专利名称：陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子，属于生物技术领域，尤其涉及转基因植物和用于产生转基因植物的启动子，特别是纤维特异性启动子。
(二)技术背景棉花是世界上最重要的天然纤维来源。阐明纤维发育的细胞和分子机理，发现改良棉纤维的靶基因，是改良纤维品质的基础。目前己克隆的重要棉纤维发育基因有与纤维伸长相关的expansin(Harmer，2002)、tubulin(Dixon，1994)、V-ATPase基因(Wilkins，1993；Wan，1994；Hasenfratz，1995)、内在蛋白δ-TIP基因(Ferguson，1997)、酰基载体蛋白(ACP)基因(Song，1997)、膜联蛋白基因(Andrawis，1997；Shin，1999)、腺苷酸环化酶相关蛋白(CAP)基因(Kawai，1998)等；与纤维细胞壁合成有关的三个纤维素合成酶基因celA1、celA2和celA3(Pear，1996；Laosinchai，2000)，Rac蛋白基因(Delmer，1995；Kim，2004)、蔗糖合成酶(SuSy)基因(Haigler，2001)、脂质转移蛋白(LTP)基因(Ma，1995，1997；Orford，1997)、富脯氨酸蛋白(PRP)基因(John，1995；Orford，1997；Tan，2001)、β-1、3-D-glucan合成酶基因(Cui，2001)、驱动蛋白(Preuss，2004)、阿拉伯半乳糖苷酶蛋白(Jian，2004)、NADPH-dependent3-ketoacyl-CoA还原酶(Yong，2005)、肌动蛋白基因(Wang，2005)、β-半乳糖苷酶(GhGal1)基因(张恒木等，2005)等。这些分离的基因由于其在纤维伸长或次生壁加厚期特异表达或优势表达而被认为具有改良棉花纤维品质的价值。
最近的研究表明棉花中的转录因子(TF)特别是MYB基因在纤维发育中起重要作用。MYB蛋白是一种转录因子，其氨基端具有DNA结合结构域，中央是反式激活结构域，羧基端是一个亮氨酸拉链结构域。许多与不同光应答元件(light response elements，LREs)相结合的蛋白因子都属于MYB家族蛋白。MYB类转录因子在植物体内具有广泛的生物学功能，如参与对植物激素的应答，控制植物细胞的形态和模式建成，参与植物苯丙烷类次生代谢途径的调节等。1999年，Loguercio等用PCR方法分离到几个可能与棉花纤维分化及发育相关的MYB类基因。GhMYB1，2和3在所有组织中都有，并且丰度高；GhMYB4，5和6在纤维中高表达。2005年，Yu等克隆了GhMYB9基因。Northernblot结果显示GhMYB9基因在棉花根、茎、叶材料中不表达，胚珠纤维材料中10DPA的表达量最高，随着时间推移逐渐降低。说明GhMYB9是一个纤维特异表达的基因(Yuet al，2005)。我们的RT-PCR分析结果也验证了上述研究。
启动子决定了基因的时空表达和表达强度。目前在植物基因工程中广泛采用的是CaMV35S启动子，它属于组成型表达启动子，驱动外源基因在转化植株各个组织的发育过程中都会表达。这无疑增加了植物的代谢负担，对植物的生长发育不利。所以人们的目标转向于克隆一些组织特异性表达或诱导性表达的启动子，而使外源基因能够在特定的组织器官和特定的时期发挥作用。所以，克隆棉花纤维中特异表达的基因并利用其启动子，是棉花纤维品质改良潜在资源。
发明内容技术问题本发明的目的是提供陆地棉纤维特异表达基因GhMYB9的启动子序列，该序列包含多个光调控序列，同时具有生长素、赤霉素应答的基本结构。构建到载体pBI121中，取代原35S启动子。为棉花的品质育种提供重要基因元件可尽快用于提高我国棉花品种的纤维品质育种中。
技术方案本发明提供了陆地棉GhMYB9基因启动子，其特征在于，该启动子全长序列为SEQ ID NO.1。根据序列SEQ ID NO.1设计了3个5’端含不同应答元件的GhMYB9基因启动子片段，命名为F1、F2、F3。启动子F1片段序列为位于SEQ ID NO.1序列的80～1432bp区间，包括核心启动子区和一些上游调控元件；启动子F2片段序列为位于SEQ ID NO.1序列的451～1432bp区间；启动子F3片段序列为位于SEQ ID NO.1序列的1043～1432bp。根据启动子片段F1、F2和F3构建的植物表达载体，分别为pF1-BI121、pF2-BI121和pF3-BI121。本发明还提供了包含上述的启动子片段的BAC单克隆，该克隆在384孔板上保存编号为31E21。
克隆陆地棉GhMYB9基因启动子序列的技术路线1.根据GenBank上登录的GhMYB9基因序列(登录号AY518320)设计一对引物Y1545/Y1546，对陆地棉BAC文库采用混合池法进行扩增，筛选具有目的基因的BAC克隆(图1)。从384孔储板上筛选到的阳性单克隆编号31E21。
