专利名称：早期诊断子宫颈癌微小转移灶的方法
技术领域：
本发明涉及早期诊断子宫颈癌微小转移灶的方法。
背景技术：
子宫颈癌是妇女常见的恶性肿瘤，发病呈现上升和年轻化趋势，死亡率高，死亡的主要原因是盆腔内局部复发。子宫颈癌的主要转移途径是直接浸润和淋巴转移，阴道、子宫旁组织、盆腔淋巴结是最常见的转移区域，标准的广泛全子宫切除和盆腔淋巴结清扫手术是其主要的治疗方法，但是手术若未将累及的微小转移癌灶完全切除，则成为术后复发之根源。显然，准确判断是否已经发生癌细胞转移，不仅有助于预测预后，更有助于指导术后是否需要采用及时的巩固治疗。
准确判断手术切缘或盆腔淋巴结有或无癌细胞至关重要，但是目前常规的病理检查方法对于微小转移癌灶尚不易发现。主要原因有1、常规的病理检查方法中无法辨别微量癌细胞的存在，转移之初，少数癌细胞散在粘附种植于组织之中，病理医师在为数有限的切片中判定癌细胞的存在如同大海捞针；2、病理医师不能对全部的阴道切缘组织、子宫旁切缘组织、以及全部的淋巴结进行连续切片、全面镜下观察，极可能造成取材不当而漏诊；3、病理医师的制片技术、阅片技术和工作态度等均是影响准确诊断的因素。
上述原因的存在，极大地限制了对于该疾病的转移的早期诊断。
发明内容
本发明是为避免上述现有技术所存在的不足，提供一种早期诊断子宫颈癌微小转移灶的方法，为预测子宫颈癌术后的愈后情况、指导术后是否需要采用及时的巩固治疗提供了可靠的参考依据。
本发明解决技术问题所采用的技术方案为本发明方法的特点是将子宫颈癌手术中子宫旁切缘组织、阴道切缘组织和盆腔淋巴结分别制成细胞匀浆并充分混匀，利用HCII检测细胞匀浆中的HPV(human papillomavirus，人乳头瘤病毒)的亚型及载量、利用RT-PCR方法检测细胞匀浆中的端粒酶活性，两种检测结果均为阳性，则判定子宫颈癌微小转移灶的存在。
本发明方法可以按如下步骤进行操作a、子宫颈癌手术中，在广泛切除的子宫边缘分别剪下阴道切缘组织、子宫旁左侧切缘组织、子宫旁右侧切缘组织各1g；左侧盆腔淋巴结、右侧盆腔淋巴结各取5～8个，所有标本均放置在已经标记好的EP管中，将标本用1×PBS洗涤，每个EP管中补加1×PBS 500μl，将组织剪碎制成悬液，每个EP管中取10μl移入新的EP管中并充分混匀，将该EP管中充分混匀的组织悬液分为两等份一份放置到HC II裂解液中，一份提取RNA；b、对HCII裂解液标本，进行HPV检测，通过组织中的DNA同时检测13种高危型HPV，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，检测到任何一种类型均判定结果为阳性；c、将提取的RNA取1μg，进行cDNA的逆转录，将逆转录产物5倍稀释，取5μl通过荧光定量PCR检测组织中的端粒酶活性；若CT(Cycle threshold，阈值)≤38、端粒酶活性增高，判定结果为阳性；d、上述步骤b、c中的结果均为阳性则判定子宫颈癌微小转移灶的存在。
HPV是人类癌症发病中可以完全确认的致癌病毒之一。几乎100％子宫颈癌细胞中可以检测到HPV的存在，HPV主要以整合状态存在于子宫颈癌细胞中，并且随着子宫颈癌细胞的增殖而存在于新生的癌细胞中，显然，转移的子宫颈癌细胞中也同样携有整合在DNA中的HPV，因此，HPV可以作为转移的子宫颈癌细胞的标志物。同时，由于HPV具有嗜粘膜的特性，子宫旁等“高危区域”组织不易感染HPV，所以，如果该区域组织中检测出HPV的存在，则很可能来源于转移的子宫颈癌细胞。简言之，整合到癌细胞的HPV几乎就是癌细胞的分子标志，通过检测子宫颈癌转移高危区域组织中HPV，可以间接预测残存微量癌细胞的存在，弥补病理诊断之不足。由于HPV的致癌机制主要与其激活端粒酶有关，而端粒酶的激活是HPV感染后导致子宫颈上皮内瘤变和子宫颈癌的关键步骤，随着子宫颈癌前病变的进展，端粒酶的阳性表达率亦升高。因此HPV的检测结果还需要辅以端粒酶活性的检测结果，联合检测更有助于准确判断微小转移癌细胞的存在。
