专利名称：：铵和磷酸盐离子在改进荧光素酶检测中的应用的制作方法铵和磷酸盐离子在改进荧光素酶检测中的应用本发明涉及利用生物焚光(生物发光，bioluminescence)一全测酶活性的方法和i式剂盒。更具体i也，本发明涉及一种具有增加的光产生的新的检测系统，用于灵敏和便利地检测荧光素酶活性。生物荧光是一种自然发生的现象，其已被用于许多应用，尤其是在与酶相关的分子生物学中已一皮用作遗传才艮告子(geneticreporter)。生物萸光只t于作为遗传标i己近乎是理想的。通常，在哺乳动物细胞中没有内源性发光活性，而实验地引入的生物荧光几乎是瞬间的、灵敏的和定量的。虽然许多物质表现出生物荧光，但是<又有相》于4艮少的一部分#皮表4正和克隆。在这些之中，^又有萤火虫(尸/70/m^;^r"//5)荧光素酶、海肾(Renilla)萸光素酶和水母(Aequorin)体内的发光蛋白已得到了较多利用。对萤火虫荧光素酶产生生物荧光的机制的分子组分的研究已表明，酶的底物是萤火虫荧光素，一种多杂环有机酸，D-(-)-2-(6，-羟基-2，-苯并噻唑基)-A2-蓬唑啉-4-羧酸(下文中称为"荧光素")。萤火虫焚光素酶是一种在两步过程中催化荧光素氧化的单体61kD酶，其产生560nm的光。第一步艰《涉及在《美存在下，通过用ATP的a-磷酸盐的乙酰化而对荧光素的羧酸盐的活化，以通过无机焦磷酸盐(PPi)的消去而生成虫荧光素基H苷酸盐。在第二步骤中，该虫荧光素基腺苷酸盐被分子样氧化而生成AMP、二氧化碳和氧合虫荧光素(oxyluciferin)。产生的氧合虫荧光素处于电子〗敫发态。在转变为基态时，该氧合虫荧光素发出光。下文提及的"荧光素-荧光素酶反应"反应的反应方案如下荧光素酶荧光素+ATP+Ch-氧合虫荧光素十AMP+PPi+C02+光Mg2+荧光素酶具有许多特性，〗吏得其成为理想的才艮告酶(reporterenzyme)。它的活性不依赖于4壬^T翻i奪后的》务饰，4吏其可以立即用于定量。另外，相比于许多其他的生物发光反应和化学发光反应，该荧光非常明亮，具有非常高的量子效率。当通过将荧光素酶加入到含有ATP、Mg2+(或其它二i"介阳离子如Mn2+)和焚光素的反应混合物(其中所有组分都是4妄近或处于々包和浓度)中来引发光发射时，可以观察到光强度的快速增加，随后在开始的几秒内快速降低到可能持续几小时的低水平的不变光强度。这种在反应速率上的快速降低已被认为是由于产物抑制作用所致。这些利用萤火虫荧光素酶的传统"快速(flash)"型4企测法产生一种闪光，其随着底物加入到酶中而快速衰减。特别是在自动4匕(例如，机器人)4企测程序中，由于显著地缩短了其中信号(如果存在)可以一皮4企测的时间窗，这成为主要问题。迫切需要可延长焚光素酶检测中的光信号的持续时间的方法。一种用来解决荧光素-荧光素酶反应的动力学问题以及准确测定在闪光过程中发出的光的相关困难的方法(某种程度上普遍实现)是利用各种该酶的抑制剂，据才艮道其可阻止闪光发生或延长光产生。一种这样的试剂是砷酸盐。砷酸盐降低闪光高度并趋向于延长发光期。但是光信号强度的降低是非常不希望的，尤其是在使用能够读出频带的微滴定板或设备的情况下。另外，从环境角度上来i兌，4吏用石申g臾盐不是理想的。美国专利4,246,340同冲羊基于使用抑制剂(如D-荧光素的类似物)提出了一种用于延长在荧光素-荧光素酶分析中的光信号的方法。这将光信号从几秒延长到几分钟。已才艮道，辅因子辅酶A(CoA)影响荧光素-荧光素酶反应中的发光方式。Airthetal.,BiochimicaetBiophysicaActa,vol.27(1958)pp.519-532报道了，当将CoA加入到萤火虫荧光素-萤火虫焚光素酶反应混合物中时，对光强度的初始峰没有影响，〗旦焚光将在4交高K平4寺续一个时间期，该时间期与加入的总CoA成正比。Airth等人已证实，在CoA存在下的总发光比没有CoA的总发光更大。