专利名称：一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法
技术领域：
本发明涉及转基因，动物克隆，珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。
背景技术：
鸟类转基因技术对于鸟类生产性能的改良、抗病育种，制造生物反应器方面具有独特的优点和广阔的应用前景。由于鸟类具有独特的生殖生理和解剖学特点，使得转基因鸟类研究明显滞后于哺乳动物，例如哺乳动物的显微注射法在鸟类转基因中行不通。胚胎干细胞具有组建种系和体细胞组织的多潜能性，并以在细胞水平上进行基因修饰，因而可以通过胚胎干细胞生产转基因鸟类。
到现在为止鸟类胚胎干细胞培养方法有两种，一种是利用胚盘细胞培养法，另一种是从原始生殖细胞(即PGCs)中获取。原始生殖细胞是胚胎生殖谱系最原始形式的细胞，是精子和卵子的祖先细胞。作为胚胎干细胞(ES)分离克隆的重要材料来源之一，原始生殖细胞已成为诸多研究的热点。1870年Waldeyer首先在鸡胚的生殖腺中发现具有多分化潜能的PGCs.1992年Tsai等从胚盘和生殖新月区获得的PGCs进行了体外培养。1994年，Naito等队鸡血液中PGCs的冷冻保存获得成功。之后，饲养层、细胞生长因子对PGCs生长、增殖的影响也进行了大量的研究。
目前，对于禽类PGCs的体外操作主要集中在转基因鸡的研究，同种嵌合体、异种间嵌合体的制备以及通过体外培养PGCs获取干细胞等几个方面。对于鸡胚胎PGCs的长期培养及建系等方面的研究报道很少，仍没有摸索到最适合的传代培养条件。
发明内容
本发明的目的是获得禽类原始生殖细胞长期体外培养的有效方法，为利用鸡原始生殖细胞进行体外操作和鸡胚胎PGCs的进一步建系奠定研究基础。
本发明将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上，再使用培养液进行培养；所述培养液为在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
本发明的优点如下1、操作简便，可重复性强，可以满足一般利用PGCs进行体外操作的要求。
2、从胚胎分离用于ES细胞培养的PGCs数目远较来自同一早期胚胎内细胞团得到的细胞数量要多的多，对胚胎来源奇缺的濒危动物具有更为重要的意义。
3、从PGCs建立体外长期存活的EG系为体外研究生殖细胞发育分化提供了无限的细胞源，可在体外摸索生殖细胞发育分化的研究。
4、可以在体外对PGCs进行较长时间的培养，令干细胞大量增殖，进行细胞与组织工程操作。
5、所获得的原始生殖细胞可进行转基因，动物克隆，嵌合体鸡的制备。
图1为第19期原代PGCs培养48h后形成的集落×200。
图2为第19期原代PGCs培养96h后形成的集落×200。
图3为第19期第2代PGCs培养72h后形成的集落×200。
图4为PAS染色后的PGCs×1000。
图5为第19期第2代PGCs的碱性磷酸酶染色×200。
图6为四种培养体系中PGCs的增殖生长情况图表。
具体实施例步骤1鸡胚胎PGCs的分离受精蛋孵化到19期，无菌获取鸡胚，在PBS中浸洗3次。在解剖镜下去除头、尾、心凸及肝突，取后肠前1/3的背外侧组织部位(包括生殖嵴部)，将取下的生殖嵴及其附带周围组织用PBS浸洗3次，置于75ml三角瓶内，加入37℃预热的0.25％胰蛋白酶+4％EDTA 5～10ml，室温下消化5min，消化时辅以硅化的玻璃吸管轻轻吹打使分散。以消化液用量5％的FCS终止消化。200g离心8min，弃上清，用培养液重新悬浮细胞，进行台盼蓝染色计算活细胞数，调整细胞浓度至104/ml接种到培养瓶中。每个25cm2培养瓶中接种3～5个鸡胚胎生殖嵴来源的PGCs。
步骤2鸡原始生殖细胞体外培养后的生物学特性检测分别用形态学鉴定，PAS特异性染色检测，碱性磷酸酶(AKP)染色，鉴定出鸡原始生殖细胞。
形态学鉴定如图1至5所示，图4中，①PGCs②脂肪颗粒③杂质颗粒。
步骤3同一时期的PGCs在不同培养体系中体外培养分别制备两种培养液和四种培养体系培养液IDMEM高糖培养基，添加10％小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳和100U/ml硫酸庆大霉素。
培养液IIDMEM高糖培养基，添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/ml IGF和100U/ml硫酸庆大霉素。
上述DMEM(Dulbecco’s modify Eagle’S medium液)，即杜贝克氏改良的恩格氏培养液。
培养体系1不使用饲养层，使用培养液I培养体系2不使用饲养层，使用培养液II培养体系3将PGCs接种到CEF饲养层上，使用培养液I培养体系4将PGCs接种到CEF饲养层上，使用培养液II四种培养体系中PGCs的增殖生长情况如图6所示。
如图6所示，在培养体系1中无PGCs的AKP阳性克隆形成；在培养体系2中仅有1代PGCs的AKP阳性克隆形成，克隆形成率为33.33％；在培养体系3中第1代和第2代PGCs有AKP阳性克隆形成，克隆形成率分别为40％和20％；在培养体系4中有1-5代PGCs的AKP阳性克隆形成，克隆形成率分别为80％、66.67％、46.67％、26.67％和13.33％。在各个培养体系中，各代间AKP阳性克隆形成率差异极显著(P＜0.01)。说明使用CEF饲养层和富含细胞因子的培养液对PGCs进行体外长期培养，是非常合适的。
权利要求
1.一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法，其特征在于将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上，再使用培养液进行培养；所述培养液为在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15-20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10-15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL-11、10ng/mlIGF、100U/ml硫酸庆大霉素。
全文摘要
一种禽类原始生殖细胞的体外培养方法，涉及转基因，动物克隆，珍稀动物的保存及组织与细胞工程等领域。将禽类原始生殖细胞接种到CEF饲养层上，再使用在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％的鸡血清、2mmol/L L－谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸纳、5.5×10－5mol/L β－巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、15－20ng/ml hSCF、10U/ml mLIF、10－15ng/ml bFGF、0.04ng/ml hIL－11、10ng/ml IGF、100U/ml硫酸庆大霉素的培养液进行培养。本发明操作简便，可重复性强，为利用鸡原始生殖细胞进行体外操作和鸡胚胎PGCs的进一步建系奠定研究基础。
文档编号C12N5/06GK1821389SQ20061003860
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月2日 优先权日2006年3月2日
发明者李碧春, 秦洁, 孙鹏翔 申请人:扬州大学