专利名称：漆酶高产菌的快速筛选方法
技术领域：
本发明涉及一种真菌选育方法，具体涉及一种漆酶高产菌菌种快速高效筛选方法。
背景技术：
漆酶(EC1.10.3.2)是一类活性中心含有铜原子的氧化还原酶，主要由高等植物和真菌产生。由于其作用底物极为广泛，已经被应用于造纸工业、印染工业、食品工业等。由于漆酶可以作用于一些具有酚类结构的有机化合物，因此在环境及土壤修复领域也有很强的应用潜力。由于真菌具有生长快、来源广、易培养以及漆酶提取方便等优势，已成为漆酶生产的主要材料，但目前制约漆酶实际应用的主要因素是生产成本较高，对漆酶高产菌的筛选是降低生产成本的重要方法之一。
目前漆酶高产菌的筛选方法，一般是首先分离获得具有漆酶活性的菌株，然后通过单因子试验确定漆酶高产的影响因子，再利用多因子试验确定最佳产酶条件，从而鉴定漆酶的产酶活性。这种方法，一方面由于影响产酶的因素很多，试验中往往不能对所有因子进行测定，造成结果的偏差；另一方面，由于对逐个因子进行测试，工作量大，试验周期长，不利于从大量候选菌株中迅速获得漆酶高产菌。
发明内容
为了克服现有筛选方法易导致结果偏差及工作量大和周期长的不足，从大量候选菌株中筛选漆酶高产菌，本发明将提供一种筛选高产漆酶真菌的快捷方法，不仅大大减少了试验的次数，而且可以确定不同因素作用下菌株产酶的能力，最终通过对优化培养条件下漆酶产量的比较，获得高产的漆酶产生菌。
本发明是基于部分析因试验设计思路，对自然界具有产漆酶活性潜力的真菌在特殊培养基上进行分离培养，并确定其在优化产酶条件下的产酶活性，快速获得漆酶高产菌。
本发明采用的筛选技术方案为，菌株漆酶活性平板显色鉴定——组合试验鉴定优化培养条件下的菌株产酶能力，即漆酶高产菌的快速筛选方法，步骤如下采用含愈创木酚(Guaiacol)的PDA培养基对菌种进行培养；培养基变为铁红色后，进行组合培养试验，试验步骤是选择对提高产酶活性具有关键作用的因子中的1-2个代表物质或条件，设计若干个PB培养基组合，对菌种进行培养；培养过程中，每24小时测定一次培养液中的漆酶活性，共进行7天；对每个组合进行试验后获得的最高漆酶活性进行方差分析，获得每个因子的p值；根据p值的大小可以估计该因子对菌株产漆酶的影响。
更优化和更具体地说，本发明的步骤是采用含愈创木酚(Guaiacol)的PDA培养基对菌种进行培养，具体方法在含有0.02％愈创木酚的PDA鉴定平板上接入菌种，28℃静置培养4-5天。
所述的PDA鉴定培养基是18～22％马铃薯浸出汁(马铃薯去皮切块加水，煮沸30min，用纱布过滤，下同) 100毫升蔗糖 1.5～2.5克琼脂 1.2％～2.5克愈创木酚 0.01～0.03克。
培养条件恒温28℃静置培养4-5天。
对于该PDA鉴定培养基，本申请推荐以下比例20％马铃薯浸出汁 100毫升蔗糖 2克琼脂 1.5-2克愈创木酚 0.02克。
经过上述方法的培养，具有漆酶活性的菌株将使PDA鉴定培养基变为铁红色，从而可以直接观察确定具有漆酶活性的真菌菌株。
在确定具有漆酶活性的菌株后，设计一个组合培养试验，可以快速确定对菌株在优化培养条件下的漆酶产量。通过文献检索分析，我们发现在真菌液态培养中对提高产酶活性具有关键作用的因子有以下几类1、碳源和氮源的比例和浓度；2、二价金属离子，如Cu2+和Mn2+；3、具有苯环结构的小分子的有机物，如愈创木酚和藜芦醇；4、一些氨基酸类物质，如天冬酰胺；5、乙醇；6、供氧情况。这些因子对不同的菌株可能有不同的作用，因此需要全面考察其对特定菌株的产酶影响。从成本角度，氨基酸类物质在工业生产中的应用可能性较小，不予考虑。因此，选择其余五类因素中的1-2个代表物质或条件，基于部分析因试验设计思路，共设计12个PB培养基组合，如下表。
表1潜在产漆酶菌培养组合方案
其中“氧”一栏中，0代表静置培养，1代表振荡培养。A、B、C、D系设计的伪变量，用于计算试验可信度。培养条件为28℃，静置或振荡(180转/分钟)培养。
培养过程中，每24小时测定一次培养液中的漆酶活性，共进行7天。漆酶活性测定采用一个1厘米光程的比色皿，依次加入1.8mL的B&R缓冲液、0.1mL的30mM ABTS[2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6磺酸)]水溶液、0.1mL培养上清液，混合均匀后在40℃温育5分钟，使用分光光度计每隔1分钟测定420nm处的吸收值，取线性部分计算。
B&R缓冲液的组成是0.1mol/L硼酸，0.1mol/L醋酸，0.1mol/L磷酸，使用0.5mol/L的NaOH调节pH至4.0。
漆酶活性的计算公式为 式中，ΔA420指420nm处吸光值每分钟的变化值。
使用适当的统计学软件，对每个组合进行试验后获得的最高漆酶活性进行方差分析，获得每个因子的p值。根据p值的大小可以估计该因子对菌株产漆酶的影响。12个培养组合中，漆酶活性最高的一个组合为菌株产酶的优化培养条件，该组合的产酶量为该菌株的产酶能力，比较多个菌种的产酶能力即可获得高产的漆酶产生菌种。
