岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系及其培养方法

专利名称：岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系及其培养方法
技术领域：
本项发明是关于一种细胞系的建立及其培养的方法，即利用岷县黑裘皮羊的耳缘组织进行了细胞分离、初代培养、传代培养获得了高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系。本发明属于生物学领域。
背景技术：
畜禽遗传资源是生物多样性的重要组成部分，也是同人类关系最为密切、最为直接的部分，在全球，畜禽遗传资源为人类提供食物和农产品达30％以上。根据发达国家政府和世界粮农组织的预测，本世纪全球农业90％的品种都将通过分子育种提供而品种对整个动物生产的贡献率亦将达到50％以上。随着生产条件不断改变和人民生活水平的提高，人们对畜产品数量和质量增加，要求培育出适应性更强的、高产优质、具有独特性状的畜禽品种(系)，而这些必须依靠现存的畜禽遗传资源。因此加强对现有畜禽遗传资源的评价、保存和有效、合理、可持续利用具有重要意义。
世界联合国粮农组织(FAO)将动物遗传资源定义为所栖居在地球上已经改变或尚未改变的环境条件下，动物的繁殖、品种、类型和种群数量。生物遗传资源是生物科学研究的重要基础，是人类生存和社会经济可持续发展的战略性资源。国际上已将对生物遗传资源的占有情况作为衡量一个国家国力的重要指标之一。畜禽遗传资源是重要的生物资源，是人类食物与健康的直接来源，是基因工程与产业化发展的必需原材料。在多数发达国家里，随着畜牧生产体系的集约化，大量饲养的只是少数经济价值高的品种和杂交种，品种数目在迅速减少；在一些发展中国家里，虽然有较丰富的遗传资源，但由于保种不当和盲目引进外来品种杂交，使原有的地方品种的数量大大减少。从而导致世界性的遗传资源危机。
因此，畜禽遗传资源保护是关系到养殖业持续发展和生物多样性的重大问题。保护畜禽遗传资源对我国乃至世界畜牧业的持续发展，动物资源的开发利用具有重要的意义。因此，近年来世界各国越来越认识到遗传资源的重要性。1992年6月，包括中国在内的150多个国家共同签署了《生物多样性公约》，其3个主要目标为保护生物多样性，生物多样性组成成分的可持续利用，以公平合理的方式共享遗传资源的商业利益和其它形式的利用。此后生物多样性公约又陆续通过了《波恩准则》和《吉隆坡部长宣言》，以对全球的生物遗传资源进行保护与管理。
据最近统计，全球6165个畜禽品种中，有740(占12％)个已经灭绝、531个濒临灭绝(占8.16％)、1092个处于濒危(占17.71％)，状况不清楚的有1407个(占22.8％)，非危机的只有2395个(占38.8％)。1999年已经灭绝、濒临灭绝及濒危的品种占品种总数的比例较1995年所占比例分别增加82.09％、37.54％、19.02％，世界范围内的畜禽种质资源危机程度日益加剧。在国外，一些政府部门、组织机构，如联合国粮农组织(FAO)对畜禽遗传资源的保存和管理相当重视。
我国是世界上畜禽地方品种资源最为丰富的国家之一。地方品种的优异种质特性是几千年来多样化的自然生态环境所选择的结果。许多优良地方畜禽品种具有适应性强、耐粗饲、繁殖率高和产品优质的特点。通过相关调查和审核，我国畜禽遗传资源有576个品种(类群)，其中地方品种(类群)426个，占品种资源总数的74％；培育品种73个，占品种资源总数的12.7％；引进品种77个，占品种资源总数的13.3％。这些遗传资源特性各异，但由于受到大量外来高产品种引进等多种因素的影响，某些地方品种逐渐被杂交种取代，具有丰富遗传基因的地方品种由于不断被改良，数量急剧减少甚至消亡，这种趋势随着畜禽集约程度的提高正在进一步加剧。主要的576个畜品种中有158个由于规模减少已很大程度上丧失原有的育种潜力，占我国畜品种总数的36.6％，其中有32个不可挽救或已经绝种。在20世纪70年代末80年代初，在占品种总数的77％的地方品种中，畜禽品种资源普查结果证实，我国已灭绝的品种有10个，濒临灭绝的品种8个，数量减少的有20个。1996～1998年对全国17个省331个地方畜禽品种动态信息资源调查显示，有50个畜禽品种(或类群)濒危，9个品种(或类群)濒临灭绝，7个品种(或类群)已经灭绝。这种趋势随着近年大量引种和集约化程度的提高而进一步加剧，估计至少有30％的畜禽遗传资源处于灭绝的高度危险之中。
因此，从我国畜禽种质资源保存的实际出发，通过构建重要、濒危畜禽品种群体细胞系的方式来保存其基因资源，具有重要意义。
岷县黑裘皮羊是我国甘肃省裘皮用绵羊的地方品种，属山谷型藏羊，是我国养羊业中一个珍贵的地方品种资源。由于岷县黑裘皮羊所产的毛裘皮具有吸热保暖、毛穗美观、乌黑光滑、经穿耐用、不脱毛、不毡结、皮板轻柔细密等特点因而用其加工制作的皮衣深受广大消费者欢迎。岷县黑裘皮羊被列入2006年公布的《国家级畜禽遗传资源保护名录》，对岷县黑裘皮羊的遗传资源的保存具有重要意义。

发明内容
本发明的目的是提供高活率、高纯度的岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系，其保藏号为CGMCC No.1880。
