一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法

专利名称：一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学组织工程技术领域，尤其涉及一种新生儿组织工程膀胱片及其制 备方法。
背景技术：
先天性膀胱畸形包括膀胱外翻、发育不全，重复膀胱，脐尿管未闭，巨膀胱综合征 及膀胱憩室，如膀胱外翻是由于胚胎期泄殖腔膜的发育异常，导致先天性的下腹壁和膀胱 前壁缺损，膀胱后壁外翻，粘膜暴露的膀胱畸形，该病罕见，约1 4万新生儿中有一例，男 性多于女性，约2 8 1，由于膀胱外翻，膀胱粘膜和输尿管口外露，很易导致尿失禁及上 行性的肾孟肾炎，未经治疗者半数死于儿童期。因此，先天性膀胱畸形患儿需要在出生后尽 早对膀胱进行修补或重建。目前，临床上膀胱修补或重建最常用的膀胱替代材料仍为胃肠道，但因其与泌尿 系组织结构及生物特性不同而导致许多问题，如感染、代谢紊乱、尿结石形成、穿孔、黏液增 多及恶性肿瘤形成等一系列并发症。于是，人们开展了用合成的生物材料替代膀胱壁的研 究，目前修复重建膀胱的组织工程技术有两类①未种植种子细胞技术，直接应用构建的细 胞支架塑型和重建功能性膀胱，但多项研究表明，应用未种植种子细胞技术重建膀胱，移行 上皮可以再生，肌层虽然可以出现，但常存在发育不良，并会随时间的延长出现瘢痕形成和 移植物萎缩；②种植种子细胞技术，将体外扩增的种子细胞接种于细胞支架之上，而后移植 体外构建的组织工程化组织入宿主体内继续生长，直至形成替代的膀胱组织。传统上膀胱 组织工程中常用的种子细胞为膀胱移行上皮细胞和膀胱平滑肌细胞。在膀胱组织工程的研 究早期，难以克服移行上皮细胞的老化问题，从Cilento等成功实现了移行上皮细胞在体 外大规模扩增以来，原代培养基本形成了消化法、组织块法、刮取法和尿脱落细胞法等。但 自体膀胱移行上皮和平滑肌细胞作为种子细胞的缺点①当机体器官处于终末衰竭时，用 于扩增足够细胞的组织标本可能无法获得，而且作为已分化成熟的细胞，在体外培养时，不 仅增殖速度较慢，还存在去分化等问题；②由于染色体端粒的连续性缩短，正常的体细胞只 能进行有限的分裂传代，如果达到传代的极限，细胞将衰老并死亡；③神经源性膀胱的平滑 肌细胞在细胞增殖、收缩性及细胞黏附等方面都与正常细胞不同；④不适应于膀胱肿瘤患 者。近几年，随着干细胞的不断深入研究，其独特的优越性展现在人们的面前。干细胞是一 类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的特殊细胞。根据干细胞的来源、发育阶段、分 化趋势可将它们分为两大类胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞由于存在伦理、来源、 免疫排斥以及在条件不适时易成瘤性等问题限制了其的应用，而成体干细胞也存在细胞数 量、免疫排斥等缺陷，且对于新生儿而言取材也很困难。

发明内容
本发明所要解决的技术问题为提供一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法。为此，本发明提供了一种新生儿组织工程膀胱片，其特征在于其包含分化而来的平滑肌样细胞和可降解支架材料；包绕可降解支架材料，呈片状；所述平滑肌样细胞表达 α -SMA、CALP 禾口 MHC0在优选实施例中，所述干细胞为人羊水来源干细胞(human amniotic fluid colony-derived stem cells，hAFCSCs)、人羊膜间充质干细胞或脐带血间充质干细胞，其 中最优选为自体hAFCSCs。hAFCSCs作为种子细胞构建组织工程膀胱迄今国内外尚无报道， 且与胚胎干细胞，骨髓和脂肪等来源的间充质干细胞相比，还具有来源稳定易获取、无成瘤 性、免疫原性弱、增殖和分化能力强等优势。在优选实施例中，所述可降解支架材料为天然生物材料或人工合成可降解材料， 其中天然生物材料为自然衍生材料或无细胞基质，自然衍生材料为纤维蛋白、胶原、透明质 酸及其复合代物等大分子材料，无细胞基质有膀胱黏膜下脱细胞基质(bladder acellular matrix graft, BAMG)、尿道细胞夕卜基质(urethral extracellular matrix, UECM)或小肠 黏膜下脱细胞基质(small intestinals ubmucosa, SIS)；所述人工合成可降解材料为聚乳 酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸与聚乙醇酸共聚物(PLGA)、聚乳酸-己内酯的共聚物 (PLCL)、聚羟基链烷酸酯(PHA)或聚羟基丁酸(PHB)，其中优选聚羟基乙酸(PGA)。