专利名称：一种异性孪生不育母牛的检测方法
技术领域：
本发明涉及动物遗传育种技术领域，尤其涉及一种利用PCR技术早期检测异性孪生不育母牛的检测方法。
背景技术：
在奶牛自然繁殖过程中，一胎双犊比例约为2％，而异性双胎占0.7％。随着现代奶牛胚胎移植技术的推广应用，奶牛一胎双犊、异性双犊的比例显著增加。在孪生犊牛中，如果是一雌一雄，雄性孪生犊牛发育正常，而雌性孪生犊牛则有很高的几率(91％～95％)不能生育，即异性孪生母牛不育现象(王元兴，郎介金.动物繁殖学.江苏科学技术出版社，1993)。
对异性孪生母牛不育现象目前有两种解释。一种解释是激素学说，即认为雄性胎牛的生殖腺发育较早，故同胎中雄性胎牛产生的激素可能经过融合的胎盘血管到达雌性胎牛，抑制了雌性胎牛的卵巢皮质及生殖道的发育或者使雌性胎牛雄性化(徐立仁等.异性孪生不育母牛研究.畜牧与兽医，1994，26(6)251～253)。但近年来人们对这个内分泌理论提出了怀疑因为没有证据支持雄激素可以使哺乳动物的卵巢变为睾丸的主张；而且，雄激素不能造成副中肾管的退化，而副中肾管退化是异性孪生母牛的普遍特征，其外生殖器官仍然保持雌性。另外一种解释是近年来有人根据现代免疫学和细胞遗传学的研究认为，孪生时两胎牛间尿囊绒毛膜紧密的融合，导致了胎盘血管发生广泛的吻合，因此两胎儿间造血细胞和其他细胞进行了交换，因而在孪生两胎牛间出现了相同的红细胞抗原，同时在外周血液细胞中还出现了白细胞性染色体的嵌合体。在实际中，人们也发现少数的异性孪生母牛具有生殖能力，研究认为这是因为孪生时两胎牛的胎盘血管没有发生吻合，所以没有形成性染色体的嵌合体所致(王元兴，郎介金.动物繁殖学.江苏科学技术出版社，1993)。因此目前人们认为异性孪生母牛不育是由于其性染色体为嵌合体(XX/XY)造成的(正常母牛的性染色体为XX，正常公牛的性染色体为XY，而异性孪生不育母牛体内除了含有X性染色体外，还含有公牛所独具的Y性染色体)，而不是以前认为的由于激素的影响。
60年代前后，人们知道哺乳动物的性别决定依赖于Y染色体，推测Y染色体上有1个基因，它编码了1种睾丸决定因子TDF(testis determining factor)决定性脊发育为睾丸。直到1990年，人们才克隆到Y染色体短臂上的性别决定区基因(sex determining region of chromosome Y，SRY)(在人类称为SRY，其他动物称为Sry)，Sry是单拷贝基因。现经许多实验室证实它具有性别决定基因的性质，是目前性别决定的最佳候选基因。该基因在哺乳动物中是高度保守的。目前，在畜禽性别控制研究领域，如胚胎性别早期鉴定，精子分离等方面，人们主要利用Sry基因来确定研究对象的性别。
以前对异性孪生不育母牛的研究报道不多，研究开发异性孪生不育母牛检测方法也不多，主要为生化方法，一种是血型鉴定方法，即同时检测异性孪生公母牛的血型，这要求孪生雌雄牛的血样都要具备，而且这种方法还不能早期判定异性孪生母牛是否具有生育的能力；一种是检测白细胞的染色体，即利用普通显微镜检测牛样本中有无Y染色体来判定，这种方法要求检验者要有丰富的经验，费时费力，并且准确性不高；还有一种是检测其移植相容性，这也要求孪生雌雄牛的样本都要具备，而且所用的试剂价格偏贵，步骤繁琐，对操作者的要求也比较高(徐立仁等.异性孪生不育母牛研究.畜牧与兽医，1994，26(6)251～253)。基于上述情况，现有的生化方法实际上是很难真正用于生产上的检测应用。值得注意的是，近年来随着我国奶牛业的迅速发展，牛价不断升高，有些人有意低价收购异性孪生母牛犊，然后再当做正常母牛犊高价卖出，由于异性孪生母牛犊在外观上与正常母牛犊很难分别，所以往往买牛者要到牛犊养大了以后才发现买的母牛犊出现不能发情，屡配不孕等情况，造成的损失十分惨重，因此，生产上急需有一种能早期快速检测异性孪生不育母牛的可行方法。
发明内容
本发明的目的在于，针对已有检测方法中存在的费时、费力、成本高、准确性不高、并要求同时提供孪生雌雄牛的血样等问题，提供一种应用分子生物学技术中的PCR技术，能简便、快速、灵敏、成本低廉、特异检测异性孪生不育母牛的方法。
