专利名称：一类二肽酶四抑制剂及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类二肽酶四(DPPIV)抑制剂，具体指一类可作为DPPIV抑制剂的新型的三氮唑稠杂环小分子有机化合物，该类化合物可用作预防、延缓其进展或治疗由DPPIV介导的病症，特别是2型和1型糖尿病、受损的糖耐受(IGT)、肥胖、关节炎、骨质疏松和部分肿瘤。本发明还涉及该DPPIV抑制剂的制备方法。
背景技术：
糖尿病是由不同病因与发病机理引起体内胰岛素缺乏或胰岛素作用降低，临床上以糖代谢异常为主要表现的一组异质性内分泌代谢疾病的总称。如果得不到及时有效的治疗，可导致失明、心脑血管疾病、肾功能衰竭等多种并发症，严重危害人类健康。糖尿病在我国及全世界发病率都很高。因此，研究对糖尿病的有效的预防和治疗方法，具有重要意义。
人DPPIV(EC 3.14.21.5；Dipeptidyl peptidase IV)中文名称二肽酶四，又称为白细胞分化抗原26(CD26，cluster of differentiation 26)、腺苷脱氨酶结合蛋白2(ADA bindingprotein)，是一多功能的II型跨膜糖蛋白，生理条件下由两个766个氨基酸的多肽组成同二聚体(Scand J Immunol 2001；54249-64.)。也有一种可溶形式的DPPIV存在于血液和组织液中，其酶学性质与跨膜的DPPIV一致(Eur J Biochem 2000；2675608-13.)。
DPPIV的催化活性即它的二肽氨肽酶活性，能在底物多肽的N末端切掉两个氨基酸残基。DPPIV对底物具有特异性选择，只有当N末端序列为Xaa-Pro或者Xaa-Ala且一般长度小于80个氨基酸的多肽，才可以成为其底物(Xaa代表任何氨基酸)(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 371(1990)，pp.1113-1118.)。例如GLP-1(Glucagon-like peptide 1)，GIP(Glucose-dependent insulintropic peptide)和PACAP(Pituitary adenylylate cyclase activatingpolypeptide)在体内都能够被DPPIV切割[4]。
1)GLP-1即是由位于小肠末梢的L细胞分泌的一种含30个氨基酸的短肽；GLP-1能够上调胰岛素基因的表达，促进胰岛素生物合成，刺激β细胞的胰岛素(insulin)分泌；同时GLP-1还可以抑制胰高血糖素的分泌，抑制胃排空；部分但并非全部研究证明，长期的或者重复的脑室内注射GLP-1能够导致进食减少和体重降低(Investig Drugs.2004Mar；13(3)177-88.)。
但是，GLP-1在体内很容易被二肽酶四(DPPIV，Depeptidyl peptidase)降解从而失去生物学活性，其半衰期小于2分钟(Endocrinology.1995 Aug；136(8)3585-96.)。研究发现由于目前未知的原因，2型糖尿病患者体内的GLP-1分泌受损，致使活性形式的GLP-1的含量较之正常人下降很多(Diabetologia(1986)2946-52.)；所幸的是，GLP-1上述功能在2型糖尿病患者体内仍然保留(J.Clin.Invest.(1993)91301-307.)。因此，如果通过抑制DPPIV的活性增加活性形式的GLP-1在患者体内的含量，有可能治疗这种疾病。
2)这种设想也在实践中得到了证明。无论是体内无DPPIV酶活性或者其活性收到抑制的啮齿类动物，还是服用DPPIV抑制剂的糖尿病患者，体内胰岛素含量升高，体现出改善的糖耐受，且未显示出较严重的不良反应(Biochem Biophys Res Commun.2001 Jun8；284(2)501-6.Life Sci.2002 May 31；7l(2)227-38.Proc Natl Acad Sci U S A.2003 May27；100(11)6825-30.Epub 2003 May 14.Proc Natl Acad Sci U S A.2000 Jun6；97(12)6874-9.Curr Opin Investig Drugs.2003 Apr；4(4)412-20.Diabetes Care.2004Dec；27(12)2874-80.Diabetes 2004 53(suppl 2)A82)。
由于GLP-1还具有诱导β细胞新生，促进β细胞前体分化、成熟，抑制β细胞的调亡的作用，研究结果提示DPPIV的抑制剂对1型糖尿病也有一定疗效(Diabetes 2003；52741-50.)。