2.提取了陆地棉7235的幼根、茎、叶以及不同开花时间的胚珠和纤维细胞制备总RNA，反转cDNA第一链后作为RT-PCR模板，引物为Y1545/Y1546，真核生物组成性表达基因EF1α作为内对照，检测该基因在纤维各发育时期表达情况(图2)。
3.根据GenBank上登录的GhMYB9基因序列，在序列5’端设计了三条巢式引物Y2072、Y2073和Y2074，与简并引物Y661～Y667组合，提取包含该基因的BAC单克隆DNA作为模板，进行Tail-PCR扩增(图3)。
4.根据Tail-PCR扩增结果，回收第三轮特异性条带，连接到pGEM-T-Easy Vectorsystem I(购于Promega公司)载体上、转化到大肠杆菌DH5α中。测序后经过EditSeq软件拼接，得到总长度1566bp的GhMYB9基因上游序列。
5.对此序列进行顺式调控元件分析，初步确定该序列的基本结构，序列分析网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/。
陆地棉GhMYB9基因启动子功能鉴定技术路线1.根据获得的总长度1566bp的GhMYB9基因上游序列，设计了3对引物Y2338/Y2341、Y2339/Y2341、Y2340/Y2341。PCR产物长度分别为1374bp、1003bp和410bp，分别命名为F1、F2、F3。F1片段(位于80～1432bp)包括核心启动子和一些上游调控元件；F2片段(位于451～1432bp)包括核心启动子和赤霉素应答元件，少了一些光调控元件；F3片段(位于1043～1432bp)仅包括核心启动子。
2.扩增片段测序无误后，克隆到载体pBI121中，取代CaMV35S启动子，构建成3个驱动GUS基因表达载体(PF1-BI121，PF2-BI121和PF3-BI121，图4)。
3.通过棉花胚珠瞬时表达体系分析了这三个启动子片段驱动GUS基因表达的活性。通过GUS组织化学染色证实，它们都能指导报告基因在胚珠中正常表达表达(图5)。
有益效果本发明的优点表现在1.提供了含有GhMYB9基因及其启动子序列的BAC单克隆。本发明通过筛选BAC文库的方法得到了含有目的基因的阳性单克隆，以此作为Tai1-PCR的起始模板，大大增强了PCR扩增的特异性。由于棉花为异源四倍体，所以较之以总基因组作为模板，避免了部分同源基因组的干扰，所得扩增条带单一，假阳性低。
2.本发明克隆的GhMYB9基因启动子有助于了解该基因在纤维发育过程中表达的特异性及功能。GhMYB9基因属于MYB类转录因子家族。MYB转录因子作为植物中一个很大的转录因子家族，广泛参与植物的发育和代谢调控。许多MYB类基因表现出组织特异性，已有研究证明Ghmyb10、Ghmyb25、Ghmyb36、Ghmyb38，GhMYB9是纤维特异表达基因，特别在纤维发育的早期高表达，推测这类基因可能在调控胚珠表皮细胞分化为纤维中起作用。本发明克隆的GhMYB9基因启动子有助于了解MYB转录因子家族基因在纤维发育过程中表达的特异性及功能。
3.本发明通过对GhMYB9基因ATG上游1566bp的序列顺式调控元件进行分析，确定了转录起始位点(TSS)、TATA box和CAAT box。同时发现该序列包含多个光调控元件，具有生长素和赤霉素应答的基本结构。在此基础上，构建了3个5’端含不同应答元件的启动子片段驱动GUS基因的植物表达载体。而这些外界因素对棉花纤维的发育起着重要的作用。
4.本发明通过基因枪转化的方法，分析了不同GhMYB9基因启动子片段在棉花胚珠中驱动GUS基因的瞬时表达情况。GUS组织化学染色证实，这三个启动子片段均能指导报告基因在棉花胚珠中正常表达。因此，GhMYB9启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。转棉花胚珠瞬时表达结果说明该启动子可正常启动目标基因表达。为目标基因特异性地在棉纤维中表达提供了重要的基因元件。
图1对陆地棉BAC文库采用混池法进行扩增，筛选具有目的基因的BAC克隆。图示部分BAC克隆扩增的结果。泳道6为阳性BAC单克隆的扩增条带。泳道12为基因组为模板的扩增条带作为阳性对照。M示标准分子量DL2000。扩增条带大小为313bp，与预计大小一致。
图2RT-PCR检测GhMYB9基因在棉花不同组织表达特点，从左至右依次为根(R)、茎(S)、叶(L)、开花后-1、0、2、5、10天棉纤维和10天的胚珠。图2a为GhMYB9的表达谱，图2b为EF-1α内对照图。GhMYB9基因在棉花根、茎、叶中不表达，在不同棉纤维发育期特异表达。在胚珠中不表达。