本发明的另一目的在于提供上述细胞系的培养方法。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案高活率、高纯度的岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存(CGMCC，地址北京市海淀区中关村北一条13号；邮编100080；电话010-62542758)，保藏日2006年12月1日，保藏号CGMCCNo.1880，建议的分类命名为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系。该岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系具有以下特征岷县黑裘皮羊组织块接种6h后即有细胞长出，1～2d即可贴满瓶壁在倒置显微镜下可见细胞透明，胞质突起丰满，呈长梭形，胞核椭圆形、居中，核仁清晰，立体感强。当细胞生长成片后细胞形态为典型的成纤维状，为梭形或不规则三角形，细胞在生长时呈放射状、火焰状或旋涡状走形。细胞生长速度快、成活率高、外源基因表达率高、应用范围广。
一种高活率、高纯度耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，该方法包括下述步骤(1)初代培养将采到的岷县黑裘皮羊耳缘组织用加1％双抗的PBS清洗6～8次后剪切成0.5～1.5mm3的组织块；将组织块移入培养瓶并平铺在瓶底，倒置放在37℃，5％CO2的培养箱中培养3～4h；待组织块完全贴壁后加入培养基8～10ml，培养液成分DMEM+10％特级胎牛血清(FBS)。
(2)传代培养弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培养液6～10ml终止消化；消化后的细胞悬液平均分装入2个培养瓶中，放入37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。
(3)细胞冻存A、换液冻存前24h，弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，继续培养24h；
B、消化用胰蛋白酶消化培养细胞，然后加入培养液6～10ml终止反应；C、计数用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；D、收集1000rpm离心8min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；冻存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、分装将培养物分装入灭菌的冻存管中封口；F、预冻将冻存管装入程序降温盒中，置于4℃20～30min，然后转入-70℃预冻4～6h；G、冻存提出冻存管迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。
上述高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法方法中，步骤(1)所取的岷县黑裘皮羊材料以耳缘组织块为最佳。
上述高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其中，步骤(2)及步骤(3)中所述胰酶消化法的具体步骤是向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后，翻转消化30～60s。
上述高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其中，根据实际需要可以将步骤(3)冻存的细胞进行复苏，具体步骤为将冻存管从液氮中取出迅速放入42℃水浴中，并不停地晃动使其均匀解冻，解冻完全后，将细胞移入加有培养液的培养瓶中吹打均匀，1000rpm离心8min以洗去DMSO，离心后的细胞再用培养液重悬，放置含37℃5％CO2的培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。
本发明的优点与效益本发明对贴壁培养方法及培养液成分的进行了调整和改进，可以使培养出的成纤维细胞无上皮细胞等杂质细胞，细胞纯度比现有技术有大幅提高；对冻存条件的改进使复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定，且细胞冻存后的细胞活率可达到92.4％～98.6％，且细胞传代生长稳定，与现有培养技术培养的细胞相比有明显优势，适合大规模培养。以上对培养液的调整及培养方法的改进，大幅降低了成本。此外，本发明也在方法等各方面弥补了现有畜体细胞保存的不足，而且岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系活率及纯度的提升也使重要、濒危岷县黑裘皮羊品种的基因资源以体外培养细胞的形式得以长期保存。
本发明所述的高活率及高纯度的岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系可以为医学、细胞和分子生物学等生命科学研究提供大量的高品质材料；并可以作为体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上可以丰富、改良地方品种；还可以作为疫苗生产的主要原材料及干细胞培养的饲养层；同时可用于细胞凋亡及细胞融合研究。
下面结合附图及最佳实施方式对本发明做进一步说明，以使公众对发明内容有整体和充分的了解，而并非对本发明保护范围的限定。前述部分已经充分公开了本发明可以实施的保护范围，因此凡依照本发明公开内容进行的任何本领域公知的等同替换，均属于对本发明的侵犯。