另一方面，本发明还公开了一种新生儿组织工程膀胱片的制备方法，包括下列步 骤将可降解支架材料置于培养容器中，干细胞悬液均勻地种到降解支架材料，37°C， 95%湿度，5% CO2的恒温培养箱中培养1-4小时；加入基础诱导培养液并添加诱导因子培养，每天换基础诱导培养液和诱导因子一 次，体外培养4周，所述基础诱导培养液为低糖DMEM+10% FBS+1 %青链霉素+1 % L-谷氨酰 胺，所述诱导因子为 30 μ M L-Ascorbic acid+2. 5ng/ml TGF-β l+5ng/ml PDGF-BB。在优选实施例中，所述干细胞悬液含有纤维蛋白、胶原、透明质酸或基质胶 (matrigel)；更优选为基质胶(matrigel)，以使干细胞能贴附可降解支架材料上。在一优选实施例中，所述干细胞悬液细胞密度为4X IO7个/ml。在优选实施例中，所述干细胞为hAFCSCs、人羊膜间充质干细胞或脐带血间充质干 细胞，其中最优选为自体hAFCSCs。在优选实施例中，所述可降解支架材料为天然生物材料和人工合成可降解材料， 其中天然生物材料为自然衍生材料或无细胞基质，自然衍生材料为纤维蛋白、胶原、透明质 酸及其复合代物等大分子材料，无细胞基质为有膀胱黏膜下脱细胞基质、尿道细胞外基质 或小肠黏膜下脱细胞基质；所述人工合成可降解材料为聚乳酸、聚羟基乙酸、聚乳酸与聚乙 醇酸共聚物、聚乳酸-己内酯的共聚物、聚羟基链烷酸酯或聚羟基丁酸，其中优选聚羟基乙 酸。本发明所述培养容器是常规的细胞培养皿或培养板。本发明方法具有以下突出优点和特点一，所选种子细胞为特殊来源的细 胞-hAFCSCs、人羊膜间充质干细胞或脐带血间充质干细胞，这些种子细胞有稳定的细胞来 源，可建立或已有细胞库，并且临床应用时不存在免疫排斥或免疫排斥低。如果胎儿经产 前诊断确认存在膀胱的先天性畸形需要进行修复或重建，那么可以充分利用产前诊断至胎 儿出生这段时间，构建胎儿组织工程膀胱片，待胎儿出生后即可尝试进行膀胱修补或重建。 二，hAFCSCs与可降解支架材料采用边诱导、边构建组织工程膀胱片的方法，将分离培养的早期hAFCSCs直接种植到支架材料上，使hAFCSCs在合适的诱导环境里边诱导边扩增与支 架材料形成复合物。结果证实，此种方式下，细胞增殖迅速，细胞贴附能力好，包绕可降解支 架材料，细胞呈成片状，组织增厚明显且具有一定韧性。而传统的构建方式是先将干细胞在 培养皿中将其诱导分化为所需要的成体细胞，再将分化后的成体细胞种植到支架材料上， 但诱导分化后的成体细胞的增殖能力、贴附能力均下降，不利于细胞在支架材料上的贴附 和增殖，造成早期细胞流失率高；继之，一段时间后待支架材料逐渐降解失去足够的结构强 度，本身增殖、贴附能力均较低的诱导后细胞更加难以形成一定韧性和厚度的组织块，实验 易失败。因此采取边诱导、边构建的方式更利于组织工程组织的培养成功。体内实验生物 力学检测也证实细胞-支架复合物在力学指标上具有和正常膀胱平滑肌组织类似的力学 拉伸特征，这一力学优势有助于恢复重建膀胱充盈时膀胱顺应性的一致性。


图IhAFCSCs向平滑肌细胞诱导分化的“峰”、“谷”样形态改变和诱导细胞相关蛋 白(α -SMA, CALP，MHC)的表达。图2hAFCSCs种植到PGA支架上扫描电镜下观察其生长情况及形成的组织块大体 肉眼观。图3组织免疫荧光化学染色显示体内构建组织的相关蛋白表达情况。图4A-C各组间生物力学指标测试的比较*表示力学阴性对照组与力学实验组，力学阳性对照组相关力学指标比较，差异具 有显著性。#表示力学实验组与力学阳性对照组相关力学指标比较，差异具有显著性。