图3巢式引物Y2072、Y2073和Y2074与简并引物Y666组合，含目的基因的BAC单克隆DNA作为模板的Tail-PCR扩增结果。泳道1，2分别为第二和第三轮的扩增产物。M示标准分子量DL2000。第三轮扩增产物大小约为800bp。
图4构建的三个植物表达载体PF1-BI121，PF2-BI121和PF3-BI121，F1、F2、F3分别取代了原载体中的35S启动子，驱动GUS基因表达。
图5通过棉花胚珠瞬时表达体系分析F1、F2、F3驱动GUS基因的表达。1为未转化胚珠，2为转化PBI121载体的胚珠，3，4，5分别为植物表达载体PF1-BI121，PF2-BI121和PF3-BI121转化的胚珠。GUS染色情况说明，不同的启动子片段都能够驱动GUS基因的瞬时表达，表达效率和35S启动子相比无明显差异。
图6陆地棉GhMYB9基因启动子序列(SEQ ID NO.1)及顺式调控元件分析(序列分析网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)结果。
BoxI、BoxII、Box 4、AE-box、GT1-motif、G-box、Pc-CMA2a、CG-motif、Sp1。
CAAT-box TATA-box 生长素应答元件，AuRE Pyrimidine box、GARE MYB binding site involved in drought-inducibility，MBS 转录起始位点(Transcription start site，TSS) 5’UTR Py-rich(五)具体实施方案克隆陆地棉GhMYB9基因启动子序列的具体实施方案1.根据GenBank上登录的GhMYB9基因序列(登录号AY518320)设计一对引物，序列为Y15455’CTTTGGCTTCGTTCGCTGAT3’，Y15465’TTGTTGAAAACTTGGACTTG3’，预计扩增大小为313bp。对陆地棉BAC文库混合池进行逐级筛选扩增，直至筛选到具有目的基因的BAC克隆(图1)。
2.提取陆地棉7235(钱思颖，黄骏麒，彭跃进，周宝良，应苗成，沈端庄，刘桂玲陆地棉与异常棉种间杂种的研究及其在育种上的应用.中国农业科学，1992，25(6)44～51.)的幼根、茎、叶以及不同开花时间的胚珠和纤维细胞制备总RNA，反转cDNA第一链后作为RT-PCR模板，引物同上，生物组成性表达基因EF1α(郭媖，郭旺珍，张天真.一个新的棉纤维表达蛋白cDNA的克隆、表达及功能初步分析.棉花学报，2006，(18)67-73.)作为内对照，检测该基因在纤维各发育时期表达情况。RT-PCR结果表明GhMYB9基因在棉花根、茎、叶中不表达，在不同棉纤维发育期特异表达。在胚珠中不表达(图2)。
3.根据GenBank上登录的GhMYB9基因序列，在序列5’端设计了三条巢式引物Y2072、Y2073和Y2074。简并引物为本实验室设计的引物Y661～Y667。提取包含该基因的BAC单克隆DNA作为模板，进行Tail-PCR扩增。
4.结果巢式引物Y2072、Y2073和Y2074与简并引物Y666的扩增结果最好(图3)。回收第三轮特异性条带约为800bp，连接到pGEM-T-Easy Vector载体(购于Promega公司)上、转化到大肠杆菌DH5α中。测序后经过EditSeq软件拼接，得到总长度1566bp的GhMYB9基因上游序列。
5.对此序列进行顺式调控元件分析，初步确定该序列的基本结构。(序列分析网站http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)。具体分析结果(图6)如下首先根据转录其始位点(TSS)的序列特征PyPyAN T/A PyPy确定了TSS的位置；根据与TSS的相对位置和预测结果确定了TATA-box和CAAT-box，TATA-box与TSS的距离为24bp；根据光调控元件的特征序列预测了多个相关元件BoxI、BoxII、Box4、AE-box、GT1-motif、G-box、Pc-CMA2a、CG-motif、Sp1；与已知的σ-淀粉酶启动子结构(F Gubler and J V Jacobsen.Gibberellin-responsive elements in thepromoter of a barley high-pI alpha-amylase gene.Plant Cell，1992，4(11)1435-1441)比较预测到赤霉素应答元件2个必需序列嘧啶盒和GARE；预测到一个生长素应答元件。