图1为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞显微镜下图；图2为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞继代I细胞显微镜下图；图3为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞继代II细胞显微镜下图；图4为被支原体污染的成纤维细胞对照图；图5为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞支原体检测阴性结果图示；图6为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞生长曲线图；图7为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞核型图示；图8为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞乳酸脱氢同功酶电泳图示；图9为岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞苹果酸脱氢酶电泳图示；图10为pEYFP-N1基因在岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞中表达48h 100倍图示；图11为基因在岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞中表达72h 100倍图示；图12为pEYFP-N1荧光蛋白质粒转染细胞株400倍图示；具体实施方式
实施例中所用的主要仪器及试剂来源岷县黑裘皮羊来源甘肃省岷县(一)主要仪器设备1、激光扫描共聚焦显微镜尼康TE-2000-E；2、浮雕相差显微镜，Olympus IX-71；3、生物显微镜，Olympus CX31；
4、倒置相差荧光显微镜Olympus IX-71；5、-70℃超低温冰箱美国kelvinator；6、电动移液器德国Accu-jet；7、颇尔超纯水器Pall-pruelab_plus；8、CO2培养箱Heraeus BB16UV；9、液氮贮存器四川东亚YES-50B-125F；10、电泳仪北京六一厂DYY-6C；11、电泳槽北京六一厂DYC-24A12、高性能无菌实验台哈尔滨DL-CJ-2N；13、低速离心机CENTERIGUGETDL-40B；(二)主要试剂1、DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)；2、Plasmid Midi Kit质粒提取盒，Trizol试剂，cDNA合成试剂盒，cDNA PCR文库试剂盒，G418，pEGEP-N3质粒载体Clontech；3、胰蛋白酶(Trypsin 1∶250)，吉姆萨(Giemsa)Amresco；4、特级胎牛血清(Defined FBS)Hyclone；5、台盼蓝(Trypan Blue)，DMSO，秋水仙素(Colchicine)，EDTA，Triton(曲拉通)X-100＞99％，TEMED，Bis(甲叉双丙烯酰胺)98％，过硫酸铵(Ammonium Persulfate)，PMS，NAD，噻唑蓝(Thiazolyl Blue)，细胞松弛素B，Hoechst33342，离子霉素，6-DMAPSigma；6、甘油分析纯华绿渊；7、TrisPromega；8、丙烯酰胺＞99％(Acr)，甘氨酸＞99％(Clycine)NOVON；9、脂质体LipofectinGibco公司；成纤维细胞培养所用液体配制10、DMEM培养液DMEM 9.6g，溶于超纯水中，用NaHCO3约3.2g调节pH至7.2～7.4，加水定容至1L，用磁力搅拌器搅拌混匀，0.22μm滤膜过滤除菌，500ml/瓶分装，贮存于4℃。
11、培养液DMEM培养液中加入终浓度为10％(体积比)的FBS，0.22μm滤膜过滤500ml/瓶分装，4℃贮存。
12、双抗贮存液100万IU的链霉素4支，80万IU的青霉素5支溶于400ml灭菌去离子水中。
13、1×PBS缓冲液NaCl 4.00g，KCl 0.10g，Na2HPO4·12H2O 1.45g，KH2PO40.10g，加超纯水定容至500ml，pH为7.2，高压灭菌密封后4℃贮存。
14、0.25％(质量体积比)胰蛋白酶溶液1.25g胰蛋白酶干粉溶于PBS中，定容至500ml，pH为7.2～7.4，0.22μm滤膜过滤分装，-20℃贮存。
15、0.9％(质量比)生理盐水0.45g NaCl溶于500ml超纯水，高压灭菌30min。
16、细胞冻存液将50ml DMSO加入450ml全培养液(含体积比15％FBS的全培养液)中，用0.22μm滤膜过滤100ml/瓶分装，贮存于-20℃冰箱。微生物检测所用试剂17、大豆胰蛋白胨3g大豆胰蛋白胨，加100ml超纯水，调pH至7.3，高压灭菌15～20min，分装到15×150mm的玻璃管中。
18、麦芽汁2g麦芽汁加100ml超纯水，调pH至3～4，高压灭菌15～20min，分装到15×150mm的玻璃管中。
19、DAPI染液超纯水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。
20、封片液22.2ml 0.1M的柠檬酸，27.8ml 0.2M的Na2HPO4溶于50ml甘油中，NaOH调节pH至5.5，贮存于4℃。
21、固定液冰醋酸与甲醇以体积比1∶3的比例(现用现配)。
染色体标本制备所用试剂22、秋水仙素贮存液10mg秋水仙素溶于10ml超纯水中。