具体实施例方式为进一步详细描述在本发明的实践中所使用的常规技术，实践者可参看有关 细胞生物学、组织结构学以及胚胎学的标准的教科书及评论。包括Teratocarcinomas and embryonic stem cell :A practical approach[E. J. Robertson 编，IRL 出版有限 公司，1987] ；Guide to techniques in Mouse Development[P. M. Wasserman 等编，学术 出版社，1993] ；Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro [Μ. V. Wiles, Meth. Enzymol. 225 :900,1993] ；Properties and uses of Embryonic Stem Cells :Prospects for Application to Human Biology and Gene Therapy[P. D. Rathjen等，Reprod.Fertil. Dev. 10 :31,1998]。细胞生物学、蛋白质化学、和抗体技术可以在“蛋白科学中的当前方案” [J. E. Colligan等编辑，Wiley&Sons]、“细胞生物学中的当前方案” [J. S. Bonifacino等， ffiley&Sons]和“兔疫学功时当亦方案” [J. E. Colligan等编辑，ffiley&Sons]中找到。与 本发明相关的试剂、克隆载体、和基因操作试剂盒可从商业供应商那得到，例如BioRad、 Stratageneλ Invitrogen、ClonTech 以及 sigma-AIdrich 公司。细胞培养方法通常在“动物细胞培养基本技术手册”最新版本(R. I. Freshney编 辑，Wiley&Sons)；“细胞培养一般技术” (Μ. A. Harrison和I. F. Rae，剑桥大学出版)；和“胚 胎干细胞方法和操作规定”(K. Turksen编辑，Humana出版)中有描述。组织培养基和试剂 可从商业供应商那得至IJ，例如 Gibco/BRL、Nalgene-Nunc International、Sigma ChemicalCo.、以及 ICN Biomedicals。组织工程材料的选择通常在“生物医学材料”(李玉宝编著，化学工业出版社， 2003)；“生物医用材料导论”(李世普编著，武汉工业大学出版社，2008)；“生物医学材料 学”(顾汉卿等编著，天津科技翻译出版公司，199 中有描述。力学测试可选用instron corporation(美国)不同规格的仪器进行力学测试。组织工程方法通常在“组织工程学原理”(R. Lanza等编辑，杨志明等译，化学工业 出版社，2006)； “组织工程学理论与实践”(曹谊林等编辑，上海科学技术出版社，2004)； “人体组织工程学”(胡敏等编著，人民军医出版社，2006)中有描述。生物力学测试相关技术通常在“医用生物力学”(杨桂通编著，科学出版社，1994)； “Biomechanics :Mechanical Properties of Living Tissues”，Yc Fung 编著，New York Springer-Verlag, 1993)；“生物力学活组织的力学特性”(冯元桢编著，湖南科学技术出 版社，1986)；“材料力学实验”(刘宏文等编著，高等教育出版社，199 中有描述。本发明所述干细胞为人羊水来源干细胞(human amniotic fluid colony-derived stem cells, hAFCSCs)、人羊膜间充质干细胞或脐带血间充质干细胞可来自商业化细胞或 自体细胞。本发明优选为人羊水来源干细胞(又称人羊水干细胞)。Kaviani等发现从孕 71-90天孕羊的羊水细胞中获得的间充质干细胞的体外扩增速度明显快于羊胎儿细胞和成 年羊骨髓来源的间充质干细胞。2003年h’t Anker等从人孕中期羊水细胞中培养得到间 充质干细胞，发现其扩增潜能甚至超过了骨髓间充质干细胞。2007年Kim等在对孕14-16 周人羊水细胞进行体外培养研究中获得类似于骨髓间充质干细胞的干细胞，称其为hAFFTs 细胞，通过端粒酶活性和分化潜能测定，发现其具备端粒酶活性和良好的体外扩增潜能。 Coppi等分离获得的AFS (amniotic fluid stem cells)细胞在体外可迅速生长，在36小时 内即实现细胞数倍增，而且未显示出有致瘤特性。这些细胞在经过250次倍增之后，仍然保 持正常核型。对本发明使用的培养基的类型没有限制，只要可用于干细胞培养的培养基即可。 在这类培养基中(X)2的浓度优选是5%，但本发明不限于此。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。以 下结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发 明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商 所建议的条件。