专利名称：一种大麦离体穗培养方法及其装置的制作方法
技术领域：
本发明属于农业领域的离体培养技术，特别涉及大麦离体穗培养的方法和装置。
背景技术：
离体穗培养技术可以避免穗与其他器官的相互作用，且在新的“源”(培养基)、“库”(穗器官)系统中，“源”的供应水平可以得到有效的控制(Donovan和Lee，1977，Plant Sci Lett 9107-113)，因此，离体穗培养技术越来越受研究者们的重视。早在1943年Keller(1943，J Am SocAgron 35617-624)采用离体穗培养技术研究了小麦穗对养分的吸收利用问题。之后，Jenner(1968，Aust J Biol Sci 121597-608)在无菌条件下采用短期离体穗培养研究了小麦籽粒淀粉的合成。Ahmadi和Bakert(1999，Plant Growth Regul 28187-197)研究了激素对小麦籽粒灌浆进程的影响。Cazetta等(1999，Ann Bot 84747-754)研究了蔗糖和氮对玉米籽粒生长的调控。在离体培养条件下，通过特定物质(如标记同位素)的供给，可以研究物质的运输、分配及在器官内的转化。Lee(1978，Aust Jplant Physiol 5779-785)用离体培养小麦穗进行14CO2饲喂处理，证明颖片可能是合成氨基酸碳素骨架和进行氨基酸转化的重要场所；当离体培养穗用硝酸铵作氮源，颖片的硝酸水平比穗其它部位都要高，这暗示颖片也是硝酸还原的重要部位。可见，离体穗培养技术对研究禾谷类作物植株、穗和粒发育的调控、胚乳内含物的分布与形成以及籽粒发育的酶学和动力学生理机制是一个十分有用的方法。
大麦产量形成与籽粒发育密切相关，籽粒灌浆过程一直以来都是大麦产量和品质形成研究中的热点。但大麦籽粒灌浆是一个复杂的生理过程，对其生理调控机制至今仍未完全弄清。大麦灌浆受同化物供应能力、韧皮部输导能力以及籽粒库对同化物的接纳和转化能力等多种因素的综合影响。而目前尚无消除不同因素间以及不同器官间相互影响的有效措施，这样在整株条件下难以开展籽粒灌浆生理研究。应用离体穗培养技术研究籽粒灌浆生理可避免麦穗与其它器官的相互作用，且能使籽粒灌浆的“源”在新的“源(培养基)-库(籽粒)”系统中得到有效控制，从而在很大程度上克服大麦整株条件下不能有效地进行灌浆生理研究的不足。但是，迄今离体穗培养技术多应用于小麦上，而在大麦上应用较少，其原因主要在于培养技术的不完善，特别是，传统离体穗培养多采用灭菌棉花塞包住节间固定茎，由于伤口和培养过程中微生物侵染的影响，会对离体穗的生长产生不良的影响。
发明内容
针对现有技术中存在的问题与不足，本发明提供一种简便有效的大麦离体穗培养方法以及相关装置。
本发明的一种大麦离体穗培养方法，包括以下步骤(1)培养瓶、培养液灭菌；(2)幼穗的消毒、接种选取幼穗，穗颈节以下部分先用75％乙醇溶液表面消毒，用体积百分比浓度1％的次氯酸钠溶液表面消毒5分钟，以灭菌水冲洗干净后，剪去基部节间1-2cm；揭去灭菌后盛有培养液的培养装置，将5-7个单茎穗插入培养装置中，每孔插1单茎穗，穗器官外露，每瓶5-7穗；(3)培养培养5天后，用无菌水洗净离体穗浸液部分茎，并于无菌水中剪去下部节间1-1.5cm，然后移入新的培养瓶；(4)重复步骤(3)，经20-22天培养大麦种子成熟。
所用的培养液的组成(mM)为(NH4)2SO4，48.2；MgSO4，65.9；K2SO4，15.9；KNO3，18.5；Ca(NO3)2，59.9；KH2PO4，24.8；Fe-citrate，5；MnCl24H2O，0.9；ZnSO47H2O，0.11；CuSO45H2O，0.04；HBO3，2.9；H2MoO4，0.01。
