专利名称：中国桔梗四倍体的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种植物培育方法，尤其是在离体条件下进行植物细胞染色体加倍诱导及快速繁殖培养的方法，属于生物技术育种领域。
背景技术：
中国桔梗(Platycodon grandiflorus A.DC)属于桔梗科(Campanulaceae)桔梗属(Platycodon A.DC)多年生草本植物，原产我国东北、华北、华东、华中各省以及广东、广西北部、贵州、云南东南部(蒙自、砚山、文山)、四川(平武、凉山以东)、陕西。朝鲜、日本、苏联的远东和东西伯利亚地区的南部也有(洪德元等1983)。桔梗具有药用价值，其根入药，具有清肺利目、咽嗌、祛痰，止咳、消痛散结等作用，同时又具食用价值，是朝鲜族及国外制作酱菜的原料。此外，桔梗更具观赏价值，其花色淡雅，花期长，抗逆性强，管理简便，被广泛应用于园林中，同时也被用作切花或盆栽材料。目前，国内外均侧重于对桔梗药用有效成分的分析，以及通过杂交育种改变桔梗花色方面的研究。野生桔梗有紫花、白花和黄花类型，经人工自花授粉，获得了淡红色桔梗，也通过将不同地区的桔梗进行杂交，培育出了粉花型桔梗，两者皆具观赏价值。
植物染色体组的多倍化是推动植物进化的一个重要因素，是物种形成的重要途径之一。多倍体因其自身具备的巨大性、低孕型、抗逆性及克服远缘杂交的不育性等特点而被园艺育种专家所青睐，自20世纪30年代开始，现已育成多倍体金鱼草、百日菊、四季报春、麝香百合、凤仙、郁金香、大丽菊等花卉品种，且大多表现为叶片肥厚、花色艳丽、花期长、花瓣多等特点，使其观赏价值得到了提高。国内已有用桔梗愈伤组织进行多倍体诱导，以期培育出药用价值较高品种的研究，但未见在利用野生桔梗进行引种驯化选育的基础上，采用秋水仙素对其试管苗的茎尖进行多倍体诱导，以培育观赏型多倍体桔梗的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种中国桔梗四倍体的培育方法，使之在短期内获得观赏价值较高的新型花卉品种。
本发明以云南特色野生花卉中国桔梗为育种材料，采用离体快繁和秋水仙碱处理相结合的方法，进行多倍体诱导培养，以期在短期内获得观赏价值较高的花卉品种。
本发明通过下列技术方案实现一种中国桔梗四倍体的培育方法，其特征在于经过下列步骤1、切取中国桔梗单株上健壮的幼芽，用自来水清洗干净，放入浓度为0.05～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中浸泡处理10～20分钟，之后再放入浓度为1～2％的次氯酸钠溶液中浸泡处理8～15分钟，用无菌水冲洗2～3次后，在无菌条件下，将灭菌后的切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1～0.3mg/L激动素(KT) 0.05～0.1mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.3mg/L
蔗糖30000mg/L琼脂4500mg/LpH 5.5～5.8在光照10～12h/d，光强800～1200Lx，温度22～26℃的环境条件下，培养20～30d，使不定芽自切口处直接生成；2、将生成的不定芽丛分切，在与步骤1相同的培养条件下继代培养，经3～4次继代后获得无性系无菌植株；3、将嫩茎按每段0.5cm且带一个节截取，并将每节两个叶片去半，然后用浓度为0.05～0.1％的秋水仙碱浸泡处理10～72h，处理后用无菌水漂洗2～3次，接种到与步骤1相同的培养基上，并在与步骤1相同的培养条件下培养后，得叶片宽大，叶色深，茎粗且节距长的四倍体植株。