实施例中所述羊水由上海市杨浦区妇幼保健院提供。实施例中所使用的基础诱导培养液成分为低糖DMEM+10% FBS+1%青链霉 素+1 % L-谷氨酰胺；添加的为诱导因子30 μ M的L-Ascorbic acid+2. 5ng/ml的 TGF-β l+5ng/ml 的 PDGF-BB。实施例1一 hAFCSCs的分离、分选及诱导培养羊水标本来自孕中期月)行产前诊断的孕妇，超声引导下行羊膜腔穿刺取得 20-40ml羊水至50ml无菌离心管，密封后4°C冷藏保存并迅速转移到层流无菌细胞培养室内的超净台中。利用无菌100目筛网过滤后4°C环境下IOOOrpm离心5min。离心后弃上清， 管内加入5ml培养液培养。8-10天后用克隆杯挑取生长良好形态均勻的克隆获得hAFCSCs。 体外继续培养扩增后选取第4代hAFCSCs，待其生长至70-80%融合时，更换为基础诱导培 养液并每Mh向培养皿中添加诱导因子，置于37°C，5% CO2的恒温培养箱中培养基础诱导 培养液每3天换液一次，体外诱导培养4周。二 PGA材料支架的准备取直径为15 μ 1的非编织PGA材料80mg，将其压制成22mmX22mmX 1. 5mm的支架。 75%乙醇浸泡支架2小时，1 % PBS轻洗三遍，之后基础诱导培养液浸泡两遍，每次10分钟， 移去培养液，在紫外灯照射下超净台内干燥30分钟备用。三hAFCSCs与PGA材料支架边诱导边构建组织工程膀胱片的过程1)收集足够量的hAFCSCs，调整细胞密度为4X IO7个/ml，取500 μ 1细胞悬液与 250 μ 1 matrigeld 1稀释)混勻，均勻地种到PGA支架上，放入37°C，95%湿度，5% (X)2 的恒温培养箱中培养。2) 4小时后待hAFCSCs贴附到PGA支架材料上后首次添加基础诱导培养液，并每天 添加诱导因子，体外培养4周。四hAFCSCs与PGA材料支架复合物的体内种植在无菌操作环境下，将6-8周裸鼠背部做纵行切口，将上述三、幻培养的细胞-PGA 支架复合物种植到裸鼠背部皮袋内，缝合，继续饲养，4天后拆线。4周后取材。在培养期间，需按常规细胞生长所需的各种条件，例如温度(37°C )，二氧化碳浓 度(5% )，相对稳定的pH值及适宜的湿度等。在倒置显微镜下观察可见hAFCSCs在基础诱导培养液和添加诱导因子的诱导 培养方案下，经诱导1周后细胞多角形逐渐消失，细胞形态变窄变长。4-5周后经诱导的 hAFCSCs呈典型的长梭状平滑肌细胞样，待细胞90%融合后形成特征性“峰”和“谷”样排列 (图1A)。例1 一中体外培养4周的hAFCSCs-PGA支架复合物增厚明显，表面光滑且富于弹 性与韧性(图2D)。实施例2对例1 一中得到的诱导细胞进行细胞荧光免疫染色，证实经上述诱导方案下诱导 的hAFCSCs表达平滑肌细胞的标志物平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin，α-SMA) (图 2A)，肌钙蛋白(calponin，CALP)(图 2B)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MHC) (图2C)，证明我们的诱导方法能够成功地使hAFCSCs分化成平滑肌样细胞。对例1四中取材得到的细胞-PGA组织块进行冰冻切片后组织免疫荧光染色发现 平滑肌细胞的标志蛋白α "SMA, CALP, MHC均有表达(图3箭头所指)。对例1 二、三中得到的PGA材料支架和复合物进行扫描电镜观察可见非编织PGA 支架材料呈不规则网格状结构(图2A)，其网格大小有利于hAFCSCs向支架内部渗透、迁移； 1周时扫描电镜下可见hAFCSCs与PGA材料贴附紧密，并开始分泌细胞外基质(图2B) ；2周 时可见细胞包绕PGA材料大量增殖成片状，分泌大量细胞外基质(图2C)；并可见PGA材料 开始降解，出现断痕(图2C箭头所示)。上述说明，hAFCSCs与PGA生物可降解支架具有良 好的生物相容性，能够在支架材料上迅速增殖生长。实施例3体内种植的hAFCSCs与PGA材料支架复合物的力学效果评价