23、稀释液超纯水将贮存液稀释10倍至终浓度为100μg/ml。
24、低渗KCl溶液0.5g的KCl溶于100ml超纯水。
25、固定液冰醋酸与甲醇按体积比1∶3的比例配制。
26、Giemsa染色液原液将1g Giemsa染粉倒入研钵，加几滴甘油，在研钵内研磨至无颗粒为止，然后加甘油至33ml，放在56℃保温箱2h后，加入45ml甲醇搅拌均匀，棕色瓶中贮存备用。
工作液磷酸缓冲液将Giemsa原液稀释10倍至终浓度为10ml。
27、磷酸缓冲液的配制KH2PO40.34g加入100ml去离子水(用NaOH调pH 6.8)脂质体转染细胞所用试剂28、质粒DNA(EGFP-N3)，脂质体Lipofectamine，不含血清的DMEM培养液，含血清的DMEM培养液，pH 7.4的PBS。
同工酶分析所用试剂29、0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液分别称取0.9g NaCl和0.0223g EDTA溶于100ml超纯水中即可。
30、蛋白提取液将5ml TritonX-100加入75ml 0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液中即得蛋白提取液，将其贮于4℃冰箱保存。TritonX-100∶0.9％(质量比)NaCl-0.06mmol EDTA溶液＝1∶15。
31、40％(质量体积比)蔗糖溶液将40g蔗糖溶于100ml水中。
32、胶溶液的配制A液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 36.6g，TEMED 0.23ml，用浓盐酸调至pH 8.9B液Acr 40.0g，Bis 2gC液过硫酸铵0.14g(现配现用)D液1mol/L HCl 48.0ml，Tris 5.98g，TEMED 0.46ml，用浓盐酸调至pH 6.7E液Acr 10.0g，Bis 2.5gF液核黄素4.0mgG液蔗糖40.0g33、聚丙稀酰胺凝胶溶液浓度，见表1表1

34、电极缓冲液的配置6g Tris，28.8g甘氨酸溶于1000ml蒸馏水，pH调至8.735、电泳指示剂分别秤称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。
36、LDH染色液配制(染色前1h配制)乳酸钙100mg+0.05M Tris-HCl(pH8.0)20ml噻唑蓝5mg+超纯水1.0mlPMS 2.5mg+超纯水1.0ml辅酶I(NAD)10mg染色前，将以上保温试剂混合后，倒入20ml 2％(体积比)琼脂溶液中，混匀。
37、MDH染色液配制(染色前1h配制)DL-苹果酸350mg溶于25ml 0.1M Tris-HCl(pH8.0)中噻唑蓝15mg+超纯水1.5mlPMS 5mg+超纯水1.0ml辅酶I(NAD)10mg将以上混合后，倒入25ml 2％(体积比)琼脂溶液中。
38、固定液的配制乙醇10ml，乙酸40ml，甘油20ml，加水至80ml。
39、溴酚蓝溶液得配制分别称取0.25g溴酚蓝和40g蔗糖溶于100ml水中。
40、固定液冰醋酸与无水甲醇以体积比1∶3的比例混合，4℃贮存备用(现用现配)。
41、DAPI染液超纯水配制1mg/ml DAPI储存液，PBS稀释为0.5～1mg/ml。
42、封片液的配制将22.2ml 0.1mol/L柠檬酸与27.8ml 0.2mol/L Na2HPO4加入到50ml甘油中，用NaOH调pH至5.5，4℃贮存备用。
实施例1高细胞活率高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的构建(1)初代培养无菌条件下，将岷县黑裘皮羊耳缘组织样品用眼科剪刮去表面的毛，放入装有PBS的培养皿中漂洗6～8次，以去除表面血污及毛发；将组织剪切成1mm3左右的组织块；用移样器将组织块分别移入培养瓶中分散均匀，倒置培养瓶，并在37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养2～3h；组织块完全贴壁后加入培养基8ml～10ml，培养基成分DMEM+8％特级胎牛血清，继续培养10～12h；(2)传代培养弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，以除去残余的血清和脱落的组织块及死细胞，向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30～60s后，在倒置显微镜下观察细胞质回缩，细胞间隙增大时，加入全培养液(10％FBS的DMEM)15ml～20ml终止消化；消化后的细胞平均分装入2个培养瓶中，放入37℃，5％CO2的CO2培养箱中继续培养。
(3)细胞冻存A、冻存前24h，弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液8～10ml，培养液成分DMEM+10％特级胎牛血清，继续培养24h；B、向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30～60s后，加入全培养液8ml～10ml终止反应；C、用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；D、收集1000rpm离心8min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；冻存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、将培养物分装入灭菌的冻存管中严密封口，标明日期、品种、细胞名称、培养代数；F、预冻将冻存管装入程序降温盒中，放于4℃20～30min，然后在-70℃冰箱中预冻4h以上；G、冻存提出冻存管放入液氮罐中，即完成细胞冻存。