其中步骤(2)中的幼穗为选取开花后5-20天健壮植株单茎，连根取，剪去植株下部，保留倒2节间的一部分，去叶片，保留裹穗的叶鞘，也可留旗叶。
其中步骤(3)于人工气候箱光照培养，22℃光照15小时/18℃黑暗9小时，相对湿度60-85％。
本发明的一种用于所述大麦离体穗培养方法的装置，该装置采用“广口瓶-打孔塑料瓶盖-锡铂”250ml广口瓶1，上有一层锡铂2，锡铂2上盖有带有7个直径3.5毫米圆孔4的塑料盖3，塑料盖3上有一层锡铂5。
该装置内有150ml培养液。
该装置为在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟后的装置。
本发明的优点本发明建立了一种简便有效的大麦离体穗培养方法，采用“广口瓶-打孔塑料瓶盖-锡铂”，这种装置结构简单、成本低廉，养分可控，操作简便；并能有效降低穗培时的污染率，使离体穗在培养液中良好灌浆，并直至籽粒成熟。为籽粒灌浆等大麦生理研究提供一种有效的实验手段。
图1为本发明实施例的装置；图2是本发明实施例中培养21天的成熟大麦穗。
具体实施例方式
以下通过实施例进一步对本发明进行描述实施例1将准备好的培养液注入250mL广口瓶，每瓶装150ml，盖1层锡铂，将带有7个直径3.5毫米圆孔的塑料盖盖紧，再在塑料盖上加1层锡铂。在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟。
培养液成分(mM)的组成为(NH4)2SO4，48.2；MgSO4，65.9；K2SO4，15.9；KNO3，18.5；Ca(NO3)2，59.9；KH2PO4，24.8；Fe-citrate，5；MnCl24H2O，0.9；ZnSO47H2O，0.11；CuSO45H2O，0.04；HBO3，2.9；H2MoO4，0.01。
根据田间观察，选取生长一致开花后12天生长健壮的大麦植株单茎作为供试材料，连根取回。在实验室剪去植株下部，保留倒2节间的一部分，去掉叶片，保留裹穗的叶鞘。在超净工作台上，穗颈节以下部分先用75％乙醇溶液表面消毒，用1％次氯酸钠溶液表面消毒5分钟，以灭菌水冲洗干净后，再剪去基部节间1.5cm；揭去灭菌后盛有150mL培养液的广口培养瓶上层锡铂，然后将5-7个单茎穗插入培养瓶中，每孔插1单茎穗，穗器官外露，每瓶5-7穗。然后置人工气候箱培养，22℃光照15小时/18℃黑暗9小时，相对湿度70％。培养期间每隔5天更换一次培养液离体穗于灭菌水中剪去下部节间1cm，然后移入新的已灭菌盛有150mL培养液的广口培养瓶。经21天培养，大麦种子基本饱满、成熟。
如图2所示，是本发明实施例中培养21天的成熟大麦穗。
实施例2培养装置如图1所示，该装置采用“广口瓶-打孔塑料瓶盖-锡铂”250ml广口瓶1，内装150ml培养液，上有一层锡铂2，盖了有七个直径3.5毫米圆孔4的塑料盖3，塑料盖3上有一层锡铂5。在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟。
实施例3本方法得到的大麦籽粒在籽粒镉积累研究中的应用采用上述培养方法得到的大麦籽粒，研究了不同浓度镉处理对大麦籽粒镉含量的影响，试验设0、0.5、2、8μMCdCl24个处理，即在培养液中分别添加0、0.5、2、8μMCd。大田种植大麦品种浙农大3号，开花后15-18天离体穗培15天至籽粒成熟，测定籽粒镉含量与积累量随着Cd处理水平的提高而增加。2μM和8μMCd处理15天，籽粒中镉含量分别比0.5μMCd处理高1.3和2.7倍，差异极显著。