陆地棉GhMYB9基因启动子功能鉴定的具体方案1.根据获得的总长度1566bp的GhMYB9基因上游序列，设计了3对引物Y2338/Y2341、Y2339/Y2341、Y2340/Y2341，为了克隆到pBI121载体的方便，在引物5’端加上了酶切位点和相应的保护碱基。扩增长度分别为1374bp、1003bp和410bp，得到了3个5’含不同应答元件的启动子片段，分别命名为F1、F2、F3。F1片段(位于80～1432bp)包括核心启动子区和一些上游调控元件；F2片段(位于451～1432bp)包括核心启动子区和赤霉素应答元件，少了一些光调控元件；F3片段(位于1043～1432bp)仅包括核心启动子区。扩增所得片段测序，与原序列比对无误后克隆到表达载体pBI121中。载体pBI121由对应的酶酶切，去掉35S启动子序列，回收大片段。F1、F2、F3片段酶切后与载体相连接，取代35S启动子，构建成3个驱动GUS基因表达载体PF1-BI121，PF2-BI121和PF3-BI121(图4)。
2.基因枪法转化胚珠2.1拨取棉花开花后2天的胚珠，消毒处理后置于BT固体培养基上(附加5mg/LGA3和0.5mg/L IAA，培养基上铺滤纸)，每个培养皿集中在中间位置放置60枚胚珠，30℃暗培养2小时后作为轰击材料。
2.2载体PF1-BI121，PF2-BI121和PF3-BI121的DNA与金粉(金粉直径为1μm)包被(用于6次轰击)，步骤如下a震荡准备好的microcarriers(30mg/ml)，5min，使沉淀充分重悬。
b吸取50ul到新的1.5ml管中(吸的时候要不断震荡)c按顺序加入以下溶液5ul DNA(1ug/ul)50ul 2.5M CaCl220ul 0.1M亚精胺(新鲜配置)d继续震荡2-3min，静置1min，离心(spin 2sec)，去上清e加入140ul 70％乙醇，去液体f加入140ul 100％乙醇，去液体g加入48ul 100％乙醇重悬(弹管壁几次)，低频震荡2-3sec2.3基因枪轰击条件基因枪为BioRad公司的PDS-1000/HE Biolistic型，真空压力25-inch Hg，氦气压力1100psi，轰击距离为9cm，轰击参照基因枪说明书进行，以未轰击材料为对照，每种处理至少要做3次重复。
2.4轰击结束后，将胚珠转到新的BT固体培养基(附加5mg/L GA3和0.5mg/L IAA)上，30℃暗培养。2天后检测GUS基因的表达情况。
2.5取出胚珠浸泡在x-gluc染液中，37℃避光染色过夜。酒精脱色，观察染色结果，拍照(图5)。从图5可以看出，GUS基因在转化胚珠中表达，染色后呈现蓝色。证明3个含不同调控元件的启动子都能够指导报告基因在胚珠中表达。
序列表<110>南京农业大学<120>陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子<130>说明书<140>00<141>2006-10-12<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>SEQ ID NO.1<211>1566<212>DNA<213>Gossypium hirsutum(陆地棉)<220>
<221>promoter<222>(1)..(1566)<223>
<400>1ctctttcgaa gaaacaagaa gctatttcct tataatatca tccaatcatt ctcgagtgat60atatatattc taattaacct cactttgggt atgtatatat gacccaccaa tgaaaattaa120taatttaggt aaaaaacaaa aaacaaaaac agtaaatttg atttaagcat ctacttttga180atttatgttt acatttttca tggtaaggtg gccaatcttg tccgagatcc aacagaagct240agagatttgc attaattttt aagctcaata ttgatataaa taaagaattt ataagtttat300aaatatattt ttatttattt tattgttcat attcgaaact acaatatgtc gtacaatgaa360gttgtaatca taatttatta atttattaat gcatcaaaga taaattgatc aaattttggc420tctcttccat tgcttagatg ccaatcaaca atttggcttt catttcgaga ttcttttcac480cactttaaac gtgataagta actgataaat agcagtacta tgtgctgtcc atgcatcatt540aaataatggc taaagaatcg tctagacatt gactgaccag acttttaatt aattaaaaaa600aaaagtagga gtcctttaat gatgataatt tagaaagcag tgagattttg aagttgaagc660aagcttaggt aggtagcatg cagcaacaat gaattgttta attagatatg