(4)细胞复苏将冻存管从液氮中取出，迅速置入42℃水浴中，连续晃动1min后，见余有小冰团成黄豆粒大小时放入超净工作台内；将细胞移入加有培养液(DMEM+8％特级胎牛血清)的培养瓶中轻轻吹打均匀，放置含37℃5％CO2的CO2培养箱中继续培养10～12h后即可继续传代培养。
实施例2 岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系生物学特性的检测对实施例1 培养的岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系进行生物学特性检查，方法及结论如下。一、细胞形态学观察方法细胞在体外培养过程中，对细胞进行常规检查，观察细胞生长状态、培养液颜色变化情况以及细胞是否发生污染。
结论如图1(岷县黑裘皮羊原代细胞)、图2(岷县黑裘皮羊传代前细胞)、图3(岷县黑裘皮羊继代1细胞)、图4(岷县黑裘皮羊胚继代II细胞)所示，当细胞生长状态良好时，其形态为典型的成纤维状，呈现梭形或不规则三角形。对细胞群体的全貌观察，所培养的细胞均呈放射状、火焰状或漩涡状走势，证明细胞生长健康旺盛。
二、微生物检测1、细菌、真菌检测方法(1)取冻存细胞量0.5％的冻存细胞，于8ml无抗培养液中混匀，细胞悬液以1000rpm离心20min，并重复两次，以消除抗生素的影响。再重悬于2ml无抗生素的培养液中。
(2)将细胞以0.5ml接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
(3)设对照为A.阳性对照枯草芽孢杆菌和白假丝酵母菌分别接种到胰蛋白豆胨和麦芽汁培养基中培养，置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
B.阴性对照胰蛋白豆胨培养基和麦芽汁培养基，分别置于37℃和26℃的培养箱中培养两周。
结论肉眼观察接种有岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞的大豆胰蛋白胨培养液和麦芽汁培养液，均呈现清亮透明状，将试管置于显微镜下观察，除动物细胞呈圆形的透明状亮点漂浮在培养液中，无其它异物。证明在细胞培养冻存及细胞复苏的整个过程中，细胞未被细菌、真菌污染。
2、病毒检测方法(1)接种待检测细胞培养物，用无抗生素的培养液培养至致密单层。
(2)采集新鲜的肝素抗凝全血(鸡血、豚鼠血)，1000rpm离心10min，弃上清。沉积的红细胞用PBS洗涤3次，用0.9％NaCl溶液悬浮，制成0.5％(V/V)的红细胞悬液。
(3)待检细胞弃除培养液，用0.9％NaCl溶液冲洗单层细胞2～3次。
(4)分别加0.5ml新鲜配制的鸡、豚鼠红细胞悬液于待检细胞瓶中，于4℃放置20min。
(5)观察红细胞凝集和吸附现象，不呈现红细胞吸附的细胞，需重复进行(2)～(4)的操作。
结论由于病毒表面有血凝素，能结合某些物种的红细胞，出现红细胞凝集现象。被这些病毒感染的细胞能够将鸡、豚鼠的红细胞吸附在其表面上。检测结果在无抗生素的条件下常规培养岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞，在相差显微镜观察，鸡的红细胞呈椭圆状悬浮在成纤维细胞上方，未出现凝集现象；豚鼠的红细胞呈圆形悬浮在上方，也未出现凝集现象。检测结果为阴性，证明该培养方法培养的细胞在培养过程中没有因为病毒而造成细胞损伤。
3、支原体检测方法(1)标本将成纤维细胞制成细胞悬液，调整细胞浓度为1×105个/ml。
(2)培养被检细胞在不含抗生素的培养液中传代培养3次以上(不低于3次)，在最后一次传代培养增殖期中换新鲜培养液，继续培养2～3d。
(3)接种阴性对照皿加细胞培养液2ml；待检皿内加入待检样品2ml，在盖片上培养的细胞汇合之前，从瓶中取出(如细胞完全汇合，影响对支原体的观察)。
(4)漂洗将细胞盖片置于碟皿中，用PBS漂洗，冷风吹干。
(5)固定用固定液浸泡盖玻片，固定细胞10min后，重复步骤(4)。
(6)染色将配制好Hoechst 33258染液滴加到固定好的细胞上，室温下染色30min。
(7)漂洗用PBS浸洗染色后的盖玻片3次，每次3～5min，冷风吹干。
(8)制片将一滴含1％甘油的PBS加到染色后的细胞表面，将有细胞的盖玻片面朝下覆盖在载玻片上。
(9)观察以100×～400×荧光显微镜观察，打开光源10min后，以330～380nm紫色荧光激发，观察细胞核外是否有蓝色荧光小点或丝状点的荧光物产生。
结论Hoechst 33258荧光染料能透过完整的细胞膜，嵌入DNA中，使之发出明亮的蓝色荧光。支原体内也含有DNA，亦能着色，在荧光显微电镜下观察可看到蓝色荧光。因此，在阳性对照中，除细胞核部位有蓝色荧光外，在细胞表面及周围也能看到蓝色点状或丝状荧光。而且在细胞表面同时有支原体DNA荧光染色颗粒和丝状小点，如图5所示。检测结果显示如图6所示，体外培养岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞制片后，在倒置荧光显微镜下，用380nm的紫色荧光激发，可以发现整个视野内可见的细胞表面均为光滑样，细胞核呈圆状或椭圆状，细胞核中的DNA发出蓝色荧光，且细胞周围无丝状或颗粒状小点。证明本细胞没有支原体污染。