美国专利5,283,179也4皮露了在一全测试剂中加入辅酶A(CoA)可以产生更大的酶变4奂(enzymeturnover)以及由jt匕更大的荧光强度。这导致维持至少60秒的增加的光输出。已报道，其他巯基化合物有助于在酶制备和贮存期间的荧光素酶的稳定性。美国专利第4,883,075号披露了，二硫苏糖醇(DTT)将成年北美荧光虫(/^o"m/s户yra/^)荧光素酶溶液中的荧光素酶活性维持在50%的水平，而该溶液在没有DTT的情况下，仅具有10。/。残留的酶活性(相比于新鲜制备的荧光素酶〗容液)。美国专利第4,614,712号描述了，当细菌焚光素酶已经通过形成二碌"匕物而-波灭活时，酶活性可以通过加入DTT、(3-巯基乙醇(P-ME)、或其4也还原剂而^皮'l"灰复。美国专利5,618,682号描述了用于延长荧光素-荧光素酶反应中可才全测的光子发射的4寺续时间的组合物和方法。为了达到这个目的，将含有荧光素酶、荧光素、ATP、以及对于荧光素酶催化活性所需的辅因子的反应混合物与含有单磷酸腺苷(adenosinemonophophate)、自由基清除剂(DTT)和螯合剂(EDTA)的组合物力口以';毘合。美国专利5，650，289报道了，在反应混合物中的CoA和DTT的联合4吏用积极地影响了荧光素-荧光素酶反应的动力学。光信号的半衰期(即，观察到50%的初始光信号的时间期)估计为300-500秒。本发明的一个目的是提供一种具有改进的光输出和延长的辉光发射的可替换荧光素酶4全测系统，用于萤火虫荧光素酶才艮告酶的灵敏检测。令人惊讶地，已发现该目标通过在磷酸盐阴离子和铵阳离子存在下实施荧光素-荧光素酶反应而达到。因此，本发明涉及一种用于才企测样品中的荧光素酶活性的方法，包4舌在菱光素和ATP以及任何所需辅因子(例如，Mg"或Mn2+)存在下孵育该样品或该样品的一部分，以允许产生光信号，其中所述孵育是在包括磷酸盐和铵离子的反应混合物中实施的以增强所述光信号，以及4全测该光信号。如本文中证实的，反应混合物中铵和磷酸盐的组合存在产生强光信号，其在相对长的时间期是稳定的。可获得半衰期在30分钟直至达8小时的光信号。本发明的一个优点在于，提供了对荧光素-荧光素酶反应中光产生的动力学以及产生的总光的改进，这4吏得对于荧光素酶的4企测简单和灵每文。例如，利用本发明的方法或4全测试剂盒，所述一企测不需要特殊的程序，如快速样品注入，或特殊设备如复杂的光度计，以冲全测在传统荧光素-荧光素酶反应的快速闪光中发出的光。事实上，利用本发明的方法和组合物或试剂盒，诸如闪烁计数器的装置(在多数用于其他类型检测的实验室已可获得)可在荧光素-荧光素酶反应中产生的光的4全测所需的测定中加以采用。这显著地扩大了这样的^^测在科学冲支术中的应用，其有利于在不具有光度计1"旦具有闪烁计数器或用于检测光产生的其他装置的实验室中利用所述检测。本发明的方法或检测试剂盒的另一优点在于，由于持续的高信号，所以大量样品可在微板中加以制备并对焚光素酶活性进行检测。这特别是在高通量筛选(hts)应用中的分批和连续处理样品方面;f艮有用。根据本发明，反应混合物含有相对高浓度的磷酸盐和铵离子。一般来说，观察到，磷酸盐浓度越高，荧光素-荧光素酶反应的总光输出就越高。总光输出或总发光是指在表示作为时间的函数的可检测光单位的曲线下的面积。其由峰强度(即，在酶和底物结合时发出初始闪光(光脉沖，lightburst))以及在达到峰强度之后的强度降^氐速率所决定。反应混合物中的总磷酸盐(酯)浓度优选为至少10mM,优选为至少25mM，更优选为至少60mM，最优选为至少100mM。例^口，可<吏用125mM、150mM、200mM、500mM或1M的石粦酉臾盐(酉旨)浓度。如在以下实施例中举例i兑明的，测试了高达1.4M石粦酸盐(酯)浓度的磷酸盐(酯)，在初始光信号和光信号的持续时间方面，其产生了良好的结果。