专利名称：一种家猪皮肤组织冷冻保存方法
技术领域：
本发明涉及种质资源保存、转基因、组织低温冷冻保存和基因疗法等领域。
背景技术：
体细胞核移植技术作为生产转基因动物更高效的手段在育种和拯救濒危动物上受到很大关注。利用优良动物品种的体细胞作为核供体克隆动物，可以避免自然条件下选种中生育周期和生育效率的限制，加速育种进程。同时，体细胞的有效长期冷冻保存也可以解决核移植时临床上出现的供需时间不一致的矛盾，目前卵巢组织和体细胞的冷冻保存已经被广泛应用在人、鼠、兔、羊、牛、猪、绒猴和大象等物种的临床研究和动物育种中。通常作为低分子量可渗透性冷冻保护剂应用的化学物质如二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)等。但它们对不同物种和不同细胞的适应性差异很大。有关组织对各类保护剂的耐受性和保存效果的研究在家猪上还未见报道。此外，组织工程化组织在未来的临床医学研究中有重大价值，并蕴涵了巨大的经济效益。皮肤组织工程也是研究的热点。如何构建组织工程化皮肤并能建立完善的保存机制以用于治疗皮肤缺损等疾病，是科学家切逮解决的问题。家猪器官和人类在生理和形态上的相似性使其成为研究人体器官组织的有效模型，现已有关于猪成纤维细胞的体外培养及其成纤维细胞冻存的研究，但对家猪皮肤组织的冷冻保存还未见报道。
发明内容
本发明的目的是研究一种针对家猪的皮肤冷冻保存方法，以建立冷冻保存体细胞的新方法。
本发明的技术方案是家猪皮肤组织冷冻保存方法，其特征是将家猪耳皮肤组织置于冷冻保护液中，先在环境温度为18～24℃条件下平衡20～30分钟，然后用液氮蒸汽熏蒸至冷冻保护液结冻后，再将家猪耳皮肤组织置于液氮面上8～20小时后，投入液氮中保存。
所述的冷冻保护液是浓度为10％～30％的甘油(GLY)。
所述的冷冻保护液是浓度为10％～30％的二甲基亚砜(DMSO)。
所述的冷冻保护液是浓度为10％～30％的乙二醇(EG)。
本发明工艺简单合理，可获得家猪耳皮肤组织冷冻保存，解冻后皮肤组织有生长能力。采用本发明，无需特殊冷冻仪器，样本收集为现有技术，非常方便，适合于珍稀动物体细胞的长期保存。冷冻前组织块在18～24℃的环境温度下置于(10％、20％、30％)三种浓度梯度的DMSO、GLY和EG中预平衡20～30分钟，降低冷冻剂的毒性以及达到冷冻前细胞内外渗透压的平衡。研究还表明，二甲基亚砜浓度为20％、或甘油浓度为20％、或乙二醇浓度为30％，解冻后组织块生长效果最好。
图1为新鲜组织培养第5d长出成纤维细胞及其形态×40；图2为Hoechst33342染色镜检组织块边缘细胞核分布×40；图3为光镜下的细胞形态×400；图4为光镜下细胞核清晰可见×400；图5为冻溶后组织块扩展能力仍强×40；图6为冻溶后细胞形态，细胞核也清晰可见×400；
具体实施办法1、新鲜耳皮肤组织样本的获取尽量挑选猪耳组织上血管较细少的部位，刮毛刀剃毛后酒精擦拭消毒，用耳钳或手术刀取1cm2～2cm2左右面积的耳组织，置冰盒迅速带回实验室。超净台内用手术刀分离表皮层、真皮层及皮下软骨层，分离到的真皮层于预热无菌PBS清洗2～3遍，注射器针头分割成1mm3小块后再次清洗2～3遍。随机挑取10～20块新鲜组织，贴于预先点入血浆的25mm2培养瓶内壁(血浆已先行在烘箱凝固)直接进行培养作为阳性对照。Hoechst染色以鉴定细胞生长情况。
2、皮肤组织的冷冻和解冻冷冻前的渗透平衡在硅化处理过的培养皿中分区滴加(10％、20％、30％)三种浓度梯度的DMSO、GLY和EG，随机挑取3～5块组织块分别浸入各种冷冻保护液中，在18～24℃的环境温度下渗透平衡20～30分钟。将渗透平衡后的组织块加入事先装有0.5mL不同浓度不同保护液的1.8mL规格的冷冻管中，分别采用快速降温和慢速降温两种方法进行冻存。慢速降温液氮蒸汽冷冻至保护液结冻，置液氮面上8～20小时，后投入液氮保存。快速降温组织块加入冷冻管中直接投入液氮保存。
