独立的。
44.权利要求42的组织工程系统，其中进入所述生物反应器的流体的温度基本上相当于生物反应器内的流体温度。
45.权利要求42的组织工程系统，其中所述生物反应器内的所述环境条件维持在适合细胞培养和/或组织工程功能的温度下，并且所述流体安全系统或选定的挠性贮罐内的所述环境条件维持在低于适合所述细胞培养和/或组织工程功能的温度下。
46.权利要求26的组织工程系统，其中所述外壳带有至少一个用于所述组织工程模块插入的插槽，所述插入经由至少一组用于接收所述支持结构的导向装置而完成。
47.权利要求46的组织工程系统，其中所述插槽和所述导向装置垂直或水平朝向于所述外壳。
48.权利要求46或47的组织工程系统，其中所述插槽带有可移动门和锁定机构。
49.权利要求26-48任一项的组织工程系统，其中所述系统另外含有与所述微处理器操作的用户界面，所述用户界面为用户登陆，对所述微处理器的输入和/或系统状态的输出提供准备。
50.权利要求49的组织工程系统，其中所述用户界面选自显示器、触摸屏、小键盘、计算机、计算机网络、计算机数据介质设备及其组合。
51.权利要求49或50的组织工程系统，进一步含有数据系统，以进行信息的输入、输出、记录、传递和储存。
52.权利要求51的组织工程系统，进一步含有计算机和通信链接。
53.权利要求26的组织工程系统，其中所述微处理器控制所述外壳内的多组织工程模块的独立操作。
54.权利要求26的组织工程系统，其中所述微处理器执行所述细胞培养和组织工程功能的质量控制评价。
55.权利要求54的组织工程系统，其中所述质量控制评价经由用户界面以质量控制记录的方式呈现。
56.权利要求26的组织工程系统，其中所述微处理器构成所述组织工程模块的一部分。
57.权利要求26的组织工程系统，其中所述组织工程模块另外包含一个或多个与安置于所述外壳内的所述微处理器可操作连接的微处理器。
58.一种便携且可灭菌的组织工程模块，所述模块含有-固定至少一个生物反应器的结构支持物，所述生物反应器促进细胞培养和组织工程功能；-与所述生物反应器进行流体连通的流体安全系统；以及-一个或多个传感器，用于监视涉及所述细胞培养和组织工程功能的参数。
59.权利要求58的组织工程模块，其中所述生物反应器含有-生物反应器外壳，带有用于培养基流动的一个或多个进料口和一个或多个出料口；以及-限定于所述生物反应器外壳内的至少一个室，用于接受细胞和/或组织以及促进所述细胞培养和组织工程功能。
60.权利要求58的组织工程模块，其中所述室选自组织消化室，培养/增殖室，分化/组织形成室及其组合。
61.权利要求59的组织工程模块，其中所述室内装有一个或多个基片和/或支架。
62.权利要求59的组织工程模块，其中所述生物反应器内装备的两个或多个室可操作连接。
63.权利要求58-62任一项的组织工程模块，其中的两个或多个生物反应器可操作连接。
64.权利要求62或63的组织工程模块，其中所述两个或多个室和/或生物反应器可独立操作以及/或可协力操作。
65.权利要求63或64的组织工程模块，其中所述模块含有第一生物反应器，第二生物反应器和第三生物反应器，所述第一生物反应器含有组织消化室，所述第二生物反应器含有培养/增殖室，所述第三生物反应器含有分化/组织形成室，其中所述第一、第二和第三生物反应器可有效连接。
66.权利要求62-65任一项的组织工程模块，其中所述室和/或生物反应器可操作连接，从而为所述室和/或生物反应器之间的流体、细胞和/或组织的交换提供准备。
67.权利要求61的组织工程模块，其中所述支架选自多孔支架，带有梯度孔隙率的多孔支架、多孔网状支架、纤维支架、膜环绕支架及其组合。
68.权利要求59或61的组织工程模块，其中所述室含有多个区域，以容纳多个基片和/或支架。
69.权利要求58-68任一项的组织工程模块，其中所述生物反应器提供了用于所述细胞培养和/或组织工程功能的环境，所述功能所自组织活检储存、组织活检消化、细胞分拣、细胞洗涤、细胞浓缩、细胞接种、细胞增殖、细胞分化、细胞储存、细胞转运、组织形成、植入物形成、可植入组织的储存、可植入组织的转运及其组合。
70.权利要求58的组织工程模块，其中所述流体安全系统含有多个通过挠性管连接的挠性贮罐，用于向所述生物反应器和自所述生物反应器供给和回收流体。
71.权利要求70的组织工程模块，其中所述挠性贮罐包含各种构造和尺寸。
72.权利要求70的组织工程模块，其中所述挠性贮罐和/或管道装备有流体进入孔，用于来自所述流体安全系统的材料的载入或去除。
73.权利要求58的组织工程模块，其中装备的多个流体流动控制阀与流体安全系统可操作连接，从而控制与所述流体安全系统和所述生物反应器的流体流动。