与已有技术相比，本发明具备如下优点1、本发明将HC II技术应用于早期诊断子宫颈癌“危险区域”组织中微小转移灶，具有理论基础，经临床验证技术完全可行。应用RT-PCR技术检测端粒酶活性也是已经成熟的技术，并且市场上有成品试剂盒出售，因此，HPV和端粒酶联合检测判定微小转移癌细胞的存在完全可行。
2、本发明是对所获取的阴道切缘组织、子宫旁切缘组织、盆腔淋巴结，在病理取材后，其余全部制成组织悬液混匀，取少量悬液检测HPV、端粒酶，因此，检测的标本具有全面性和代表性，提高了诊断的敏感性和准确性。
3、本发明根据HPV在子宫颈癌发病机制中关键性作用，利用HC II敏感、特异检测HPV的优势，预测子宫颈癌手术切缘或盆腔淋巴结组织中微小癌灶的存在，有效弥补了病理诊断的不足。
4、本发明根据子宫颈癌发病机制与端粒酶激活的密切相关性，利用RT-PCR方法检测端粒酶的活性，预测子宫颈癌手术切缘、淋巴结中微量癌细胞的存在，结合HPV的结果，极大地提高了诊断的准确性。
附图为本发明荧光定量RT-PCR方法检测组织悬液中的端粒酶活性。
图中a为组织悬液、b为阳性对照、c为阴性对照以下通过具体实施方式
对本发明作进一步描述实施例1患者，女，39岁，因阴道接触性出血入院，病理诊断为“子宫颈癌IIA期”，手术行“广泛性子宫切除术及盆腔淋巴结清扫术”。
检测步骤操作如下1、组织悬液的制取术中将切下来的子宫边缘分别剪下阴道切缘组织、子宫旁左侧切缘组织、子宫旁右侧切缘组织各1g；左侧盆腔淋巴结、右侧盆腔淋巴结各取5～8个，所有标本均放置在已经标记好的EP管中，将标本用1×PBS洗涤2次，每个EP管中补加1×PBS 500μl，将组织充分剪碎制成悬液，每个EP管中取10μl移入新的EP管中并充分混匀，将该EP管中充分混匀的组织悬液分为两份一份放置到HC II裂解液中，一份提取RNA；2、HCII检测组织悬液中的HPV①加5滴指示剂于裂解液中并充分混匀；②加1000ul裂解液至阴性对照，换盖，混匀；加500ul裂解液至阳性对照，换盖，混匀；加500ul裂解液至标本，换盖，混匀；③水浴65℃45分钟，各管均呈紫色；④换手套，配备HPV Probe b(0.32ml探针稀释液与12.8ul探针b充分混匀)；⑤先吸25μl已配好的探针b(Probe b)至96孔微孔板；吸75μl已裂解的质控及标本至各孔；贴上胶纸并放于振荡器1100转/分钟，3分钟；检查所有孔变成黄色；放于加热器65℃孵化60分钟；立刻撕去胶纸，放置5分钟冷却。⑥将各孔液体(100μl)转移至捕获孔，贴上胶纸；离心1100转/分钟60分钟；弃上清，在吸水纸上用力拍打扳至干；⑦吸75μl DR1(Detection Reagent 1)至各孔，盖上胶纸；在20-25℃放置30分钟；用吸水纸覆盖，快速翻转倒掉液体，用力拍打于纸上至于；⑧冲洗6次(垂直冲至底部，要有一定冲力)；于吸水纸上用力拍打，并置于纸上5分钟至干，换手套；吸75μl DR2(DetectionReagent 2)至各孔；.置于黑暗处20-25℃15分钟；在DML2000系统上判读，分析演绎结果，检测值为32.35pg/ml，(正常值为0-1pg/ml)，判定为阳性。