三、细胞生长曲线绘制方法(1)悬液制备取待测生长状态良好的细胞，增至接近汇合时，用常规方法消化细胞制成细胞悬液，并计数。
(2)接种向24孔培养板内分别接种相同数量的细胞，一般1～2×104个/ml，于37℃CO2培养箱中继续培养。
(3)计数检测从接种时间算起，每隔24h计数3孔内的细胞密度，用血球计数板计算细胞总数，算出平均值，取3孔的平均值，如此至第8组结束。
(4)绘图以培养时间(d)为横坐标、细胞密度为纵坐标，将结果在坐标纸上绘图，即得培养细胞的生长曲线。
结论通过对所培养的岷县黑裘皮羊体外培养细胞用常规方法制备细胞悬液，计数，接种24孔培养板，每孔1ml细胞悬液，对接种于24孔培养板的细胞进行连续7d定时记数，记录各次细胞密度，绘制而成培养细胞生长曲线如图7所示，接种后第2d细胞数开始增加，第3d进入对数生长期，第6d细胞生长缓慢，细胞生长期总体趋势均呈S型，细胞接种后均有24h的潜伏期，此期为细胞的适应阶段，是细胞由于接种时胰酶消化而致的损伤后的修复时期，此后细胞呈指数增殖，即指数生长期，最后进入停滞期，细胞生长缓慢，几乎停止，可见有细胞漂浮。而细胞分裂指数(MI)最高值(培养第2d)在进入对数生长期前出现，并在培养第2～4d时维持于一个较高的水平，随后下降到初始水平。本发明方法培养的岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的纯度98.9％与现有技术培养细胞平均纯度91％相比有显著提高；且细胞群体倍增时间(PDT)为24h，与现有技术胶原酶消化技术和现有贴壁培养法获得的PDT-35.9h和48h相比具有显著的提高，证明细胞纯度高、生命力旺盛。
四、细胞活率测定方法检测冻存细胞的存活率可采用台盼蓝拒染试验，将待检细胞复苏后制成细胞悬液，取10μl细胞悬液加入10μl 1％台盼蓝染液，混匀。血球计数板计数，健康活细胞胞体完整，细胞透明，不着色，凡着色呈蓝色者为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞存活率。统计二种细胞总数，以活细胞占细胞总数的百分比反映细胞活力。
结论细胞冻存前后对岷县黑裘皮羊耳缘组织细胞进行细胞活率测定。结果表明冻存前细胞活率在95.8～98.7％之间，冻存后细胞活率为93.2％～96.7％，与现有细胞培养技术冻存后细胞活78.6％相比有显著的提高。且复苏的细胞与冻存前相比，细胞类型仍为成纤维细胞，细胞形态和生长速度没有发生变化，冻存细胞质量稳定。
五、核型的制备方法1、加秋水仙素取对数生长期的细胞培养物，加秋水仙素到培养液内，终浓度为0.1～0.4μg/ml。
2、在37℃培养箱中继续培养1～4h，使大部分细胞处于分裂中期。
3、采集分裂相细胞加0.25％胰蛋白酶溶液用常规方法消化，然后加培养液，终止胰蛋白酶对细胞的作用。转入15ml离心管，以1000rpm离心8min，收集细胞。
4、低渗将沉淀细胞用预热至37℃、0.075M KCl溶液2ml，重悬，吹打均匀后，继续加KCl溶液至10ml，放入37℃温箱中温育15min。
5、预固定悬液中加入新鲜固定液(醋酸∶甲醇＝1∶3)1ml，轻轻打匀。
6、固定将悬液以1000rpm离心8min，去掉上清夜，加入新鲜固定液5ml，打匀，室温静置20min。
7、重固定重复2次，离心后去掉部分上清夜，剩余1～1.5ml，混匀。
8、滴片滴2～3滴细胞悬液于45°倾斜载玻片，使细胞分散均匀，室温下干燥。
9、染色用磷酸盐缓冲液(pH6.8)稀释10倍的Giemsa液染色10min，自来水冲洗，空气干燥。
10、镜检油镜观察可见中期分裂相细胞和铺展的染色体，细胞质被染成蓝色，细胞核被染成淡紫色。
11、染色体照片及数据处理每个品种统计100个分裂相以确定染色体数目，按Denver(1960)会议和Leven标准(1964)测量并计算染色体的三个参数即相对长度、臂比值和着丝点指数，并确定染色体着丝点类型。三个参数的计算公式如下 12、封片过二甲苯两次后，用中性树胶盖玻片封片。
结论细胞系质量的国际标准之一是二倍体细胞的出现率达到85％以上，在本试验中，对100个岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞的染色体数目计数，只对其是否为整二倍体进行计算，分别以第1～3代的细胞为研究对象。统计结果为二倍体细胞占主体，为95％以上，说明所建岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系达到优质细胞的标准，细胞遗传性能稳定。
具体数据见表2，M代表中部着丝点染色体，SM代表亚中部着丝点染色体，ST代表亚端部着丝点染色体，T代表端部着丝点染色体。
岷县黑裘皮羊二倍体染色体数目为2n＝54，包括26对常染色体和一对性染色体，性染色体为X、Y，雄性为XY型，雌性为XX型。如图8所示，根据染色体大小顺序每对特征如下1-3号为近中着丝粒染色体4-9号为最大的端着丝粒染色体；10-18号为较小的端着丝粒染色体19-26号为最小的端着丝粒染色体X染色体为最大的近端着丝粒染色体，Y染色体是最小的着丝点染色体。
表2岷县黑裘皮羊染色体参数(♀)


六、同工酶分离方法采用不连续梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