74.权利要求73的组织工程模块，其中所述流体流动控制阀通过阀驱动装置开启和关闭。
75.权利要求58的组织工程模块，其中所述组织工程模块通过操作可与装备于自动化组织工程设备外壳内的一个或多个阀传动装置、泵单元和连接器接合。
76.权利要求75的组织工程模块，其中所述模块另外含有一个或多个与所述流体安全系统连接的泵单元，用于泵送流体遍及流体安全系统。
77.权利要求58的组织工程模块，其中流体流动板安装至所述结构支持物或与其形成整体，所述流体流动板通过操作连接至所述流体控制阀，以指引所述流体安全系统和所述生物反应器之内及其之间的流体流动。
78.权利要求58-77任一项的组织工程模块，其中所述组织工程模块另外含有加热混合室，以加热并混合流动至所述生物反应器的流体。
79.权利要求58的组织工程模块，其中所述流体安全系统和/或生物反应器之内或其之间装备有一个或多个气体交换膜，所述气体交换膜使气体产物能传递入或传递出流动至或停留于所述生物反应器内的流体。
80.权利要求58的组织工程模块，其中所述模块另外含有与所述生物反应器可操作连接的热电元件。
81.权利要求58的组织工程模块，其中所述模块另外含有一个或多个与所述传感器可操作连接的微处理器。
82.权利要求80或81的组织工程模块，其中所述模块另外含有印刷电路板，用于为一个或多个所述传感器、微处理器或热电元件提供电子接口。
83.权利要求58的组织工程模块，其中所述模块另外含有一个或多个进入孔，所述进入孔与所述生物反应器和/或流体安全系统有效连接，所述进入孔为细胞、流体、细胞和组织培养基、生长因子、药剂、质量控制试剂、质量控制样品和其他材料的无菌装载或去除提供准备。
84.权利要求83的组织工程模块，其中所述进入孔有效连接至与所述结构支持物集成的注射器歧管。
85.权利要求84的组织工程模块，其中所述注射器歧管含有至少一个连接至注射器的无菌进入孔。
86.权利要求58的组织工程模块，其中所述生物反应器可旋转地安装至所述结构支持物。
87.权利要求58的组织工程模块，其中所述生物反应器整体性地安装至所述结构支持物。
88.权利要求58的组织工程模块，其中所述生物反应器可从所述结构支持物分离。
89.权利要求58-88任一项的组织工程模块，其中装备有摄像仪，用于所述生物反应器内的目测。
90.权利要求58的组织工程模块，其中所述模块另外含有选自条形码、磁条、ID标签、电子内存及其组合的识别元件。
91.权利要求58的组织工程模块，其中所述模块使用前可灭菌，使用后可置换。
92.权利要求58的组织工程模块，其中所述模块适合在各种温度下储存和/或转运细胞和组织。
93.权利要求91的组织工程模块，其中所述模块装备于无菌封装内。
94.一种促进和支持细胞功能和/或组织结构产生的生物反应器，所述生物反应器含有-生物反应器外壳；-用于培养基流动的一个或多个进料口及一个或多个出料口；-限定于所述生物反应器外壳内的至少一个室，用于促进和支持细胞功能和/或一种或多种源自细胞和/或组织的组织结构的产生；以及-一个或多个传感器，用于监视涉及所述至少一个室内的所述细胞功能和/或组织结构产生的参数。
95.权利要求94的生物反应器，其中所述生物反应器外壳含有盖，所述盖选自可分离盖和与所述生物反应器外壳一体化的盖。
96.权利要求94或95的生物反应器，其中所述室选自组织消化室，培养/增殖室，分化/组织形成室及其组合。
97.权利要求97的生物反应器，其中所述室支托有一个或多个基片和/或支架。
98.权利要求96或97的生物反应器，其中所述生物反应器含有单个培养/增殖室，室内支托有培养/增殖支架和/或基片。
99.权利要求96或97的生物反应器，其中所述生物反应器含有连接至下游分化/组织形成室的培养/增殖室，所述培养/增殖室内支托有增殖支架和/或基片，所述分化/组织形成室内支托有可植入分化支架。
100.权利要求96或97的生物反应器，其中所述连接通道装备于所述培养/增殖室和所述分化/组织形成室之间，所述连接通道促进了从所述增殖支架和/或基片释放的细胞运动至所述分化支架。
101.权利要求100的生物反应器，其中所述生物反应器进一步含有用于消化组织活检材料的消化室，所述消化室位于所述培养/增殖室的上游。
102.权利要求99、100或101的生物反应器，其中在某个位置装备有一个或多个过滤器，所述位置选自所述增殖支架上游，所述分化支架上游，所述出料口上游，及其组合。
103.权利要求97-102任一项的生物反应器，其中所述支架选自多孔支架，带有梯度孔隙率的多孔支架、多孔网状支架、纤维支架、膜环绕支架及其组合。