本发明使用的处理液的浓度单位为质量比浓度。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果本发明在对野生中国桔梗引种驯化研究的基础上，参考蔬菜、水果以及其它园艺植物的多倍体育种技术，对中国桔梗离体茎尖采用秋水仙碱处理诱导，不仅诱导率高，而且使不定芽变异十分明显，变异芽粗壮矮小，从而获得较好的效果，同时本发明采用不定芽组培快繁技术，在短时间内稳定并扩繁了四倍体桔梗植株，加快了其育种进程，可选育出观赏价值较高或利用价值较好的多倍体中国桔梗种质。按本发明方法获得的桔梗多倍体组培苗叶片较二倍体叶片明显大而厚，叶色深，生长快，出瓶植株健壮，初步体现了多倍体在形态上的优势。
具体实施例方式
为了更好地说明本发明的实质内容，下面给出本发明的实施例，但本发明的内容并不仅限于这些。
实施例11、切取经驯化栽培的野生中国桔梗单株上健壮的幼芽，用自来水清洗干净，放入浓度为0.1％的升汞(Hgcl2)溶液中浸泡处理20分钟，之后再放入浓度为2％的次氯酸钠溶液中浸泡处理12分钟，用无菌水冲洗3次后，在无菌条件下，将灭菌后的切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1mg/L激动素(KT) 0.05mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖30000mg/L琼脂4500mg/LpH 5.5在光照12h/d，光强1200Lx，温度25℃的环境条件下，培养20d，使不定芽自切口处直接生成；2、将生成的不定芽丛分切，放入下列培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1mg/L激动素(KT) 0.05mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖30000mg/L琼脂4500mg/L
pH 5.5在光照12h/d，光强1200Lx，温度25℃的环境条件下，继代培养20d，经3次继代后获得无性系无菌植株；3、将嫩茎按每段0.5cm且带一个节截取，并将每节两个叶片去半，然后用秋水仙碱浸泡处理，秋水仙碱的浓度为0.1％，处理时间为40h，处理后用无菌水漂洗3次，接种到下列培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.1mg/L激动素 (KT)0.05mg/L萘乙酸(NAA) 0.1mg/L蔗糖30000mg/L琼脂4500mg/LpH 5.5在光照12h/d，光强1200Lx，温度25℃的环境条件下，培养20d，经多倍体鉴定筛选，纯化后可得叶片宽大，叶色深，茎粗且节距长的四倍体植株。
实施例21、切取中国桔梗单株上健壮的幼芽，用自来水清洗干净，放入浓度为0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中浸泡处理10分钟，之后再放入浓度为1％的次氯酸钠溶液中浸泡处理15分钟，用无菌水冲洗2次后，在无菌条件下，将灭菌后的切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.3mg/L
激动素(KT) 0.1mg/L萘乙酸(NAA)0.3mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 4500mg/LpH 5.8在光照10h/d，光强800Lx，温度22℃的环境条件下，培养30d，使不定芽自切口处直接生成；2、将生成的不定芽丛分切，放入下列培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.3mg/L激动素(KT) 0.1mg/L萘乙酸(NAA) 0.3mg/L蔗糖30000mg/L琼脂4500mg/LpH 5.8在光照10h/d，光强800Lx，温度22℃的环境条件下，继代培养30d，经4次继代后获得无性系无菌植株；3、将嫩茎按每段0.5cm且带一个节截取，并将每节两个叶片去半，然后用秋水仙碱浸泡处理，秋水仙碱的浓度为0.05％，处理时间分别为72h。处理后用无菌水漂洗3次，接种到下列培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA)0.3mg/L激动素(KT) 0.1mg/L