采用上述培养方法得到的大麦籽粒，研究了锌和蔗糖对大麦籽粒镉含量的影响。试验在2μM镉处理培养液中，分别添加了30mM蔗糖、150mM蔗糖、100μM Zn(ZnSO4)、300μM Zn，以2μMCd处理培养液为对照，共5个处理。大田种植浙农大3号，开花后18-20天离体穗培10天籽粒成熟，测定籽粒镉含量，结果表明，加30mM蔗糖、150mM蔗糖、100μMZn、300μM Zn处理籽粒镉含量分别比对照极显著降低50.0％、92.5％、63.0％、72.9％。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种大麦离体穗培养方法，其特征依次包括以下步骤(1)培养瓶、培养液灭菌；(2)幼穗的消毒、接种选取幼穗，穗颈节以下部分先用75％乙醇溶液表面消毒，用体积百分比浓度1％的次氯酸钠溶液表面消毒5分钟，以灭菌水冲洗干净后，剪去基部节间1-2cm；揭去灭菌后盛有培养液的培养装置，将5-7个单茎穗插入培养装置中，每孔插1单茎穗，穗器官外露，每瓶5-7穗；(3)培养培养5天后，用无菌水洗净离体穗浸液部分茎，并于无菌水中剪去下部节间1-1.5cm，然后移入新的培养瓶；(4)重复步骤(3)，经20-22天培养大麦种子成熟。
2.根据权利要求1所述的大麦离体穗培养方法，其特征在于所用的培养液的组成(mM)为(NH4)2SO4，48.2；MgSO4，65.9；K2SO4，15.9；KNO3，18.5；Ca(NO3)2，59.9；KH2PO4，24.8；Fe-citrate，5；MnCl24H2O，0.9；ZnSO47H2O，0.11；CuSO45H2O，0.04；HBO3，2.9；H2MoO4，0.01。
3.根据权利要求1所述的大麦离体穗培养方法，其特征在于其中步骤(2)中的幼穗为选取开花后5-20天健壮植株单茎，连根取，剪去植株下部，保留倒2节间的一部分，去叶片，保留裹穗的叶鞘，也可留旗叶。
4.根据权利要求1所述的大麦离体穗培养方法，其特征在于其中步骤(3)于人工气候箱光照培养，22℃光照15小时/18℃黑暗9小时，相对湿度60-85％。
5.一种用于权利要求1所述的大麦离体穗培养方法的装置，其特征在于该装置采用“广口瓶-打孔塑料瓶盖-锡铂”250ml广口瓶(1)，上有一层锡铂(2)，锡铂(2)上盖有带有7个直径3.5毫米圆孔(4)的塑料盖(3)，塑料盖(3)上有一层锡铂(5)。
6.根据权利要求5所述的一种用于大麦离体穗培养方法的装置，其特征在于该装置内有150ml培养液。
7.根据权利要求5所述的一种用于大麦离体穗培养方法的装置，其特征在于该装置为在1.1个大气压、121℃条件下灭菌20分钟后的装置。
全文摘要
本发明公开了一种大麦离体穗培养方法及其装置，包括培养瓶、培养液灭菌，幼穗的消毒、接种，培养，重复培养，经20－22天培养大麦种子成熟；并公开了装置采用“广口瓶－打孔塑料瓶盖－锡铂”，250ml广口瓶，上有一层锡铂，锡铂上盖有带有7个直径3.5毫米圆孔的塑料盖，塑料盖上有一层锡铂。本发明建立了一种简便有效的大麦离体穗培养方法，采用“广口瓶－打孔塑料瓶盖－锡铂”，这种装置结构简单、成本低廉，养分可控，操作简便；并能有效降低穗培时的污染率，使离体穗在培养液中良好灌浆，并直至籽粒成熟，为籽粒灌浆等大麦生理研究提供一种有效的实验手段。
文档编号C12N5/04GK1920006SQ200610053418
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月15日 优先权日2006年9月15日
发明者邬飞波, 张国平, 陈飞, 董静, 蔡悦, 汪芳 申请人:浙江大学