如本文所使用的，术语"磷酸盐(磷酸酯或磷S吏根，phosphate)，，是指由一个磷原子和四个氧构成的多原子离子或原子团。以离子形式，其带有-3形式的电荷，并表示为po-。在生物化学环境下，溶液中的游离磷酸盐离子^皮称为无机磷酸盐。无才几磷酸盐通常表示为Pi。合适的磷酸盐来源包括磷酸(H3P04)及其盐，如P043—、HP042，pH2P(V的石威金属盐或石咸土金如本文所使用的，术语"铵离子"是指通式NR4+的阳离子，其中r基本上可以是任何基团。优选的r基团包括脂肪族基团如直链或支链烃(可选地例如被羟基所取代)和氢。配位氮原子的四个r基团可以是相同的或不同的。铵离子可由能够在水溶液中提供nr/离子的任何化合物而被提供到反应混合物中。在一个具体实施方式中，铵离子通过一种或多种铵(NH4+)盐如(NH4)2S04、NH4H2P04和(NH4)2HP04加以提供。NH4H2P04和(NH4)2HP04是非常合适的，这是由于这些盐才是供石粦酸盐阴离子以及铵阳离子。在进一步的实施方式中，铵离子可通过质子化的胺来提供。胺是氨(NH3)的有机衍生物。一个、两个或三个烷基基团可以取代氨上的氬而分别得到伯胺、仲胺或叔胺。与氨一样，氨衍生物和胺是弱碱。这意味着如果将胺与水混合，则胺的水溶液是石咸性的。氮上的孤对电子可从水吸引质子而形成铵离子和氬氧离子。根据本发明，假定终浓度为1M的乙醇胺提供具有1M的铵离子的含水反应混合物。因此，认为反应混合物中铵离子的浓度与反应混合物中4妄离子来源化合物(緩冲液、盐等)的浓度相同。常规脂肪胺具有大致相同的碱强度，其中pKb的范围为3-4并且是比氨稍强的碱。相比于氨的碱性的增加可归因于相比于铵离子NH4+、烷基铵离子例如RCH2NH3+具有更大稳定性。这种较大稳定性由烷基基团的供电子效应以及正电荷从烷基铵离子中的氮部分到碳上而得到的局部离域作用所致。芳族胺是pKb为约9-13的更弱的;威。这可通过孤对电子共振离域到芳香兀-体系中进行解释。如从上述可清楚的，本发明:波露了荧光素-荧光素酶反应混合物磷酸盐和铵离子的组合存在增强荧光素酶检测系统的总发光。应当注意(参见下文中实施例4)，这种对总光l命出的有益效果在用于ATP检测的系统没有观察到，如在荧光素酶检测系统一样，该检测ATP的系统也采用荧光素-荧光素酶反应。在ATP测定中，大量荧光素酶(作为4企测试剂)和少量ATP(样品中存在的)连同大量Tris-磷酸盐离子，与4全测混合物中不存在或存在少量Tris-磷酸才艮离子相比产生了更低的总发光。相反，增加量的Tris-磷酸盐离子浓度增强了荧光素酶4全测混合物中的荧光反应的光输出，包括大量的ATP(作为检测试剂)和少量的荧光素酶(来自样品)。据报道，萤火虫荧光素酶的酶特性在分别设定用于ATP4企测和焚光素酶检测之间是不才目同的。(参见例嗦口Yeetal.in"APracticalGuidetoIndustrialUsesofATP-LuminescenceinRapidMicrobiology"publishedin1997byCaraTechnologyLimited,Lingfield)。i口本发明才皮露的，4妄和石粦f臾盐离子的组合对荧光素酶检测系统和ATP检测系统的不同作用极有可能与不同酶特性相关。在一个实施方式中，本发明的一种方法包括一全测样品中的焚光素酶活性，包括在荧光素以及过量(相对于荧光素酶)ATP和二价阳离子存在下孵育样品以允许产生光信号，其中所述光信号的总光输出通过在包含铵离子和至少20mM磷酸盐离子以及铵离子的反应混合物中实施该孵育而得以增强，以及检测该光信号。优选地，焚光素/荧光素酶4全测混合物中ATP浓度为至少0.05mM,4尤选;也为至少0.1mM，例如在0.5-5mM范围内的ATP。在本发明的方法中，4吏用的胺优选在反应混合物的pH(通常的范围在pH5和pH9之间)下被质子化。