萘乙酸(NAA)0.3mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 4500mg/LpH 5.8在光照10h/d，光强800Lx，温度22℃的环境条件下，培养30d，经多倍体鉴定筛选，纯化后可得叶片宽大，叶色深，茎粗且节距长的四倍体植株。
实施过程中多倍体的鉴定方法如下在初期阶段采用形态学方法鉴定，在后期采用细胞学方法鉴定，在鉴定过程中特别注意鉴定材料的分离和标识。
形态学鉴定对经过秋水仙碱处理的外植体在培养基上培养一段时间所形成的植株，待长出2-3轮叶片后，撕取其叶下表皮制片，用显微镜观测气孔的大小及单位面积内气孔的数量变化并拍照，然后与二倍体植株的相应数据进行对比分析。
细胞学鉴定分离气孔显著增大的植株，并进行单独扩繁培养。待植株长出2-3轮叶片时，在早上8:00-9:00切取幼嫩芽尖，用自来水洗净，10-20℃下0.002％8-羟基喹啉溶液预处理2-3h，无水乙醇-冰醋酸(3∶1)置4℃冰箱中固定2h，蒸馏水漂洗3次，每次10min，60℃水浴中0.2mol/L盐酸离析5min，蒸馏水后低渗30min，小心切取芽尖，置载玻片中央，加卡宝品红1滴，染色30min后，压片，镜检并拍照。然后与二倍体植株的相应数据进行对比分析。染色体核型分析按李懋学和张赞平的方法(1996)进行，核型不对称性按Stebbins GL(1971)的标准划分。
多倍体的纯化扩繁对发现有加倍的嵌合体植株采用分割技术进行纯化，再对确认为纯化了的多倍体植株予以稳定并扩繁。
本发明着重对秋水仙碱处理的中国桔梗离体不定芽诱导步骤中的关键因素进行了研究。具体对组织培养条件下秋水仙碱对中国桔梗的诱导效果、中国桔梗诱导变异植株的形态学观察、多倍体的细胞学鉴定等开展了试验研究，其结果报告如下1.试验材料经驯化栽培的野生中国桔梗优良单株2.方法与结果外植体的选择、灭菌、多倍体诱导及鉴定的整个环节同实施例，重点研究了多倍体的诱导和四倍体植株的筛选方法。
(1)组织培养条件下秋水仙碱对中国桔梗的诱导效果试验结果见表1，其变异指标以气孔增大为标准。从表中可看出，秋水仙素对桔梗多倍体的诱导有一定的效果。数据显示药剂浓度为0.1％，处理时间为40hr的效果最佳，变异率可达50％。但随着秋水仙素浓度的增高，组培材料的死亡率也上升，总诱导率下降。这里所指的死亡率是指培养一个月后仍不能发芽的畸形体，呈透明状，特别粗大，以后逐渐死亡。试验过程中发现培养基中琼脂浓度为3.5g/L，比正常琼脂浓度4.5g/L稍低。这样，能提高诱变材料的成活率和方便进行细胞学鉴定。
(2)变异植株的形态学观察与对照株比较，经秋水仙素处理的植株中，形态上明显发生变异的植株的叶片比二倍体的叶片大而且厚，颜色也较深，茎粗且节距长，生长旺盛。我们选择以观察其气孔来研究其形态指标，发现变异株气孔明显增大，单位面积上气孔数目减少。由此可认为，气孔明显增大是桔梗多倍体的形态特征，可作为其形态学上的标志(表2)。
表1 秋水仙素对中国桔梗的诱导效应
表2 变异株与二倍体植株的外部形态比较
注均取基部第2片叶，气孔面积s(平均值)＝3.14×长径(平均值)×短径(平均值)，样本数为20。