1、收集细胞，用PBS重新悬浮，记数；2、清洗。用PBS洗细胞3次，离心弃上清夜；3、用蛋白提取液重新悬浮细胞，密度达5×107个/ml，吹打均匀；4、将细胞悬液移到1.5ml离心管中，4℃下以1×104rpm离心2min收取上清液，分装后置-70℃贮存备用；5、上清液加入等量40％蔗糖溶液，混匀即为样品液；6、用微量加液器向每个样品槽加样20～50μl，再用稀释10倍的电极缓冲液把每个样品槽补充满，然后向上下槽缓缓加入电极缓冲液。在上槽中加入1～2滴溴酚蓝，放入4℃冰箱；7、接通电源，上槽为负极，下槽为正极，调节电压为120V维持1h，再调至220V，待溴酚蓝迁移至下端0.5～1cm处停止电泳，约5h；8、电泳完毕，切去浓缩胶，用蒸馏水漂洗两次后，浸入染色液中置37℃温箱中保温染色30～60min，胶条染色后用凝胶固定液固定后照相；9、用相对迁移率(Rf)表示，即区带泳动距离(d)与指示染料泳动距离(D)之比，计算公式为Rf＝d/D×100％。区带泳动距离一律按区带后缘的距离测量。
结论如图9所示，岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞的乳酸脱氢同工酶酶谱从“阳极”到“阴极”分别为LDH1，LDH2，LDH3，LDH4，LDH5，酶活性强弱依次为LDH4＞LDH3＞LDH2＞LDH5＞LDH1。如图10所示，岷县黑裘皮羊的苹果酸脱氢酶谱呈现2条区带，即sMDH(细胞质型)区带组和mMDH(线粒体型)区带组，且后者比前者泳动速度慢。具体数据见表3，表4。
表3 LDH同工酶的相对迁移率

表4 苹果酸脱氢酶的相对迁移率

上述同工酶电泳结果表明所培养的体细胞遗传性能稳定，纯度高，细胞之间未发生交叉污染。
LDH及MDH基因的表达受遗传基因和代谢物的双重控制，电泳速度快的区带本身分子量小。若细胞被污染，则会因为每个品种的迁移率不一样，结果就可能出现比现在更多数目的区带。利用岷县黑裘皮羊体外培养成纤维细胞进行乳酸脱氢同工酶(LDH)和苹果酸脱氢酶(MDH)谱系分析可以得到清晰的特征谱系，表明所培养的体细胞遗传性能稳定，纯度高，没有与其他品种的细胞发生交叉污染。
七、pEYFP-N1在培养细胞中的表达及阳性细胞株的建立方法1、荧光蛋白报告质粒pEYFP-N1的制备及鉴定按照Plasmid Midi Kit质粒提取盒说明书，提取、纯化pEYFP-N1荧光蛋白基因质粒。将所得质粒溶于TE(PH8.0)低盐溶解液中，用紫外分光光度计测定其质粒浓度(质粒浓度[μg/ml]＝OD260×50μg/ml×稀释倍数)，得到的pEYFP-N1荧光蛋白质粒浓度为0.31μg/ml质粒DNA，OD260/OD280值在1.80～1.86之间，实验结果表明所提取质粒较纯，无RNA、无水乙醇和蛋白质等杂质。再用Nhe I和Xba I双酶切后，用1％琼脂糖电泳鉴定酶切结果，可以得到约750bp和4kb两条谱带。根据荧光蛋白质粒酶切图谱分析所获质粒确为所需pEYFP-N1荧光蛋白质粒。
2、脂质体介导法转染成纤维细胞(1)、于转染前一天，用胰蛋白酶溶液消化细胞培养物，将细胞接种到6孔(或35mm)的培养板内，每孔1～2×105细胞，加2ml含血清培养液；(2)、置37℃的CO2培养箱中培养细胞达到70～80％的汇合程度；(3)、转染前，在倒置显微镜下观察，挑取生长旺盛、形态好的细胞用于转染；(4)、将待转染的细胞不含血清的培养液漂洗细胞两次；(5)、合并溶液A和B，轻轻混合后于室温下静置45min，然后加入0.8ml不含血清的培养液；(6)、将DNA、脂质体和不含血清的培养液的混合物滴加在培养版中待转染的细胞表面，于CO2培养箱中继续培养5～24h；(7)、倒掉转染夜，加入含血清的培养液，于培养箱中继续培养细胞；(8)、在513nm激发光激发下观察黄色荧光蛋白的表达结果，计算转染效率。
3、细胞凋亡的检测(1)、将细胞以4.0×105个/ml密度接种于12孔培养板中，每孔3ml，37℃、5％CO2培养箱中培养至细胞贴壁。
(2)、DAPI染色倒掉细胞的培养基，用1μg/ml的DAPI-甲醇工作液冲洗一次后再用DAPI-甲醇工作液覆盖细胞，37℃温育15min，再倒掉染色液，用甲醇冲洗一次。
(3)、激光扫描共聚焦显微镜下观察并拍照。
4、转染抗性细胞的筛选(1)、将岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞转至25mL培养瓶中，每瓶加5mL细胞全培养液，待细胞长满，按下列浓度加G4180、100、200、300、400、500、600、700、800g/mL，继续培养，观察细胞生长及死亡情况，每3天换液1次，仍以上述浓度加G418，两周内使细胞全部死亡的最小浓度即为最小致死量。确定浓度为800g/mL。
(2)、转染48h后，将细胞按1∶4密度传代，继续培养至细胞密度达70％-80％融合，弃培养液，更换浓度800g/mL的G418全培养液进行筛选，每3天换一次培养液，约10d后，对照细胞大部死亡，观察每孔中细胞克隆的形成数及荧光表达强度。G418培养液浓度换为300g/mL继续筛选培养，基本得到G418抗性细胞的稳定克隆。挑选荧光表达最强的单个细胞克隆转至50mL培养瓶进一步培养、传代扩增。
4、单克隆阳性细胞株荧光蛋白基因整合、表达的检测及鉴定从挑选扩大培养的黄色荧光蛋白阳性表达的岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞培养物中提取基因组DNA，黄色荧光蛋白阳性RNA采用Trizol试剂提取，mRNA的反转录根据cDNA合成试剂盒，cDNA PCR文库试剂盒说明书的方法进行。设计了特异引物P1(5’-TTCTCGCCACCATGGTGAGCAA-3’)，P2(5’-TTCTCGCGGCGGCCGCTTTACTTGT-3’)扩增6种荧光蛋白阳性细胞基因组DNA，用同一对引物对黄色荧光蛋白阳性细胞RNA进行RT-PCR，引物18S51(5’-GGCAGCGTCCGGGAAACCAAATTC-3’)和18S31(5-CCACCACAGATCAGAGAGC-3’)扩增18sRNA作为RT-PCR内参照。PCR反应总体积为25μl，PCR程序95℃热变性5min，然后以94℃，30s；57℃，30s；72℃，30s进行35个循环后，用1％的琼脂糖凝胶电泳检测荧光蛋白基因的整合及表达情况。