这意味着该胺的pKb优选地低于反应混合物的理想pH。下表1列出了胺的一些实例以及它们的pHb值。伯和仲烷基胺或链烷醇胺，如乙胺、二乙胺、乙醇胺和二乙醇胺在本发明的方法中非常有用。然而，也可4吏用某些4又胺如三乙胺。基于胺的緩冲液在实现本发明中非常有用。基于胺的緩沖液的实例包括Tris(三(羟甲基)氨基曱烷)和Bis-Tris(二(2-羟乙基)亚氨基)-三(羟甲基)甲烷)。此外，可以使用杂表l:各种胺的结构、pKb和pKa<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>更进一步地，可以使用两性离子化合物为荧光素酶反应混合物々是供4妄离子。才艮据定义，两性离子(来自德语"zwei",意思是"二")是在同一分子中含有正电荷离子和负电荷离子的离子。两性离子可通过含有酸性和石威性基团的化合物形成。氨基酸是两性离子化合物的典型实例。由于羧基和氨基官能团存在于氨基酸中，所以这两种官能团趋于以相同方式相互反应，生成一种"内盐"，其含有羧酸盐阴离子和铵阳离子功能。由于平衡远离该盐，所以氨基酸的优势结构是两性离子结构。例如，甘氨酸含有碱性氨基基团(NH2)和酸性羧基基团(COOH);当这些基团在水溶液中被离子化时，酸基团失去一个质子给予氨基基团，并且该分子在一端带正电荷而在另一端带负电荷。在大致酸性溶液中，两性离子的羧酸官能团被质子化，由此形成具有4妄离子官能团的阳离子结构。这是两性离子的共辄酸(通过质子化氨基基团，氨基酸的中性形式、不带电形式也一样)。才艮据本发明，具有氨基基团的共轭酸的pKa高于荧光素-荧光素酶反应混合物的pH的两性离子化合物是优选的，因为这确保了胺部分净皮质子化。另一类有用的两性离子化合物以两性离子緩沖液表示。表2歹'J出了一些示例性常用两性离子緩沖液(可用于本发明中)。然而，本发明并不局限于4吏用以下列出的那些两性离子緩沖液。表2:两性离子緩冲液<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>在本发明的一种方法中，反应混合物pH的范围通常在5和9之间，优选在6.5和8.2之间。如从上述可以清楚的，》粦酸盐源和4妄源的许多组合可用于本发明的荧光素酶反应混合物中。对于给定离子也可以4吏用多于一种的来源。已发现;粦酸盐/铵源的某些组合尤其有用。对于用于本发明中特别感兴趣的是基于胺的离子緩沖液的组合(如Tris或Bis-Tris),其是用磷酸中和的。在本发明的荧光素酶反应混合物中的铵离子的浓度可以变化。优选至少20mM,更好地大于60mM的4妄离子浓度。在高于100mM铵离子浓度下观察到极好的光输出，在高于200mM铵离子浓度下，例如250mMTris或乙醇胺或500mM《妄(NH4+)甚至更好。才艮据本发明，反应混合物中的石舞酸盐离子和4妄离子的浓度可以是相同的，或者它们可以是不同的。在一个实施方式中，铵离子的浓度高于磷酸盐离子的浓度。在另一实施方式中，铵离子浓度低于磷酸盐离子的浓度。在特定方面，铵离子以超过磷酸盐离子存在，例如《妄离子至少l.l倍过量，优选至少1.4倍过量，如1.5、1.7、1.8或者甚至2倍过量。如以下例举的，使用超过(例如，2倍)磷酸(作为磷酸根离子)的Tris作为铵离子源，尤其是在至少60mM的磷酸盐浓度和/或在至少120mM的铵离子浓度下，可获得极好的结果(参见表3)。参见表4和表5，其示出了增加乙醇胺(表4)或铵(表5)和磷酸盐的浓度对荧光素酶反应的总光输出的影响。这里同样，铵离子超过磷酸盐离子存在。这是由于用磷酸中和含有铵离子(Tris,乙醇胺，磷酸铵)的溶液至pH7.0的结果。当然，含水反应混合物的最终pH仅由铵和磷酸盐离子来控制并不是先决条件。例如，本发明也可涵盖在过量铵离子中的磷酸盐离子的反应混合物，其可通过不是铵离子来源的石威性试剂如NaOH、KOH等加以中和。