本发明的主要依据是异性孪生不育母牛的性染色体是嵌合体(XX/XY)(即异性孪生不育母牛体内存在Y性染色体)，而正常母牛性染色体为XX这一现象，研究开发了一种基于PCR技术的检测方法即检测待检异性孪生母牛体内是否存在Y染色体上特异的Sry基因，如果检测出Sry基因，则说明待检异性孪生母牛体内存在Y染色体，判定被检测牛是异性孪生不育母牛；如果没有检测出Sry基因，则说明待检异性孪生母牛体内不存在Y染色体，判定被检测牛不是异性孪生不育母牛。
本发明目的通过以下技术方案来实现一种异性孪生不育母牛的检测方法，包括以下步骤1)、待检异性孪生母牛血液样品或组织样品的采取血样可于待检母牛尾静脉采集，每头0.5毫升～2毫升，用ACD或肝素抗凝；组织样可于待检母牛耳采集，每头10毫克～20毫克，放于装有70％乙醇的1.5毫升EP管中；采取的血样或组织样现用或在-20℃下冷冻保存；2)、阴性对照牛(正常母牛)和阳性对照(正常公牛)牛血样或组织样的采取阴性对照牛和阳性对照牛的血样或组织样可分别采集1-3个。血样采集可于正常公、母牛尾静脉采集0.5毫升～2毫升，用ACD或肝素抗凝；组织样可采集耳组织10毫克～20毫克，放于装有70％乙醇的1.5毫升EP管中；采取的血样或组织样现用或在-20℃下冷冻保存；3)、样品基因组DNA的提取采用常规的酚-氯仿抽提法提取基因组DNA，或用基因组提取试剂盒提取基因组DNA，TE溶解或双蒸水融解，现用或在-20℃冷冻保存；4)、根据GenBank中牛1.715微卫星DNA序列设计一对内标基因引物，扩增片断长度为216bp，引物序列为5′端引物5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′；5)、根据GenBank中牛Sry基因序列设计一对检测基因引物，扩增片断长度为302bp，引物序列为5′端引物5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′；6)、最佳扩增体系的建立利用正交试验，摸索建立牛1.715微卫星DNA和Sry基因片断最佳扩增体系；7)、样本检测与判定根据待检测样品和对照样品的1.715微卫星DNA和Sry基因片断的扩增结果，对被检测母牛是否为异性孪生不育母牛进行判定。
本发明的有益效果为
1、简便易行采用实验室常规PCR技术，通过两次PCR扩增，就可以判断出所检测的母牛是否为异性孪生不育母牛；检测时无需同时具备孪生雌雄牛的血样，只需采集待检母牛的血液样品几毫升或组织样品如耳组织几毫克即可。
2、快速、灵敏、特异性检测从取样到检测扩增结果，快速得到结果；通过特异性扩增产物的有无即可进行准确、直观的判断；具备简单分子生物学技术的人员就可以应用。
3、成本低廉检测一个样本的成本低于2元。
4、早期检测、降低奶牛养殖户风险利用这项技术，一是在奶牛场可以对出生的异性孪生母牛犊进行早期检测，以决定孪生母牛犊是留还是淘汰，以免造成不必要的经济损失；二是应用这项技术，就可以在奶牛买卖过程，对交易奶牛犊实施检测，以判断其是否是孪生不育母牛犊，可以有效打击欺诈行为，保障奶农的权益。三是可以对怀疑买到异性孪生母牛犊的奶农提供科学的检测依据，以供他们在维权时使用，保障他们的利益。
因此，本检测技术具备快速(5-10个小时就可以得到结果)、简便(具备简单分子生物学技术的人员就可以应用)、准确(通过扩增产物有无可以进行直观判断)，成本低廉等特点，易于推广使用。
图1、内标引物扩增牛1.715微卫星DNA片断结果示意图1-16，牛1.715微卫星DNA(216bp)；CK，阴性对照；M，DL2000；图2、检测引物扩增牛Sry基因片断结果示意图1-16，牛Sry基因(302bp)；CK，阴性对照；M，DL2000。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但以下描述不对本发明的保护范围构成任何意义上的限定。
实施例1(以血液为样品对异性孪生不育母牛的检测方法)步骤1待检异性孪生母牛血液样品的采集。