aaactgagta720ttaaactttg catggctttg aatgtggtgg ttgattacat gcaaaagtta agtcatgtat780agaagaaagg agtaaaatgg taataataac caattgaatg tgaaatgata ctatcaattt840ttcaaacagt taaaatccat ttttagcaga cactaacaaa gcatctatgg tgggacagtt900ttacaaacct tgctgtcaat ccataaaatt ttatttttac ctttatagat ggggaaggtg960gttttctgtt tactgtttca gtgatccaat ggtgacccac aaaagatcac atcaagaaaa1020acatgttgat acaatcacaa accgtcagat caggtgacct cattattaaa acaaaactcc1080cagtgatgag agagttgaat attttgaaaa accatagtat gggattggaa ggtcagaatg1140tcagaataat tttcatcagc caatgtatat atatttcaac aagtttgatt cttacattaa1200gtcgataagt ccaaacattg ggtcccatca aactgcatgt gtgccacgcg tactgggtac1260ccccatggta aggaggatcc cattataagc catacaactc ttacaggttc atactgcagt1320ttttagcctt ttgcccacaa accctaactg ggccaccatt ggtacagtcc ctacattaaa1380ttcacccccc cctccctcac tgtacttttc ttatcagttc ccttcaaagt taattttttt1440ctcacattta cttgtaatca aatttctagg gcttttggtc tctcgtcttt atttttcacc1500atatagaatc tctctctctc tctcttttaa gataatcaaa ttctctagag agaaaagaaa1560aaaaaa 156权利要求
1.陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子，其特征在于，该启动子全长序列为SEQ ID NO.1。
2.根据权利要求1所述的陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子，其特征在于，启动子F1片段序列为位于SEQ ID NO.1序列的80～1432bp区间。
3.根据权利要求1所述的陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子，其特征在于，启动子F2片段序列为位于SEQ ID NO.1序列的451～1432bp区间。
4.根据权利要求1所述的陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子，其特征在于，启动子F3片段序列为位于SEQ ID NO.1序列的1043～1432bp区间。
5.根据权利要求2～4之一所述的启动子片段F1、F2和F3构建的植物表达载体，分别为pF1-BI121、pF2-BI121和pF3-BI121。
6.包含权利要求1～5之一所述的启动子片段的BAC单克隆，该克隆在384孔板上保存编号为31E21。
7.权利要求1～5之一所述陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子在转基因植物中的应用。
全文摘要
本发明本发明涉及陆地棉纤维特异性表达基因GhMYB9启动子，属于生物技术领域，尤其涉及转基因植物和用于产生转基因植物的启动子，特别是纤维特异性启动子。对GhMYB9基因ATG上游1566bp的序列顺式调控元件进行分析，确定了转录起始位点(TSS)、TATA box和CAAT box。发现该序列包含多个光调控元件，同时具有生长素和赤霉素应答的基本元件。构建了3个GhMYB9基因启动子片段驱动GUS基因的植物表达载体。GUS组织化学染色证实，这3个启动子片段均能指导报告基因在棉花胚珠中正常表达。因此，GhMYB9启动子可用于研究棉花纤维的发育、品质改良以及外源基因在棉花纤维中的特异表达。
文档编号C12N15/82GK1936003SQ20061009676
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月13日 优先权日2006年10月13日
发明者张天真, 胡艳, 陆亚敏, 郭旺珍 申请人:南京农业大学