以类似方式，不同于贡献磷酸盐离子的那些的酸性试剂可用来将pHi殳定为期望值。在一个实施方式中，4吏用Tris緩沖液和石寿酸的组合。例如，包括用63mMH3P04中和的125mMTris的两倍;险测緩冲液向反应混合物提供了足够的磷酸盐和铵离子，以积极地影响光信号的振幅和动力学。增加Tris和/或磷酸盐浓度进一步增强这种作用(也参见图1)。在包含至少250mMTris(具有至少125mM磷酸盐)的反应混合物中获得了非常满意的结果。其他有用的组合包括单烷醇胺和二烷醇胺以及磷酸。在一个方面，荧光素酶反应混合物包4舌用石岸酸中和至大约pH=7.0的乙醇胺(参见图2)。反应混合物优选还包括焚光素酶的稳定剂。合适的稳定剂实例是哺乳动物血清白蛋白，一种乳清蛋白和一种卵清蛋白。优选使用牛血清白蛋白(BSA)。基于反应混合物的总重量计算，稳定剂的量通常低于1wt%。而且，反应混合物优选包括掩蔽剂(或螯合剂)如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-二(2-氨基乙基醚)-四乙酸(EGTA)或环己烷-1,2-二胺四乙酸(CDTA)。掩蔽剂一4殳以0.1~25mM的量存在。本领域已知的用于检测荧光素酶活性的方法通常包括含硫醇的化合物，如DTT和/或CoA(例如参见美国专利5,650,289)。虽然报道硫醇有助于荧光素酶的稳定性并改进了光产生的动力学，但它们具有若千缺点。含硫醇的制剂具有刺激性气味。此外，硫醇在溶液中发生自氧化，因此在长时间里是不稳定的。本发明人意外地发现，如果4妄和石粦酸盐离子同时存在，则在荧光素酶反应混合物中的硫醇化合物不再是必需的。发现在没有石克醇但存在铵离子(例如由Tris緩冲液提供的)和磷酸盐离子的情况下的总光产生与硫醇存在下的光产生相近或者甚至超过。这里，本发明提供了一种一全测样品中荧光素酶活性的方法，包括在荧光素、ATP和二价阳离子(例如Mg^或Mn2+)存在下孵育样品以允许产生光信号，其中所述孵育是在包含磷酸盐和铵离子而相对没有含硫醇化合物的反应混合物中实施的，以及测量该光信号。表达"相对没有含碌u醇〗匕合物"用来表示没有外源性或补充的硫醇化合物如DTT、谷胱甘肽和/或CoA被加入到反应混合物中。在一个实施方式中，本发明的反应混合物和测定分析试剂没有或基本上没有硫醇化合物。然而，可能会出现待用于荧光素酶活性测定的样品的痕量硫醇化合物(例如，细胞起源的石克醇，或者来源于分离溶解溶液的碌vJ事)对反应混合物有利。在一个优选实施方式中，本发明提供了一种检测样品中的荧光素酶活性的方法，包4舌在荧光素和ATP以及二4介阳离子存在下孵育该样品以允许产生光信号，其中所述光信号的总光输出通过在包含铵离子和^寿酸盐离子^f旦没有外源性或补充的碌^醇^匕合物(例如，没有非细胞起源的石克醇化合物)的反应混合物中实施所述孵育，以及测量该光4言号。优选地，该反应混合物包含至少20mM,更优选超过60mM,如100mM、150mM、200mM、250mM、350mM、400mM、500mM或甚至1M或1.5M的石寿酸盐离子，可选地联合至少60mM或《尤选i也至少大于100mM的铵离子。虽然本发明的教导使包含硫醇化合物是不必需的，但是应当注意，本发明并不局限于没有硫醇化合物的4企测条件。DTT、谷胱甘肽和/或CoA、或本领域已知的任何其他常用的4企测组分可存在于反应混合物中。然而，优选使用无味、非石克醇还原剂。例如，水溶性、有机含膦化合物如三(2-羧基乙基)膦盐酸盐(TCEP)可以用于(参见WO03/044223)本发明的方法中。本发明发明人还鉴定了适合用于荧光素-荧光素酶反应混合物中的其他合适还原剂，如硫代疏酸盐、亚石克S臾盐和连二亚碌^酸盐(参见实施例3和图4)。还原剂通常以0.1—10mM的量存在。除了上述物质，反应混合物可以包含所有有用的物质(用于荧光素-荧光素酶反应混合物中)。