奶牛血样采自浙江省金华市部分牛场的黑白花奶牛，共11个异性孪生母牛，各采取尾静脉血样1ml左右，采用抗凝剂ACD抗凝，-20℃冻存。
步骤2阴性和阳性对照牛血液样品的采集。
奶牛血样采自浙江省金华市部分牛场的黑白花奶牛，共5个样品，其中3个为正常母牛样品，2个为正常公牛样品，各采取尾静脉血样1ml左右，采用抗凝剂ACD抗凝，-20℃冻存。
步骤3血液样品的基因组DNA的提取。
采用常规的酚-氯仿抽提法提取血液样品的基因组DNA，TE溶解(也可双蒸水融解)后-20℃冻存。
步骤4内标基因引物设计与扩增根据GenBank中牛1.715微卫星DNA序列(GenBank序列号V00125)设计一对引物作为内标基因引物，扩增片断长度为216bp，由上海生物工程公司合成，引物序列为5′端引物Primer 1.715F5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物Primer 1.715R5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′PCR最佳扩增体系为见表1
表1.牛1.715微卫星DNA的最优PCR扩增体系位点双蒸水10×Buffer dNTP引物1引物2MgCl2 Taq酶模板总体积1.715 16.5μL 2.5μL 1μL 1μL 1μL 1.5μL 0.5μL 1μL 25μLPCR扩增程序扩增条件为94℃预变性5min；94℃，30s；56℃，40s；72℃，40s；30个循环；最后一个循环后72℃延伸10min。
PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，获得216bp的扩增条带(见图1)。
步骤5检测基因引物设计与扩增根据GenBank中牛Sry基因序列(GenBank序列号AB039748，AF148462)设计一对引物作为检测基因引物，扩增片断长度为302bp，由上海生物工程公司合成，引物序列为5′端引物Primer SryF5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物Primer SryR5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′PCR最佳扩增体系为见表2表2.牛Sry基因的最优PCR扩增体系位点双蒸水Buffer 10×dNTP引物1引物2MgCl2 Taq酶模板总体积Sry 16μL 2.5μL 1μL 1μL 1μL 2.0μL 0.5μL 1μL 25μLPCR扩增程序扩增条件为94℃预变性5min；94℃，30s；56℃，40s；72℃，40s；30个循环；最后一个循环后72℃延伸10min。
PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳，获得302bp的扩增条带(见图2)。
步骤6样本检测与判定根据待检测样品和对照样品的1.715微卫星DNA和Sry基因片断的扩增结果，对被检测母牛是否为异性孪生不育母牛进行判定。下面是本实施例的具体判定过程所用样品为血样，共有16个，其中3个为正常母牛样品(阴性对照)，编号1，2，3；2个为正常公牛样品(阳性对照)，编号4，5；11个为孪生母牛样品，编号6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16。
为保证检测结果的可靠性，首先用牛1.715微卫星DNA基因为内标基因对所提取的基因组DNA进行检验。从图1(牛1.715微卫星扩增结果)中可以看出，所检测的十六头牛中，都扩增出了216bp左右的片断，说明所扩增片断为牛1.715微卫星DNA序列片断。这表明这些样品的DNA均来自牛，质量良好而且可以用来做进一步的分析。
