专利名称：鸡胚原始生殖细胞的玻璃化冷冻方法
技术领域：
本发明涉及对发育至第19期(孵化约3天)和第28期(孵化约5.5天)鸡胚性腺原始生殖细胞进行玻璃化冷冻保存的方法。
背景技术：
玻璃化冷冻法是1985年由Rall和Fahy首先提出的一种超快速冷冻方法，玻璃化冷冻的基本原理是在细胞冷冻过程中添加高浓度的冷冻保护剂，固化脱水后直接投入液氮中，通过快速降温，形成玻璃态，避免细胞内外冰晶损伤，并以这种玻璃态在低温下保存。尽管玻璃化冷冻保存在低温保存技术和低温生物学研究中起步较晚，但由于其良好的冷冻效果和潜在的发展前景而倍受关注，进展较快。至今，玻璃化冷冻保存已经成功地应用于哺乳动物卵母细胞、淋巴细胞和胚胎，对皮肤、血管等组织也开展了玻璃化冷冻保存研究，人卵母细胞、人胚胎玻璃化冷冻保存也已经获得成功。然而，在禽类遗传资源保存方面，关于玻璃化冷冻法的研究在国内尚未有报道。禽类遗传物质传统的保存形式主要有(1)活体保存，(2)精液冷冻保存，(3)DNA形式的保存(cDNA文库、核苷酸序列数据库等)，(4)胚胎的冷冻保存。其中，活体保存是遗传物质保存的最可靠方式，但受资金、地方性疾病、近交衰退等因素限制；精液冷冻保存，作为有效的种质保存方式，仅是保存了成年公禽的基因组，而且复苏后精液受精率较低(50％～70％)；以DNA形式保存的遗传物质，也只是特定基因或整个染色体组的一小部分；而禽类受精卵体积较大且含有大量卵黄，难以冷冻保存。
原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)，是成熟配子(精子、卵子)的前体细胞，在体内或体外可诱导分化成有功能的配子，与精子、卵子相比，PGCs含有的遗传信息更完整。在体外，PGCs细胞可以作为外源基因的载体，在性腺嵌合体的制备、转基因动物生产、基因组印迹等研究中具有广阔的应用前景。禽类原始生殖细胞迁移规律的深入研究，使得禽类PGCs的分离提取和体外操作成为可能。目前，慢速冷冻法保存鸡胚PGCs细胞已经获得成功，但慢速冷冻法在操作过程中需长时间平衡和逐渐降温，不便操作。
发明内容
本发明目的在于提供一种操作简单、快捷的鸡胚PGCs细胞玻璃化冷冻保存方法。
本发明将鸡胚原始生殖细胞(PGCs)加入玻璃化冷冻液后，移入冷冻管，于4℃±1℃下平衡5min±0.5min，液氮面上静置1min±0.5min，最后，直接投入液氮。
本发明研究了玻璃化冷冻法的保存效应，建立了操作简单、快捷的鸡胚PGCs细胞玻璃化冷冻保存体系，为其它禽类PGCs细胞玻璃化冷冻体系的建立提供理论依据，进而为禽类遗传资源多样性的保存提供另一可靠途径。同时，也可以为禽类PGCs细胞体外遗传操作提供细胞来源。
上述玻璃化冷冻液优选方案由5％～15％二甲基亚砜+5％～15％乙二醇+5％～15％聚乙烯吡咯烷酮+20％胎牛血清+基础培养液组成。复苏后活率可达到为84.15％。
图1为复苏后19期PGCs核型照片。
图2为复苏后28期PGCs核型照片。
图3为复苏后19期PGCs PAS染色照片。
图4为复苏后28期PGCs PAS染色照片。
图5为复苏后培养传至第1代的19期PGCs形成的集落照片。
图6为复苏后培养传至第1代的28期PGCs形成的集落照片。
具体实施例步骤1鸡胚PGCs的分离、提取在PGCs的两个聚集高峰期第19期(68-72h)、第28期(5.5d)分离PGCs。受精蛋孵化至第19期(孵化68～72h)，无菌采取鸡胚，用无钙镁的胎牛血清(PBS)清洗3次，在解剖显微镜下去其头尾，获取性腺发生部位组织块，PBS清洗3次，转移入三角瓶中，Trypsin-EDTA细胞消化液室温下消化3～4min，消化时用玻璃管轻轻吹打使其分散。以消化液用量的10％的FCS终止消化，100目网筛过滤，180g离心8min收集细胞。沉淀用0.1mL不含小牛血清的TCM-199培养液重新悬浮，移入含0.9mL浓度为16％Ficoll液的指形管(规格为2mL)中，混匀，形成浓度为14.4％的Ficoll与细胞混合液，再在其上缓缓加入0.2mL浓度为6.3％的Ficoll液，800g离心30min，PGCs聚集在14.4％与6.3％Ficoll层的交界处，吸取交界处富含PGCs的Ficoll液0.2mL到指形管中。加入1.5mL含10％小牛血清的TCM-199培养液，混匀，180g离心5min，重复此步骤2次。
步骤2玻璃化冷冻液的配制
DMSO即二甲基亚砜(Sigma)EG即乙二醇(Sigma)PVP即聚乙烯吡咯烷酮(Sigma)FBS即胎牛血清(杭州四季青)DMEM即基础培养液上述产品在一般的生物公司均可购得。