本发明的一种方法允许灵敏且便利地检测样品中的荧光素酶活性。样品可以包括(假定)包含荧光素酶活性的细胞。样品可以是细胞的悬浮液、提取物或溶解产物，例如已被提供有编码荧光素酶的核酸的细胞。除了可利用直接从曱虫的发光器官分离的结晶荧光素酶，若干甲虫类的cDNA编码的荧光素酶(包括，在其他之中，p少r"/,S(萤火虫)的荧光素酶，P;/ag7'o/7/^/^/aw^(叩头虫)的四种荧光素酶异构酶，丄.cwc/ato(萤火虫)的荧光素酶以及L.latcralio的焚光素酵)者P是可以利用的(doWototol.,Moloo.Coll.Biol.7，725-737(1987);Masudaetal"Gene77,265-270(1989);Woodetal"Science244,700-702(1989);EP0353464)。而且，任何其他曱虫类(产生荧光素酶)的cDNA编码的荧光素酶可由本领域技术人员利用已知的4支术而4艮容易的获得(deWetetal.Meth.Enzymol.133，3—14(1986);Woodetal"Science244,700-702(1989)。还〉'函盖的是突变体荧光素酶活性的4全测，例如一皮遗传改造以改进其性质的荧光素酶，如具有增加的pH稳、定性或增加的热稳、定性的非天然存在的荧光素酶。其他有用的突变体是包括引起产生的荧光颜色改变的修饰的荧光素酶。这些是例如在美国专利6,387,675中描述的。萤火虫荧光素酶可从各种表达载体以及在作为基因调控研究中的报告子的多种生物体中可靠地表达。荧光素酶才艮告子4全测系统目前是最佳的非毒性、快速和灵敏的用于检测基因表达的方法之一。该检测基于荧光素酶活性的检测(由于基因中DNA调控元件、这些元件中的突变、以及对胞外和胞内信号的响应与转录相关联)。在优选实施方式中，本发明一种方法用来定量用作冲艮告酶的萸光素酶的活性。使用荧光素酶报告基因系统的基本步骤如下1)构建合适的荧光素酶冲艮告子载体；2)将质粒DNA转染到细胞中以允许荧光素酶的表达；3)可选地制备细胞提取物；以及4)测量通过光信号表明的荧光素酶活性。才艮据本发明，后一测量是在磷酸盐和4妄存在下实施的以增加总光l命出。如对于所有反应一样，温度影响荧光素酶活性的速率。对于最佳的荧光素酶4全测的可4妻受范围为20-25。C之间。周围室温落入该范围内而便于实施该冲全测。因此，优选允许样品和所有緩冲液的温度等于室温以获得一致和可重复的结果。在高于30。C的温度下，光发射红移并且该酶迅速降解。在过量的ATP、荧光素和Mg2—(相对于待检测荧光素酶的量)的条件下，反应的初始峰高度和积分总光输出正比于功能性荧光素酶的量。然而，光产生的最大值仅在极窄的底物浓度范围内(超过Km值)出现。在较低ATP浓度下，达到光发射峰高度并在该水平保持延长的时间期，而在4交高ATP浓度下，初始闪光增加^旦衰减速率也增大。在荧光素酶溶解产物中存在两种ATP源纟皮加入到样品中的已知量的以及未知和变4匕量的内源性细月包ATP(其是在荧光素酶样品中共提取的)。绝对最终浓度在某种程度上是不确定的。对于多数检测条件，检测反应混合物中的0.5-2.5mMATP将是最佳的。系统残余的反应辅因子和底物组分(主要是Mg2+(或Mn2+)和荧光素)也具有最佳浓度。它们趋于具有比ATP的这些值更宽的范围。4美离子优选以至少0.5mM的量存在。通常地，反应混合物中Mg2+的浓度不超过50mM。对于多凄丈条件，0.5-1.0mM的荧光素最终浓度和1-5mM的Mg^浓度接近最佳。细胞提取物中相对低的Mg^浓度通常不足以改变反应速率并且萤火虫荧光素不是在其他生物体中发现的天然组分。如果制备细胞溶解产物，则对细胞推荐使用无Mg"和Ca"的洗涤緩冲液。焚光素优选以在0.01和3mM之间的量，更优选以在0.05和1.0mM之间的量存在。当相关实验焚光素酶活性将与一个绝对值相关联时，可以利用纯4匕的焚光素S争标准曲线。