接着用检测引物对16头牛的Sry基因片断进行扩增，结果见图2(牛Sry基因扩增结果)。从图2中可以看出，样品1、2、3、11都没有扩增产物，而样本4、5、6、7、8、9、10、12、13、14、15、16都扩增出302bp的片断，在所检测的16个样品中，样品1、2、3为正常母牛，其性染色体型为XX，没有Y染色体，所以没有扩增出Sry基因片断。而样品11虽是异性孪生母牛，但其没有扩增出Sry基因片断，说明其体内不存在Y染色体，是异性孪生母牛中具有生育能力的，可以留用。样品4、5为正常公牛，其性染色体型为XY，因此扩增出Sry基因扩增片断。样品6、7、8、9、10、12、13、14、15、16为异性孪生母牛，其扩增出Sry基因片断，证明其性染色体型为XX/XY，这十头母牛是异性孪生母牛中的不育母牛，应该被淘汰。
需要指出的是，我们还对所检测的11头异性孪生母牛进行了生殖系统的常规检查，其中编号为11的母牛经常规检查其生殖器官发育正常，能正常发情配种，而其他10头母牛生殖系统发育不正常，不能正常发情配种。这也说明我们所建立的检测方法能准确的检测出异性孪生母牛中的不育母牛。本发明为生产实践提供了一种简便、快速、灵敏、特异的检测异性孪生不育母牛的技术。
实施例2(以组织为样品对异性孪生不育母牛的检测方法)步骤1待检异性孪生母牛组织样品的采集。
奶牛组织样采自浙江省金华市部分牛场的黑白花奶牛，共11个异性孪生母牛，各采取耳组织15毫克，放于装有70％乙醇的1.5毫升EP管中，-20℃冻存。
步骤2阴性和阳性对照牛组织样品的采集。
奶牛组织样采自浙江省金华市部分牛场的黑白花奶牛，共5个样品，其中3个为正常母牛样品，2个为正常公牛样品，各采取耳组织15毫克，放于装有70％乙醇的1.5毫升EP管中，-20℃冻存。
步骤3组织样品的基因组DNA的提取。
采用常规的酚-氯仿抽提法提取组织样品的基因组DNA。TE溶解(也可双蒸水融解)后-20℃冻存。
步骤4(内标基因引物设计与扩增)、步骤5(检测基因引物设计与扩增)和步骤6(样本检测与判定)的方法、步骤及材料均同于实施例1。
以上以举例方式详细描述了本发明的实施过程，但对本领域熟练技术人员来说，显而易见的是，在实施过程中可进行许多等效的修改和替换。因此，本发明的范围仅以权利要求书的限定为准。
权利要求
1.一种异性孪生不育母牛的检测方法，其特征在于包括以下步骤1)、待检异性孪生母牛血液样品或组织样品的采取、备用；2)、阴性对照牛和阳性对照牛血样或组织样品的采取、备用；3)、样品的基因组DNA的提取；4)、根据牛1.715微卫星DNA序列设计一对内标基因引物，扩增片断长度为216bp，引物序列为5′端引物5′-TGGAAGCAAAGAACCCCGCT-3′3′端引物5′-GAACTTTCAAGCAGCTGAGGC-3′；5)、根据牛Sry基因序列设计一对检测基因引物，扩增片断长度为302bp，引物序列为5′端引物5′-TGAACGCCTTCATTGTGTGGTC-3′3′端引物5′-GCTAGTAGTCTCTGTGCCTCCT-3′；6)、最佳扩增体系的建立利用正交试验，摸索建立牛1.715微卫星DNA和牛Sry基因片断的最佳扩增体系；7)根据待检测样品和对照样品的1.715微卫星DNA和Sry基因片断的扩增结果，对被检测母牛是否为异性孪生不育母牛进行判定。
全文摘要
本发明公开了一种异性孪生不育母牛的检测方法，属于动物遗传育种技术领域。该方法包括待检母牛和阴性对照牛(正常母牛)及阳性对照牛(正常公牛)血液样品或组织样品的采取；样品基因组DNA的提取；根据GenBank中牛1.715微卫星DNA序列设计一对内标基因引物；根据GenBank中牛Sry基因序列设计一对检测基因引物；最佳扩增体系的建立及样本检测与判定等技术步骤。本方法具备快速(5－10个小时)、简便、准确(通过扩增产物有无即可直观判断)，成本低廉(2元/每样本)等特点，能及早检测出异性孪生不育母牛犊，以便及早淘汰，减少奶牛养殖者的损失。
文档编号C12Q1/68GK1932032SQ200610053469
公开日2007年3月21日 申请日期2006年9月20日 优先权日2006年9月20日
发明者徐如海, 胡锦平, 翁经强, 禇晓红, 蒋永清, 张妙仙, 黄少珍 申请人:浙江省农业科学院