104.权利要求103的生物反应器，其中所述支架的材料选自天然生物陶瓷、合成生物陶瓷、天然生物高分子、合成生物高分子、可植入生物陶瓷、可植入生物高分子及其混合物。
105.权利要求97的生物反应器，其中所述增殖基片是微载体的包容悬浮液。
106.权利要求100的生物反应器，其中所述分化/组织形成室含有多个区域，以容纳多个分化支架和/或基片。
107.权利要求94的生物反应器，其中所述生物反应器带有取样口，所述取样口与一个或多个所述室有效连接。
108.权利要求94的生物反应器，其中的气体交换膜构成所述室的一部分。
109.权利要求94的生物反应器，其中所述生物反应器经由所述进料口和所述出料口可移除地容纳有流体安全系统。
110.权利要求94的生物反应器，其中的混合隔板构成所述室的一部分，并可操作连接至混合传动装置和/或混合驱动器。
111.权利要求110的生物反应器，其中所述混合隔板合并入所述生物反应器内。
112.权利要求94的生物反应器，其中所述生物反应器与冲击传动装置和/或冲击驱动器有效连接。
113.权利要求94的生物反应器，其中所述室进一步支持对驻留细胞和/或组织的生理刺激。
114.权利要求113的生物反应器，其中所述刺激通过微载隔板而进行，所述微载隔板与微载传动装置和/或微载驱动器可操作连接。
115.权利要求114的生物反应器，其中所述微载隔板合并入所述生物反应器内。
116.权利要求113的生物反应器，其中所述刺激通过提供电场而进行。
117.权利要求94-116任一项的生物反应器，其中所述生物反应器通过操作容纳于组织工程模块内，所述组织工程模块含有附接于结构支持物并与所述生物反应器进行流体连通的流体安全系统，其中所述流体安全系统含有多个通过挠性管连接的挠性贮罐，用于向所述生物反应器和自所述生物反应器供给和回收流体。
118.权利要求117的生物反应器，其中所述组织工程模块容纳于自动化组织工程系统的外壳内，所述系统含有用于对所述模块进行操作的微处理器，所述微处理器控制所述模块的功能。
119.权利要求94-118任一项的生物反应器，其中所述生物反应器另外含有光学探头。
120.权利要求94的生物反应器，其中所述生物反应器可用以在无菌条件下储存或转运细胞、组织和/或植入物。
121.权利要求94-120任一项的生物反应器，其中所述生物反应器提供了一种或多种选自如下功能的环境组织活检储存、组织活检消化、细胞分拣、细胞洗涤、细胞浓缩、细胞接种、细胞增殖、细胞分化、细胞储存、细胞转运、组织形成、植入物形成、可植入组织的储存和可植入组织的转运。
122.权利要求121的生物反应器，其中所述细胞和组织选自骨、软骨、相关的骨和软骨前体细胞及其组合。
123.权利要求121的生物反应器，其中所述细胞选自胚胎干细胞，成人干细胞，成骨细胞，前成骨细胞，软骨细胞，髓核细胞，骨骼细胞，前软骨细胞，源自骨、骨髓或血液包括干细胞在内的骨骼祖细胞，及其组合。
124.权利要求122或123的生物反应器，其中所述细胞或所述组织相对于植入物的受者属于自身、同种异体或异种来源。
125.权利要求94的生物反应器，其中所述生物反应器使用前可消毒，使用后可置换。
126.权利要求125的生物反应器，其中所述生物反应器装配于无菌封装内。
127.一种用于组织活检的自动化消化的方法，所述方法包含-将组织活检载入与培养基贮罐和流动系统连接的生物反应器内，所述生物反应器带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；-将组织消化酶供给在所述生物反应器内；以及-监视并维持所述生物反应器内的消化条件，持续足够的时间段，以达到所期望的组织消化水平。
128.一种用于细胞自动化增殖的方法，所述方法包含-将细胞接种至支托于生物反应器内的增殖基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流体系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适培养条件，持续足够的时间段，以达到所期望的细胞增殖水平。
129.一种用于细胞自动化分化的方法，所述方法包含-将细胞接种至支托于生物反应器内的分化基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流体系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适培养条件，持续足够的时间段，以达到所期望的细胞分化水平。