(3)多倍体的细胞学鉴定经细胞学观察，中国桔梗的体细胞染色体数目为2n＝18，基数x＝9，核型公式为2n＝2x＝7m+10sm+1st，核型属于2B(表3)。其中第1对，第2对，第7对两条同源染色体都为近中着丝点(sm)；第8，9对两条同源染色体都为中部着丝点(m)；第3，4，5对同源染色体中有一条染色体为m中部着丝点，另一条为sm近中着丝点；第6对同源染色体中有一条为sm近中着丝点，另一条为st近端着丝点。这几对不同型的同源染色体可能是染色体臂间臂内倒位和互换发生变异造成的结果。经加倍诱导后形成的变异植株的体细胞染色体数目为2n＝36，，其染色体数目为原二倍体的两倍，即为同源四倍体。其核型公式为2n＝4x＝14m+20sm+2st，核型也属于2B(表3)。其中第2组，第3组，第5组都为sm近中着丝点；第8组都为中部着丝点。
第1组中两条染色体为sm近中着丝点，另两条为st近端着丝点；第4，6组中两条染色体为m中部着丝点，另两条为sm近中着丝点；第7，9组中一条染色体为m中部着丝点，另三条为sm近中着丝点。这几组同源染色体发生的变异与原二倍体变异的方式相同。
表3 桔梗二倍体和四倍体染色体参数
RL，相对长度；AR臂比值；Type，染色体类型。
经秋水仙碱诱导后有部分植株形成嵌合体，变异细胞往往发生在L-I层或L-II层，或成扇形突变。产生的变异细胞往往生活力弱，分裂速度慢，而正常二倍体细胞生活力强，分裂快，从而淹没变异细胞，产生与二倍体竞争，表现为回复突变。将变异的器官或组织诱导产生不定芽，由于不定芽由一个或几个表皮细胞发育而来，若这部分细胞是多倍体，则形成的不定芽为多倍体，及时从不定芽中分割下来继续培养，从而达到稳定的目的。
经细胞学染色体鉴定中国桔梗的体细胞中期染色体数目为2n＝2x＝18；经加倍后的体细胞中期染色体数目为2n＝2×2x＝2×18＝36，是原二倍体的二倍，为同源四倍体。
我们在检测中发现有极少数个体出现非整倍变异。如2n＝4x＝36+1；2n＝4x＝36+2，2n＝4x＝36-1的情况。这可能是在细胞分裂过程中姊妹染色体出现滞后的原因造成的。
权利要求
1.一种中国桔梗四倍体的培育方法，其特征在于经过下列步骤A、切取中国桔梗单株上健壮的幼芽，用自来水清洗干净，放入浓度为0.05～0.2％的升汞(Hgcl2)溶液中浸泡处理10～20分钟，之后再放入浓度为1～2％的次氯酸钠溶液中浸泡处理8～15分钟，用无菌水冲洗2～3次后，在无菌条件下，将灭菌后的切块接种到单位为mg/L的下列诱导培养基中MS基本培养液6-苄基氨基嘌呤(6-BA) 0.1～0.3mg/L激动素(KT) 0.05～0.1mg/L萘乙酸(NAA) 0.1～0.3mg/L蔗糖 30000mg/L琼脂 4500mg/LpH 5.5～5.8在光照10～12h/d，光强800～1200Lx，温度22～26℃的环境条件下，培养20～30d，使不定芽自切口处直接生成；B、将生成的不定芽丛分切，在与步骤1相同的培养条件下继代培养，经3～4次继代后获得无性系无菌植株；C、将嫩茎按每段0.5cm且带一个节截取，并将每节两个叶片去半，然后用浓度为0.05～0.1％的秋水仙碱浸泡处理10～72h，处理后用无菌水漂洗2～3次，接种到与步骤1相同的培养基上，并在与步骤1相同的培养条件下培养后，得叶片宽大，叶色深，茎粗且节距长的四倍体植株。
全文摘要
本发明提供一种中国桔梗四倍体的培育方法，它以云南特色野生花卉中国桔梗为育种材料，借助蔬菜、水果以及其它园艺植物的多倍体育种技术，对中国桔梗离体茎尖采用秋水仙碱处理诱导，不仅诱导率高，而且使不定芽变异十分明显，变异芽粗壮矮小，从而获得较好的效果，同时本发明采用不定芽组培快繁技术，在短时间内稳定并扩繁了四倍体桔梗植株，加快了其育种进程，可选育出观赏价值较高或利用价值较好的多倍体中国桔梗种质。按本发明方法获得的桔梗多倍体组培苗叶片较二倍体叶片明显大而厚，叶色深，生长快，出瓶植株健壮，初步体现了多倍体在形态上的优势。
文档编号C12N5/04GK1951173SQ200610048820
公开日2007年4月25日 申请日期2006年11月16日 优先权日2006年11月16日
发明者屈云慧, 熊丽, 王小华, 瞿素萍, 李进昆 申请人:云南省农业科学院花卉研究所