其中，玻璃化冷冻液配方I中，由5％～15％二甲基亚砜+5％～15％乙二醇+5％～15％聚乙烯吡咯烷酮+20％胎牛血清+基础培养液组成。
步骤3鸡胚PGCs的冷冻和复苏方法分离提纯后的PGCs细胞，离心收集细胞，细胞悬液分两步加入组成最终玻璃化冷冻液，调整细胞密度，移入冷冻管；4℃平衡5min，液氮面上静置1min，直接投入液氮。
(1)解冻液离心管(规格15ml)中加入10ml无血清DMEM，再缓慢加入2ml FBS于离心管底部，可见明显的分层，DMEM、FBS使用前37～38℃预热。
(2)液氮中冻存2周后，取出冷冻管，投入37～38℃水浴中，并迅速晃动，约2/3融解时即可取出，并继续晃动使其完全融解。细胞液从解冻液上层面缓慢加入，可见细胞下沉至DMEM和FBS分界面处，1000r/min离心5min，去上清(离心过程重复一次)，收集细胞，PGCs培养液悬浮细胞沉淀，台盼蓝染色计算细胞存活率，调整细胞密度，饲养层接种培养、传代。
步骤3鸡胚PGCs的培养传代接种PGCs至培养瓶中，培养液组成DMEM+10％FBS+5～10ng/mLhSCF+5～10UI/mL mLIF+5～10ng/mL bFGF。培养温度38.5℃，饱和湿度，5％的CO2浓度。
步骤4PGCS的鉴定(1)PAS染色收集PGCs细胞悬液，加入细胞悬液体积10％的固定液(75％酒精)，吹打均匀，1500r/min离心10min，弃上清，加入固定液，吹打均匀，固定30min，1500r/min离心10min，弃上清。重复此步骤一次，滴片。过碘酸酒精氧化10min，70％的酒精脱水15min，Schiff试剂染色15min，亚硫酸水分三缸洗三次，每次两分钟，除去非特异性染色，流水冲洗，干燥，观察拍照。
(2)形态学鉴定单个PGCs细胞较大，核偏中央，有的有伪足，细胞周围有明显的光环；克隆状PGCs细胞结合紧密，边缘整齐，细胞间界限不清。
(3)核型分析收集PGCs细胞悬液，1500r/min离心10min，收集细胞；加入0.4％的KCL低渗处理40min；加入固定液(预固定)，吹打，1500r/min离心10min，去上清液；加固定液(第一次固定)，吹打，重复一次(第二次固定)，1500r/min离心10min，去上清；加固定液，吹打，滴片。固定液(甲醇∶冰醋酸＝3∶1)，现配现用。
步骤5结果(1)玻璃化冷冻液10％DMSO+10％EG+10％PVP+20％FBS+DMEM最适合第19期和第28期PGCs的玻璃化冷冻保存，复苏后活率分别为84.15％和82.79％。
不同玻璃化冷冻液条件下PGCs复苏后活率(％)(n＝8)
注相同*之间表示差异显着(p＜0.05)，相同字母之间表示差异不显着(p＞0.05)(2)PGCs细胞具有正常的二倍体核型是其进行体外操作的重要前提条件。复苏后的PGCs仍保持正常的二倍体核型。如图1、2所示。
(3)PGCs细胞质中含有大量的糖原颗粒沉积，PAS(过碘酸雪夫特异性染色)可特异性地将PGCs染成品红色，复苏后的的第19期和第28期PGCs细胞PAS染色呈阳性，仍保持其特异性。如图3、4所示。
(4)PGCs细胞复苏后接种培养，在饲养层上保持正常的生长增殖行为，5.5～6天后，细胞集落中细胞排列紧密，呈典型的圆盘或椭圆状克隆。如图5、6所示。
本发明的优点1、操作简单、快捷，克服了常规慢速冷冻保存方法中需长时间平衡和逐步降温的特点；2、保存效果稳定、可靠，可以作为传统的禽类遗传资源保存方式的拓展。
权利要求
1.鸡胚原始生殖细胞的玻璃化冷冻方法，其特征在于将鸡胚原始生殖细胞加入玻璃化冷冻液后，移入冷冻管，于4℃±1℃下平衡5min±0.5min，液氮面上静置1min±0.5min，最后，直接投入液氮。
2.根据专利要求所述鸡胚原始生殖细胞的玻璃化冷冻方法，其特征在于所述玻璃化冷冻液由5％～15％二甲基亚砜+5％～15％乙二醇+5％～15％聚乙烯吡咯烷酮+20％胎牛血清+基础培养液组成。
全文摘要
鸡胚原始生殖细胞的玻璃化冷冻方法，涉及对发育至第19期(孵化约3天)和第28期(孵化约5.5天)鸡胚性腺原始生殖细胞进行玻璃化冷冻保存的方法。将鸡胚原始生殖细胞加入玻璃化冷冻液后，移入冷冻管，于4℃±1℃下平衡5min±0.5min，液氮面上静置1min±0.5min，最后，直接投入液氮。本发明操作简单、快捷，克服了常规慢速冷冻保存方法中需长时间平衡和逐步降温的特点，保存效果稳定、可靠，可以作为传统的禽类遗传资源保存方式的拓展。
文档编号C12N5/06GK1821393SQ20061003861
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者李碧春, 韩威 申请人:扬州大学