本发明克服了现有筛选方法易导致结果偏差及工作量大和周期长的不足，本发明的方法不仅大大减少了试验的次数，而且可以确定不同因素作用下菌株产酶的能力，最终通过对优化培养条件下漆酶产量的比较，获得高产的漆酶产生菌。
图1为漆酶高菌快速筛选方法中各影响因子效应图。
图中●表示效应不显著，■表示效应显著。
具体实施例方式
实施例1，对一株从土壤中分离所得真菌WF-10产漆酶能力的鉴定将菌株接种到含0.02％愈创木酚的PDA鉴定平板上，恒温28℃静置培养5天后，观察到菌落生长处的培养基颜色由原有的乳白色变为铁红色，因此可以确定该菌种具有产生漆酶的能力。
根据表1，配制相应培养基，每个组合安排3个重复，试验后获得的数据为
显然，试验号11的漆酶产量最高，取29.4U/L为该菌株的产漆酶能力，用于确定高产菌株的比较。对以上试验结果进行多因素的方差分析，结果如下表
从上表可以看出，葡萄糖、豆粕粉、愈创木酚、乙醇和氧的p值均小于0.05，对漆酶的产量具有显著的影响，其中葡萄糖和愈创木酚体现出负效应，乙醇、豆粕粉、氧体现出正效应。而CuSO4和MnSO4对漆酶的产生没有显著影响。伪变量A、B、C、D均无显著影响，这也符合伪变量的定义，说明本试验的结果是可信的。具体结果如附图。
权利要求
1.一种漆酶高产菌的快速筛选方法，步骤如下采用含愈创木酚的PDA培养基对菌种进行培养；培养基变为铁红色后，进行组合培养试验，试验步骤是选择对提高产酶活性具有关键作用的因子中的1-2个代表物质或条件，设计若干个PB培养基组合，对菌种进行培养；培养过程中，每24小时测定一次培养液中的漆酶活性，共进行7天；对每个组合进行试验后获得的最高漆酶活性进行方差分析，获得每个因子的p值；根据p值的大小可以估计该因子对菌株产漆酶的影响。
2.按照权利要求1所述的漆酶高产菌的快速筛选方法，其特征在于，具体步骤是所述的用含创木酚的PDA培养基对菌种进行培养方法是在含有0.02％愈创木酚的PDA鉴定平板上接入菌种，28℃静置培养4-5天，所述的PDA鉴定培养基是18～22％马铃薯浸出汁100毫升蔗糖1.5～2.5克琼脂1.2％～2.5克愈创木酚0.01～0.03克，培养条件恒温28℃静置培养4-5天；经过上述方法的培养，具有漆酶活性的菌株将使PDA鉴定培养基变为铁红色，从而可以直接观察确定具有漆酶活性的真菌菌株；进行组合培养试验中所述的“对提高产酶活性具有关键作用的因子”有碳源和氮源的比例和浓度；二价金属离子；具有苯环结构的小分子的有机物；氨基酸类物质；乙醇；供氧情况，共设计12个PB培养基组合，如下表表1潜在产漆酶菌培养组合方案
其中“氧”一栏中，0代表静置培养，1代表振荡培养，A、B、C、D系设计的伪变量，用于计算试验可信度，培养条件为28℃，静置或振荡培养；培养过程中，每24小时测定一次培养液中的漆酶活性，共进行7天；漆酶活性测定采用一个1厘米光程的比色皿，依次加入1.8mL的B&R缓冲液、0.1mL的30mM ABTS[2，2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6磺酸)]水溶液、0.1mL培养上清液，混合均匀后在40℃温育5分钟，使用分光光度计每隔1分钟测定420nm处的吸收值，取线性部分计算；B&R缓冲液的组成是0.1mol/L硼酸，0.1mol/L醋酸，0.1mol/L磷酸，使用0.5mol/L的NaOH调节pH至4.0；漆酶活性的计算公式为 式中，ΔA420指420nm处吸光值每分钟的变化值；对每个组合进行试验后获得的最高漆酶活性进行方差分析，获得每个因子的p值；根据p值的大小可以估计该因子对菌株产漆酶的影响。
3.按照权利要求2所述的漆酶高产菌的快速筛选方法，其特征在于，所述的PDA鉴定培养基组成是20％马铃薯浸出汁100毫升蔗糖2克琼脂1.5-2克愈创木酚0.02克。
全文摘要
漆酶高产菌的快速筛选方法采用含愈创木酚的PDA培养基对菌种进行培养；培养基变为铁红色后，进行组合培养试验，步骤是选择对提高产酶活性具有关键作用的因子中的1－2个代表物质或条件，设计若干个PB培养基组合，对菌种进行培养；培养过程中，每24小时测定一次培养液中的漆酶活性，共进行7天；对每个组合进行试验后获得的最高漆酶活性进行方差分析，获得每个因子的p值；根据p值的大小可以估计该因子对菌株产漆酶的影响。本发明克服了现有筛选方法易导致结果偏差及工作量大和周期长的不足；不仅大大减少了试验的次数，而且可以确定不同因素作用下菌株产酶的能力，最终通过对优化培养条件下漆酶产量的比较，获得高产漆酶产生菌。
文档编号C12Q1/04GK1858236SQ20061003935
公开日2006年11月8日 申请日期2006年4月7日 优先权日2006年4月7日
发明者吴宇澄, 骆永明, 李振高, 滕应 申请人:中国科学院南京土壤研究所