GIP被认为具有与GLP-1类似的功能，但是作用机制不明，它对二型糖尿病患者的治疗作用有限；PACAP也具有促进细胞增殖，减少细胞调亡，调节胰岛功能的作用。虽然目前的观点认为，DPPIV能够治疗糖尿病主要是通过抑制DPPIV酶活性，维持着较高的浓度的GLP-1导的；但是长期服用DPPIV抑制剂，也许GIP和PACAP也起了部分作用(Expert Opin Investig Drugs.2004 Sep；13(9)109l-102.)。
综上所述，DPPIV的抑制剂可以用于预防、延缓1型和2型糖尿病的进展或治疗2型和1型糖尿病、改善受损的糖耐受(IGT)，甚至肥胖。
3)不仅如此，越来越多的研究认为，由于DPPIV在T细胞激活，趋化作用调节，恶性转化，肿瘤迁移的生理或者病理活动中扮演着重要的角色，DPPIV的抑制剂可以用于治疗关节炎、骨质疏松和部分肿瘤(Immunopharmacology.1998 Jul；40(1)2l-6.Clin Chem.1988Dec；34(12)2499-501.Histol Histopathol.2004 Oct；19(4)1345-51.Clin Sci(Lond).2005Apr；108(4)277-92.Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord.2004 Mar；4(1)11-8.Crit Rev Clin Lab Sci.2003 Jun；40(3)209-94.)。
目前尚无DPPIV抑制剂作为药品上市；Novartis(http//www.novartis.com)开发的LAF237，Merck公司(http//www.merck.com)丌发的MK-0431都是DPPIV抑制剂，正在进行三期临床实验。GlaxoSmithKine(一期临床)，Bristol-Meyer-Squibb(二期临床)，Probiodrug(P93/01；二期临床)以及其它一些公司也在进行DPPIV抑制剂的研究(RegulPept.2005 Jun 15；128(2)159-65.)。
发现并开发新型DPPIV抑制剂用于预防、延缓其进展或治疗由DPPIV介导的病症，特别是2型和1型糖尿病、受损的糖耐受(IGT，impaired glucose tolerance)、肥胖、关节炎、骨质疏松和部分肿瘤，具有广阔的应用前景和重大的商业意义。
发明内容
本发明的目的是提供一类DPPIV抑制剂三氮唑稠杂环化合物。
本发明的另一目的是提供该类稠杂环化合物的制备方法。
本发明的再一目的是提供该类化合物的用途。
本发明所述的一类新型DPPIV抑制剂的具体结构如下 其中X为S，O，NH，或C＝C；R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R3为SR5，或者NH R6；其中R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基，氨基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
本发明通过下列步骤实施步骤一根据化学反应式
其中X为S，O，NH，或C＝C；R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
在甲醇、乙醇、二氧六环、二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、苯、甲苯等溶剂中，异硫氰酸酯类化合物2与2-氨基胍类衍生物4发生偶合反应，生成三氮唑类化合物5；化合物5再在碱性条件下，在甲醇、乙醇等溶剂中脱去-OR`基团，闭环成为稠杂环化合物6。
步骤二根据化学反应式 其中X为S，O，NH，或C＝C；R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
化合物6与卤代烷烃、卤代环烷烃、卤代苯等试剂在丙酮、二甲基甲酰胺、乙醇、二氯甲烷等溶剂中，在碱性条件下反应生成化合物7；或进一步与脂肪胺、芳香胺类化合物反应生成化合物8。
以上反应在如下溶剂中进行反应甲醇，乙醇，N，N-二甲基乙酰胺等有机溶剂，根据具体化合物的反应情况，反应温度一般为室温或加热温度从50℃至90℃。反应时间根据具体反应物而定。通常用TLC来跟踪测定反应的完成程度，反应完毕后一般采用的后处理方法包括抽滤、浓缩反应液除尽溶剂、重结晶、萃取、柱层析分离等。最终产物用NMR和MS来检测证明。
本发明中三氮唑稠杂环小分子有机化合物的合成方法参阅以下文献1.Heterocycles.Vol.57，No.6，2002，pp.1135-1141.
2.Heterocycles.Vol.12，No.6，1979，pp.745-749.