结论如图11、12所示，岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞的转染峰出现在转染后48h，转染率为63.5％；转染72h后阳性细胞和部分阳性细胞荧光强度均逐渐减少、减弱。将细胞以1∶4的比例传代，传代3～4h待细胞贴壁后，开始用G418筛选，筛选2周后，获得的多个克隆中，有些仍能看到荧光表达，有些看不到，挑选表达强烈的克隆进行了扩大培养，目前传了8～13代，这些细胞仍然表达荧光，而且荧光强度仍然强烈。利用设计荧光蛋白基因特异引物，对提取的pEYFP-N1荧光蛋白阳性细胞基因组DNA进行PCR扩增，获得了一条750bp左右的片段，与设计的引物预期扩增的片段大小正好相符，说明荧光蛋白基因都已经整合到细胞的基因组染色体上。用同一对引物，对提取的pEYFP-N1荧光蛋白阳性细胞RNA反转录获得的cDNA进行扩增，也获得了750bp左右的片段，RNA水平上证实了荧光蛋白基因在岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞中能够正常的转录、表达。成功获得了已经整合到细胞核染色体上的pEYFP-N1荧光蛋白基因阳性细胞株。如图12。
实验证明pEYFP-N1报告基因在本岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系细胞表达率远高于其它细胞系的30～40％，表达率均在60％以上。本研究结果对于标记基因、核移植及转基因动物克隆等研究具有重要的参考价值。
权利要求
1.一种高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系，其特征在于，其保藏编号为CGMCC No.1880。
2.一种高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，该方法包括下述步骤(1)初代培养将岷县黑裘皮羊耳缘组织用PBS漂洗6～8次后用眼科剪剪成1mm3左右的组织块；将组织块移入倒置培养瓶中，并在37℃，5％CO2的CO2培养箱中培养2～3h；待组织块完全贴壁后加入培养液8～10ml，培养液成分DMEM+10％特级胎牛血清，继续培养10～12h；(2)传代培养弃除步骤(1)培养瓶内的培养液，用PBS洗涤培养瓶内残留物2次后，用胰蛋白酶消化后加入培养液6～10ml终止消化；消化后的细胞悬液平均分装入2个培养瓶中，放入37℃，5％CO2的培养箱中继续培养。(3)细胞冻存A、换液冻存前24h，弃除培养瓶内培养液并更换新鲜培养液6～10ml，继续培养24h；B、消化用胰蛋白酶消化培养细胞，然后加入培养液6～10ml终止反应；C、计数用红细胞计数板计算冻存前细胞总数；D、收集1000rpm离心8min，去上清液，加入4℃预冷的冻存液1ml，混匀后用吸管轻轻吹打使细胞重悬；冻存液成分10％DMSO+50％胎牛血清+40％DMEM；E、分装将培养物分装入灭菌的冻存管中封口；F、预冻将冻存管装入程序降温盒中，置于4℃20～30min，然后转入-70℃预冻4～6h；G、冻存提出冻存管迅速投入液氮柜中，即完成细胞冻存。
3.根据权利要求2所述的一种高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述的岷县黑裘皮羊组织材料以幼龄为最佳。
4.根据权利要求2所述的一种高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，步骤(2)及步骤(3)中所述的胰酶消化具体步骤是向培养瓶内加入0.25％胰蛋白酶1～2ml，倒置培养瓶于温箱中预热至37℃后翻转消化30～60s。
5.根据权利要求2所述的一种高活率、高纯度岷县黑裘皮羊耳缘组织成纤维细胞系的培养方法，其特征在于，将步骤(3)冻存的细胞进行细胞复苏，具体步骤为将冻存管从液氮中取出置入42℃水浴中，连续晃动1min后，将细胞移入加有培养液的培养瓶中吹打均匀，放置37℃、5％CO2的培养箱中培养即可。
全文摘要
本发明利用岷县黑裘皮羊耳缘组织进行细胞初代培养、传代培养及细胞冻存，并最终获得了高活率、高纯度的岷县黑裘皮羊成纤维细胞系，其保藏编号为CGMCCNo.1880，属于细胞生物学领域。本发明培养出的成纤维细胞无上皮细胞等杂细胞污染，细胞纯度高；冻存细胞质量稳定，经冻存复苏后的活率仍可达到并维持在92.4％～98.6％之间；传代生长稳定，适合大规模培养。本发明涉及的岷县黑裘皮羊成纤维细胞系可以为基因工程、细胞工程、免疫学和分子生物学等生命科学研究提供大量高品质材料；也可作为家畜体细胞克隆育种的供体细胞；在农业上能丰富并改良地方品种，同时可作为地方优良品种的保种手段之一；还可作为疫苗生产的主要原材料。
文档编号C12N5/06GK101020897SQ20061016194
公开日2007年8月22日 申请日期2006年12月11日 优先权日2006年12月11日
发明者马月辉, 关伟军, 张艳艳, 马忠仁, 陈莉娜, 刘长青 申请人:中国农业科学院北京畜牧兽医研究所