3、RT-PCR方法检测组织悬液中的端粒酶活性提取RNA1ml Trizol充分裂解组织悬液，然后加入氯仿200μl抽提1次，12000转/分钟离心15分钟，取上清，用0.5ml异丙醇沉淀，75％乙醇洗2次，干燥后用DEPC处理的无菌去离子水溶解RNA。紫外分光光度仪测定其浓度。
将提取的RNA取1μg，以Oligo(dT)为起始引物，加入定量好的RNA 2μg，72℃水浴10分钟，冰浴5分钟，依次加入无核酶水、2μ1 10×RT缓冲液、4μl 25mM Mgcl2、2μl250μM dNTPs、15U RNA酶抑制剂和200U AMV逆转录酶，反应体系为20μl，42℃水浴60分钟，加去离子水至100μl，以此做模板进行PCR反应，取5μl做模板，分别取上述RT反应管中的RT产物及参比品2μl，加入PCR反应液23μl。在PE7700PCR热循环仪上设定如下程序
在PE7700定量PCR仪上，选定检测荧光为FAM；在FTC-2000上“Dye selection”选项中选“1”，并在PCR循环第二步61℃时收集荧光数据。参比品分别设定为400，40，4，0.4pg/ml，用于获得标准曲线，以便推导各检测标本的浓度。阈值设定以刚好高于阴性对照品的扩增曲线最高点，结果组织悬液中的CT＝30，(CT≤38为阳性)。判定结果为阳性。
4、结果判定HPV阳性、端粒酶活性为阳性。患者存在微小转移灶，需要进一步放疗、化疗。
权利要求
1.早期诊断子宫颈癌微小转移灶的方法，其特征是将子宫颈癌手术中子宫旁切缘组织、阴道切缘组织和盆腔淋巴结分别制成细胞匀浆并充分混匀，利用二代杂交捕获(HCII)检测细胞匀浆中的HPV的亚型及载量、利用RT-PCR方法检测细胞匀浆中的端粒酶活性，两种检测结果均为阳性，则判定子宫颈癌微小转移灶的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是按如下步骤操作a、子宫颈癌手术中，在广泛切除的子宫边缘分别剪下阴道切缘组织、子宫旁左侧切缘组织、子宫旁右侧切缘组织各1g；左侧盆腔淋巴结、右侧盆腔淋巴结各取5～8个，所有标本均放置在已经标记好的EP管中，将标本用1×PBS洗涤，每个EP管中补加1×PBS 500μl，将组织剪碎制成悬液，每个EP管中取10μl移入新的EP管中并充分混匀，将该EP管中充分混匀的组织悬液分为两等份一份放置到HCII裂解液中，一份提取RNA；b、对HCII裂解液标本，进行HPV检测，通过组织中的DNA同时检测13种高危型HPV，包括16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59和68型，检测到任何一种类型均判定结果为阳性；c、将提取的RNA取1μg，进行cDNA的逆转录，将逆转录产物5倍稀释，取5μl通过荧光定量PCR检测组织中的端粒酶活性；若CT≤38、端粒酶活性增高，判定结果为阳性；d、上述步骤b、c中的结果均为阳性则判定子宫颈癌微小转移灶的存在。
全文摘要
早期诊断子宫颈癌微小转移灶的方法，其特征是将子宫颈癌手术中子宫旁切缘组织、阴道切缘组织和盆腔淋巴结分别制成细胞匀浆并充分混匀，利用HC II检测细胞匀浆中的HPV的亚型及载量、利用RT－PCR方法检测细胞匀浆中的端粒酶活性，两种检测结果均为阳性，则判定子宫颈癌微小转移灶的存在。本发明诊断方法敏感、准确，可以早期诊断子宫颈癌微小转移灶，实验结果对判定临床的预后、进一步治疗提供了可靠的依据。
文档编号C12Q1/25GK1850990SQ20061003864
公开日2006年10月25日 申请日期2006年3月3日 优先权日2006年3月3日
发明者凌斌, 周颖, 许恬怡, 赵卫东, 陈峥峥, 姚凤球, 沈国栋, 冯定庆, 高婷, 石永云, 王梅梅, 陈敏, 朱园园 申请人:安徽省立医院