3.J.Med.Chem.1999，42.5437-5447.
4.J.Heterocyclic.Chem.1999，36，333-345.
5.J.Med.Chem.2001，44.1231-1248.
有益效果本发明设计与合成了一类新型的三氮唑稠杂环DPPIV抑制剂，在体外试验中能有效抑制DPPIV的活性，可用于制成预防、延缓其进展或治疗由DPPIV介导的病症，特别是2型和1型糖尿病、受损的糖耐受(IGT)、肥胖、关节炎、骨质疏松和部分肿瘤的药物的药物。本发明化合物结构相对简单，易于制备。
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
下述制备例中，NMR用Varian生产的Mercury-Vx 300M仪器测定，NMR定标δH/C 7.26/77.0ppm(CDCl3)；试剂主要由上海化学试剂公司提供，产品纯化主要用柱色谱法，硅胶(200-300目)，柱色谱法所用的硅胶型号为粗空(ZLX-II)，由青岛海洋化工厂分厂生产。
实施例化合物7a，7b的制备 取270mg化合物2(1mmol)和180mg化合物4(1mmol)，溶于5ml N，N-二甲基乙酰胺，90℃回流5小时，用TLC来跟踪测定反应的完成程度。反应完毕后，用减压蒸馏法除去N，N-二甲基乙酰胺，残留物用氯仿溶解，溶液静置，冷藏，有固体沉淀析出。过滤，所得固体溶于2ml乙醇，加5滴三乙胺，80℃回流3小时，反应过程中有固体沉淀析出。用TLC来跟踪反应。反应物溶液过滤，固体沉淀用乙醇洗涤，得化合物6。
6a(R＝H)1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ1.76(m，4H)，2.52(m，2H)，2.63(m，2H)，3.83(s，3H)，7.13(d，2H)，7.47(d，2H)。
取5mg化合物6(0.01mmol)，溶于2mlDMF，加5μl碘甲烷，再加入少量碳酸钾，室温下搅拌反应5小时，用TLC来跟踪反应。反应液抽干，以氯仿/甲醇(体积比50∶1)柱层析分离等得到化合物7。
7a(R＝H)1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.76(m，4H)，2.52(m，2H)，2.63(m，2H)，2.96(s，3H)，3.83(s，3H)，7.13(d，2H)，7.47(d，2H)。
7b(R＝Me)1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.12(d，3H)，1.95(m，2H)，2.42(m，2H)，2.72(s，3H)，2.88(m，2H)3.23(m，1H)，3.86(s，3H)，7.06(d，2H)，7.33(d，2H)。 1H NMR数据待测。
用同法可制备以下化合物 R＝Me，Et，Pr，iPr，PhR1＝Me，Et，Pr，PhDPPIV活性抑制测试试验DPPIV能在许多多肽的N端切掉前两个氨基酸N端为Xaa-Pro或者Xaa-Ala且一般长度小于80个氨基酸的多肽，可以成为其底物(Xaa代表任何氨基酸)。为了方便检测，目前经常使用诸如Ala-Pro-AMC(AMC代表7-amino-4-methylcoumarin，即7-氨基-4-甲基香豆素)，Gly-Pro-pNa，Ala-Pro-AFC等作为DPPIV的底物。我们使用Ala-Pro-AMC作为底物检测DPPIV的活性。在适宜的反应条件下，DPPIV作用于底物中Pro与AMC之间的键，释放出产物AMC；游离的AMC在激发波长为355nm时，发射荧光，检测460nm(Victor-2，Perkin Elmer)处荧光值的变化，可以定量测定DPPIV的活性。
比较测活体系中存在和不存在化合物样品时DPPIV的活性，判断样品是否具有抑制活性；如果有，测定不同样品浓下DPPIV活性，计算样品抑制DPPIV的IC50，即半抑制浓度(Inhibitory concentration 50％)。
杆状病毒表达系统表达的重组人源DPPIV的胞外区段即第29至766氨基酸序列；经鉴定，其分子量和酶学性质(Km、kcat、阳性抑制剂DiprotinA对其的IC50)均与文献报道天然或重组的DPPIV一致。
测定样品抑制活性的反应体系100μl包含100mM Hepes，pH 7.4，10μM Ala-Pro-AMC，100pM DPPIV以及溶解于DMSO的待测样品，DMSO含量为2％。测活温度为室温；加到96孔聚苯乙烯酶标板中的顺序为DMSO，水，缓冲液，酶，底物。混匀，用荧光测定仪器Victor-2(Perkin Elmer)读取荧光值。
Victor-2的参数设定wavelengthexcitation/emission分别为355/460nmCW-lamp energy 2000Emission aperture normalMeasurement time 0.5sec每2分钟记录一个荧光值；共记录5个值；读完之后，对5个单点的值进行斜率分析(这些荧光值呈线性上升)；所得斜率即为酶的反应初速度，单位是RFUs/min。Victor-2的控制软件为Wallac；数据记录及分析软件为Excel。