130.一种用于生产组织结构的方法，所述方法包含-将细胞接种至支托于生物反应器内的支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流体系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适培养条件，持续足够的时间段以使所述细胞表达胞外基质，所述胞外基质为组织结构提供结构支持。
131.一种自动化方法，用于消化组织活检以提供包括前体细胞在内的原代细胞，以及进一步增殖和分化细胞使组织植入物能形成，所述方法包含-将组织活检载入与培养基贮罐和流动系统连接的生物反应器内，所述生物反应器带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；-供给组织消化酶；-监视并维持所述生物反应器内的合适消化条件，持续足够时间段以获得分离细胞；-将分离细胞接种至支托于生物反应器内的增殖基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；-监视并维持所述生物反应器内的合适培养条件，持续足够时间段以获得所期望的细胞增殖和扩增水平；-将扩增细胞从增殖基片或支架上释放；-将扩增细胞接种至支托于生物反应器内的分化基片或支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，用以检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适培养条件，持续足够时间段以获得组织植入物。
132.一种提供骨骼植入物的方法，所述方法包含-将成骨细胞和/或骨祖细胞接种至支托于生物反应器内的骨生物材料的多孔支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适条件，持续足够时间段，使成骨细胞和/或骨祖细胞增殖和/分化于整个支架，以提供用于整形应用的组织植入物。
133.一种提供软骨植入物的方法，所述方法包含-将软骨生成细胞和/或软骨祖细胞接种至支托于生物反应器内的生物材料的多孔支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件，以便通过微处理器进行评测；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适条件，持续足够时间段，使软骨生成细胞和/或软骨祖细胞增殖和/分化于整个支架，以提供软骨植入物。
134.一种提供用于脊椎盘内核重建的植入物的方法，所述方法包含-将髓核细胞接种至支托于生物反应器内的生物材料的支架或多孔支架上，所述生物反应器与培养基贮罐和流动系统连接，带有一个或多个传感器，用于检测所述生物反应器内的生理学条件并传至微处理器；以及-监视并维持所述生物反应器内的合适条件，持续足够时间段，以使髓核细胞增殖和/分化并表达具有髓核特性的胞外基质组分。
135.一种用于临床组织工程中的质量评价样品的制备方法，所述方法包含-采用权利要求1或26的系统并行制备初级和次级植入物，其中初级植入物用于植入，而一个或多个次级植入物用于试验目的，以推断初级植入物的口径。
136.一种洗涤细胞的方法，所述方法包含-将含有一种或多种不期望的化学物质的细胞悬浮液载入室内；-通过错流过滤模块将来自室的细胞悬浮液连续再循环，所述错流过滤模块含有所述细胞不能透过而所述不期望的化学物可以透过的膜，从而提供洗涤后的细胞悬浮液；以及-收集洗涤后的细胞悬浮液。
137.一种富集细胞的方法，所述方法包含-将含有过量的细胞悬浮液体积的细胞悬浮液载入室内；-通过错流过滤模块将来自室的细胞悬浮液连续再循环，所述错流过滤模块含有细胞不能透过但允许过量的细胞悬浮液体积被去除和收集的膜。
全文摘要
本发明提供了用于组织工程产品的自动化培养、增殖、分化、生产和养护的系统、模块、生物反应器和方法。其一方面是自动化组织工程系统，所述系统含有外壳，至少一个为外壳所支托的生物反应器，生物反应器促进了生理细胞功能和/或源自细胞和/或组织的一种或多种组织结构的产生。流体安全系统为外壳所支托，并与生物反应器进行流体连通。一个或多个传感器与一个或多个外壳、生物反应器或流体安全系统相关，用于监视涉及生理细胞功能和/或组织结构产生的参数；以及与一个或多个传感器连接的微处理器。本发明系统、方法和产品在各种临床和实验室装置中具有用途。
文档编号A61L27/00GK1688686SQ03813267
公开日2005年10月26日 申请日期2003年4月8日 优先权日2002年4月8日
发明者蒂莫西·J.N.·史密斯, 悉尼·M·皮尤, 马丁·R·佩查里奇, 鲁珀特·哈格, 罗伯托·塔马西尼, 伊夫·拉尔谢, D·洛厄尔·米谢内尔 申请人:米列姆·贝尔罗吉克公司