将例1四中取材得到的样品修剪成约15mmX IOmmX 1. 5mm大小的类长方状，标本 固定于万能电子拉伸机(instron 5969)上，使用50N的拉力传感器，以5mm/min速度加载 样品，检测最大拉伸应力(即最大载荷)，最大拉伸率，最大载荷处的变形量等指标，测量得 出的数据用统计学软件SPSS. 11. 0进行分析处理，各组别的力学指标以均数士标准差表示 (表1)。各组样品之间力学数据的比较用Mudent's t检验进行统计，P <0.05为差异具 有显著性。结果显示在最大载荷指标上力学阴性对照组与力学实验组(P = 0. 0352)，力学 阳性对照组(P = 0. 0047)比较，差异具有显著性(图4A)；力学实验组与力学阳性对照组 (P = 0. 0103)比较，差异具有显著性(图4A)。在最大载荷处的变形量指标上力学阴性对照 组与力学实验组(P = 0. 0176)，力学阳性对照组(P = 0. 0084)比较，差异具有显著性(图 4B)；力学实验组与力学阳性对照组(P = 0. 4064)比较，无显著性差异(图4B)。在最大拉 伸率指标上力学阴性对照组与力学实验组(P = 0. 0099)，力学阳性对照组(P = 0. 0054)比 较，差异具有显著性(图4C)；力学实验组与力学阳性对照组(P = 0. 4715)比较，无显著性 差异(图4C)。综上说明，力学实验组在各项指标上较单纯PGA支架力学阴性对照组具有明 显的力学优势；力学实验组同力学阳性对照组相比虽然在最大载荷上仍有一定差距，但二 者在最大载荷处的变形量和最大拉伸率上并无显著性差异，说明细胞-PGA支架复合物与 正常膀胱组织平滑肌层具有相似的拉伸性能和力学特性。表1各测试组间生物力学指标测试的比较
权利要求
1.一种新生儿组织工程膀胱片，其特征在于其包含分化而来的平滑肌样细胞和可 降解支架材料；所述平滑肌样细胞包绕可降解支架材料，呈片状；所述平滑肌样细胞表达 α -SMA、CALP 禾口 MHC0
2.如权利要求1所述的新生儿组织工程膀胱片，其特征在于所述干细胞为人羊水来源 干细胞、人羊膜间充质干细胞或脐带血间充质干细胞。
3.如权利要求2所述的新生儿组织工程膀胱片，其特征在于所述人羊水来源干细胞为 自体人羊水来源干细胞。
4.如权利要求1所述的新生儿组织工程膀胱片，其特征在于所述可降解支架材料为天 然生物材料或人工合成可降解材料。
5.一种权利要求1所述新生儿组织工程膀胱片的制备方法，包括下列步骤a)将可降解支架材料置于培养容器中，干细胞悬液均勻地种到降解支架材料，37°C， 95%湿度，5% CO2的恒温培养箱中培养1-4小时；b)加入基础诱导培养液并添加诱导因子培养，每天更换基础诱导培养液和诱导因子一 次，体外培养4周，所述基础诱导培养液为低糖DMEM+10% FBS+1 %青链霉素+1 % L-谷氨酰 胺，所述诱导因子为 30 μ ML-Ascorbic acid+2. 5ng/ml TGF-β l+5ng/ml PDGF-BB。。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述干细胞悬液含有纤维蛋白、胶原、透 明质酸或基质胶。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述可降解支架材料为天然生物材料或 人工合成可降解材料。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述干细胞为人羊水来源干细胞、人羊 膜间充质干细胞或脐带血间充质干细胞。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述人羊水来源干细胞为自体人羊水来 源干细胞。
10.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述培养容器是细胞培养皿或培养板。
全文摘要
本发明涉及医学组织工程技术领域，尤其涉及一种新生儿组织工程膀胱片及其制备方法。本发明提供了一种新生儿组织工程膀胱片，其特征在于其包含分化而来的平滑肌样细胞和可降解支架材料；所述平滑肌样细胞包绕可降解支架材料，呈片状；所述平滑肌样细胞表达α-SMA、CALP和MHC。本发明所述新生儿组织工程膀胱片在力学指标上具有和正常膀胱平滑肌组织类似的力学拉伸特征，这有助于恢复重建膀胱充盈时膀胱顺应性的一致性。
文档编号C12N5/0775GK102120046SQ20101060988
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月23日 优先权日2010年12月23日
发明者周君梅, 陈方, 高同斌 申请人:上海市儿童医院