上述测活体系所得反应速度是全酶活性的反应速度。化合物溶于DMSO中；将溶有一定浓度化合物的DMSO(2μl)代替上述体系中的DMSO(2μl)，测得反应速度为化合物作用下的反应速度。两相比较，判断化合物是否具有抑制作用。以DPPIV的阳性抑制剂DiprotinA(Ile-Pro-Ile)作为阳性对照。
若存在抑制作用，测定不同样品浓度下DPPIV活性，计算样品的IC50，即半抑制浓度(Inhibitory concentration 50％)。
分析实验结果，认为此类化合物能够抑制DPPIV的活性，其抑制DPPIV的IC50如下表。
权利要求
1.一类结构式如下的DPPIV抑制剂 其中X为S，O，NH，或C＝C；R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R3为SR5，或者NHR6；其中R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
2.根据权利要求1所述的DPPIV抑制剂，其特征在于当X为S时，R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R3为SR5，或者NHR6；其中R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
3.根据权利要求1所述的DPPIV抑制剂，其特征在于当X为O时，R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R3为SR5，或者NHR6；其中R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
4.根据权利要求1所述的DPPIV抑制剂，其特征在于当X为NH时，R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R3为SR5，或者NHR6；其中R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
5.根据权利要求1所述的DPPIV抑制剂，其特征在于当X为C＝C时，R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R3为SR5，或者NHR6；其中R5，R6为各自独立地为C1-C13烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
6.如权利要求1所述的DPPIV抑制剂的制备方法，包括如下步骤步骤一 步骤二 其中X为S，O，NH，或C＝C；R1，R2各自独立地为C1-C13烷基，环烷基，苯基或取代苯基；苄基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基；R4为烷基，或者 其中R7为OR8，或NHR9；其中R8，R9为各自独立地为C1-C4烷基，苯基或取代苯基；苄基；环烷基；含有包括卤素原子、烷氧基或羟基在内的取代烷基。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于a、在甲醇、乙醇、二氧六环、二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、苯、甲苯等溶剂中，异硫氰酸酯类化合物2与2-氨基胍类衍生物4发生偶合反应，生成三氮唑类化合物5；b、化合物5再在碱性条件下，在甲醇、乙醇等溶剂中脱去-OR`基团，闭环成为稠杂环化合物6。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于a、化合物6与卤代烷烃、卤代环烷烃、卤代苯等试剂在丙酮、二甲基甲酰胺、乙醇、二氯甲烷等溶剂中，在碱性条件下反应生成化合物7；b、进一步与脂肪胺、芳香胺类化合物反应生成化合物8。
9.如权利要求1所述的DPPIV抑制剂的用途，在制备预防、治疗由DPPIV介导的疾病的药物中应用。
10.根据权利要求9所述的DPPIV抑制剂的用途，其特征在于DPPIV介导的疾病指在制备II型糖尿病和I型糖尿病、肥胖症、关节炎、骨质疏松或肿瘤药物中应用。
全文摘要
本发明提供一类DPPIV抑制剂，其具体结构如右，试验表明该抑制剂能有效抑制二肽酶四(DPPIV)活性，可用于预防、延缓其进展或治疗由DPPIV介导的病症，特别是2型和1型糖尿病、受损的糖耐受(IGT)、肥胖、关节炎、骨质疏松和部分肿瘤。本发明还提供了该抑制剂的制备方法。
文档编号A61P3/04GK1891704SQ200510027629
公开日2007年1月10日 申请日期2005年7月8日 优先权日2005年7月8日
发明者李佳, 南发俊, 赵远胜, 顾明, 李静雅 申请人:中国科学院上海药物研究所