由于测量的活性水平通常以RLU或相关光单位表示，所以没有测定绝对值。当使用不同设备进行测量时由于设备设计和校准的变差，对于相同样品RLU值可发生显著变化。当根据生产商说明书进行重建时，被炎光素酶标准证明的特定活性将产生来源于已知焚光素酶数量的信号。这些已知的特定活性参考值可用于纟会定的^f义器的标准化任意RLU才羊品的测量。另外，纯化的荧光素酶标准不必需表示由转染细胞产生的荧光素酶的量，因为表达的荧光素酶的特定活性可以不同于纯化的荧光素酶。对于在本发明的方法中的(异源性)表达的荧光素酶活性的测量，被认为含有荧光素酶的细胞悬浮液可被简单地加入包含细胞溶解剂的反应緩沖液中。因此不需要单独的溶解步骤。在细胞溶解之后，反应緩冲液的其他组分(底物、辅因子、4妄和磷酸盐离子等)易于接近荧光素酶，这样可发生荧光素-荧光素酶反应。常用的溶解剂是非离子去污剂如TergitolTMNP-9、TritonX-100、ThesitTM和TweenTM20。在另一实施方式中，所述样品包括细胞溶解产物或细胞提取物，即，荧光素酶首先从表达荧光素酶的细胞中提取出来。对于提耳又荧光素酶有两种主要的途径，枳4成方法或者〗t学方法。两种方法都具有优点和缺点，而所使用方法的评价对于有效荧光素酶提取和优化测定灵敏度卩艮重要。细胞溶解产物包括不再被组装到可识别的完整细胞组织中的细月包组分。细胞溶解产物可以具有可溶和不溶组分，它们可以在利用该溶解产物之前被去除。溶解产物可以通过任何方式进行制备，包括利用超声波、杜恩斯匀浆器、研钵和捣锤的机械破坏、冻熔循环、或-皮坏细胞的物理结构整体性的^H可其他装置或工艺；或者通过去污剂如两性离子和非离子去污剂、或阳离子去污剂的化学溶解。对于细胞破坏最常用的机械溶解方法是超声波。由于大量能量施加到才羊品中，所以可形成加热。荧光素酶是热不稳、定的；因it-匕，超声波方法应该考虑到这一点，通过利用短超声波循环。伴随5个5-10秒的超声波石皮裂的样品冷却通常足以在最4氐荧光素酶失活的情况下进4亍;:容解。用多个循环的冻熔:容解也广泛用于菱光素酶氺企测。机械溶解方法的缺点在于，荧光素酶在离心之后易于持续结合于细胞碎片沉淀物上。优点是细胞破裂化学物质之间没有相互干扰。通过化学溶解可实现真核细胞溶解的显著改进和Y更利。利用非离子去污剂如1%TritonTMX-IOO，极大地增强来自细胞组分的荧光素酶的溶解性。由于通过去污剂更好的恢复和刺激荧光素酶活性，可能比简单冻熔溶解更大多达25倍的光输出。其他阳离子和两性性。然而，阴离子去污剂通常抑制荧光素酶活性。适当的緩冲体系在优化酶活性中也是需要的。对于最大荧光素酶稳定性来说，优选具有Tris-磷酸盐、Tricine或磷酸盐緩沖液(pH7.5~8.0)的溶解试剂。DTT的加入可有助于保持酶功能；优选包括螯合剂如EDTA或EGTA用于例如Mg^和Ca^离子的螯合以抑制例如蛋白酶的活性(可能不利影响荧光素酶)，以及重金属离子(可能抑制荧光素酶活性)的螯合。由于细菌生理的特性，所以对于细菌溶解来i兌单独包括去污剂证明是不够的。另外的细菌细胞壁的破坏通常需要酶促和/或积^成溶解步骤，以便获得成功。1%TritonX-100和1mg/ml溶菌酶的组合可用于细胞溶解而不影响萸光素酶活性或稳定性。结合于细胞石争片的适量荧光素酶仍然为不可纟是耳又的。可能的替换方法是利用在没有离心的情况下的不清激细菌溶解产物，这可能增加灵壽文度<旦由于^是耳又物中酶的非均相分布而降可重复性。本发明的另一方面涉及一种用于^f全测荧光素酶活性的包含磷酸盐和《妄离子的4全测试剂。所述4全测试剂可以是浓缩的形式，经过稀释加入反应混合物中后提供所需终浓度的磷酸盐和铵离子。优选的(浓)才企测试剂包括至少40mM磷酸盐离子，更^尤选至少100mM磷酸盐离子，最优选至少250mM磷Sl盐离子和/或至少20mM铵离子，优选至少100mM、最优选至少250mM铵离子。