保存14d后解冻，取出冷冻管迅速在37℃水浴中摇晃解冻，1分钟左右冷冻液即可融化。组织块先用无菌蔗糖液漂洗2遍，再用含10％FCS的新鲜预热DMEM漂洗2遍，去除冷冻保护剂。
3、冷冻后皮肤组织的培养去除冷冻保护剂后的组织块用EDTA-牛血浆贴附在六孔培养板添加培养液进行培养。皮肤组织培养液组成为在DMEM高糖培养基中添加10％小牛血清、2％鸡血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/L β-巯基乙醇、10μl/mL非必需氨基酸、0.2％庆大霉素。Hoechst染色以鉴定细胞生长情况。
每日观察，隔日更换培养液。
新鲜组织培养结果显示培养第5d家猪耳皮肤组织开始长出成纤维细胞。组织块边缘细胞贴壁、延伸，呈圆形或梭形少量分布。培养14d后作Hoechst染色鉴定，荧光显微镜下观察组织块周围细胞核大、密集而明显。光镜下观察成纤维细胞呈放射状或旋涡状分布，并有拉网和结块现象，细胞大多呈梭形和不规则三角形或多角形，核大而清晰。分别比较不同样本可见，年龄越小的样本耳组织长出成纤维细胞的时间越早且生长能力越强，更容易扩展。所采三个家猪样本分别为一月龄、两月龄和三月龄左右，组织块生长率分别为100％、100％和93.3％。组织块开始长出细胞的时间和生长能力有个体差异。
冷冻试验结果显示对于家猪耳皮肤组织而言，所有组织解冻后开始生长的时间比新鲜组织至少晚6d。快速冷冻方法中EG和DMSO作为保护剂的存活率较高，而慢速冷冻方法中GLY作为保护剂的冷冻效果更好。此外，快速冷冻下复苏后组织块均无成纤维细胞长出。总之，20％GLY保护在快、慢速冷冻条件下组织块生长率分别为0和82.35％，并且在慢速冷冻条件下的生长率极显著高于其他组和对照组(P＜0.01)。
本发明比较了二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、乙二醇(EG)三种低分子量可渗透性保护剂以三种浓度梯度(10％、20％、30％)在两种降温条件下对家猪耳皮肤组织冷冻保存的效果。用本方法保存结果证明，用慢速冷冻和20％的GLY作保护剂对保存家猪耳皮肤组织最有效。
权利要求
1.一种家猪皮肤组织冷冻保存方法，其特征是将家猪耳皮肤组织置于冷冻保护液中，先在环境温度为18～24℃条件下平衡20～30分钟，然后用液氮蒸汽熏蒸至冷冻保护液结冻后，再将家猪耳皮肤组织置于液氮面上8～20小时后，投入液氮中保存。
2.根据权利要求1所述的一种家猪皮肤组织冷冻保存方法，其特征是所述的冷冻保护液是浓度为10％～30％的甘油。
3.根据权利要求1所述的一种家猪皮肤组织冷冻保存方法，其特征是所述的冷冻保护液是浓度为10％～30％的二甲基亚砜。
4.根据权利要求1所述的一种家猪皮肤组织冷冻保存方法，其特征是所述的冷冻保护液是浓度为10％～30％的乙二醇。
全文摘要
本发明公开了一种家猪耳皮肤组织冷冻保存方法，其特征是将家猪耳皮肤组织置于冷冻保护液中，先在环境温度为18～24℃条件下平衡20～30分钟，然后用液氮蒸气熏蒸至冷冻保护液结冻后，再将家猪耳皮肤组织置于液氮面上8～20小时后，投入液氮中保存。通过本发明可获得对家猪耳皮肤组织冷冻保存，解冻后，皮肤组织生长能力。本发明操作简单，无需特殊冷冻仪器，样本收集非常方便，适合于珍稀动物体细胞的长期保存。
文档编号C12N5/06GK1944636SQ20061009697
公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月20日 优先权日2006年10月20日
发明者李碧春, 程旭梅, 徐琪, 陈国宏, 吴信生, 赵文明, 孙鹏翔, 孙国波, 戴建明, 葛剑辉, 魏彩霞 申请人:扬州大学