在一个特定方面，检测试剂中存在的铵离子超过磷酸盐离子，例如1.1倍过量，或1.5-2.0倍过量或者甚至更大的过量。优选的检测试剂是用磷酸中和至中性pH的含有Tris、乙醇胺和/或磷酸氢二铵(NH4)2H:P04的那些试剂。然而，铵和石粦酸盐来源的其他组合物也可以一使用。示例性的检测试剂是在以下实施例中描述的那些。斗企测试剂可以是液体形式(例如水溶液)或是固体形式，其通过重新构造提供磷酸盐和铵离子。优选的检测试剂包含作为铵离子源的化合物(选自由铵盐、胺、两性离子化合物，及其组合物组成的组)。其他优选的检测试剂包括作为磷酸盐源的磷酸或其盐。检测试剂还可以包4舌其<也有用的物质，如稳、定剂、螯合剂、还原剂和/或细胞溶解剂。在一个具体实施方式中，本发明才是供一种4企测试剂，除了荧光素酶之外，包括所有对于发生荧光素-荧光素酶反应必需的组分。这种"除了一个全都(all-but-one)"类型的测定试剂可筒单地接触荧光素酶源，例如表达荧光素酶的细胞的悬浮液，以获得光信号。"除了一个全都"型的测定试剂的实例包括TrisJ粦酸盐緩冲液pH7、D-荧光素、ATP、Mg2+、EDTA、Ca2+、好u代石危酸盐以及非离子去污剂以溶解细胞。本领域的技术人员可以制备许多所述测定试剂的变形，只要存在4妄和^粦酸盐离子。在一个优选实施方式中，检测试剂不包括DTT，因为发现荧光素在没有DTT的情况下更稳定。在没有DTT的情况下荧光素的稳定性允许制备具有足够长的保存期的除了一个全都型一企测试剂。还提供了一种用于检测荧光素酶活性的试剂盒，例如用于基因报告子检测，其中所述试剂盒包括如本文提供的对于实施荧光素酶活性4企测所需的组分。这样的试剂盒组分包括荧光素酶底物(荧光素)、共底物(ATP)、诸如Mg^或Mn"的辅因子、诸如石克代石危酸钠的还原剂以及磷酸盐源和铵离子源。优选地，该试剂盒包括上面提到的测定试剂。其他有用的试剂盒组分包括溶解緩冲液，优选非离子去污剂。优选地，该试剂盒组分是以最少数量的独立容器合并在一起的。在最少数量的独立容器中试剂盒的组分放置在一起。组分的预混合减少了试剂使用者实施的处理步骤的数量。在一个具体实施方式中，本发明才是供了一种荧光素酶^^全测试剂盒，包括具有包含荧光素、ATP和还原剂的底物混合物的第一容器以及具有包含至少磷酸盐与铵离子和二价阳离子的緩冲溶液的第二容器。緩冲溶液可以进一步地包含其他有用物质，如稳定剂、螯合剂和/或细胞溶解剂。当然，该底物混合物和緩冲溶液之一或二者都可以包含其他有用成分，如另外的(緩冲)盐、螯合剂、细胞溶解剂、二价阳离子(Mg2+、Mn2+)、稳定剂等。在一个优选具体实施方式中，一种试剂盒包含冻干底物混合物，其可用纟爰沖溶液重新构建而生成现用一企测緩沖液。然后可将新鲜制备的检测緩沖液加入到待检测的荧光素酶活性的样品中。以上提到的任何磷酸盐和铵离子源可用于该緩沖溶液。在一个具体方面，本发明提供一种试剂盒，其中在緩沖溶液中的铵离子由Tris或(二)乙醇胺所才是供。所述i爰冲溶液优选用H3P04中和。本发明的一种试剂盒也可以包含细胞溶解溶液。一种试剂盒可以进一步包含(纯化的)荧光素酶，其可用作阳性对照或用于制备突光素酶标准曲线。在一个特定方面，本发明的一种试剂盒包含冻干的底物混合物以及待加入到该冻干底物混合物中的緩冲溶液，以生成现用的荧光素酶一佥测i式剂。冻干底物混合物包括「ATP、荧光素和好L^^克酸盐。底物混合物可以进一步包含本领域已知的其他有用组分，如AMP(其进一步增强光信号的半衰期)。緩冲溶液包含铵、磷酸盐、去污剂(纟田月包;容解剂)、Mg2+、EDTA、Ca2^p(NH4)2S04。本发明将通过以下实施例加以i兌明。图1:在不同铵离子(Tris)和>畴酸盐离子的浓度下的荧光素-荧光素酶反应的光输出时间过程。图2:在不同乙醇胺和石粦S臾盐(图A)或者4妄和石粦S臾盐(图B)的浓度下的荧光素-荧光素酶反应的光输出过程。图3:包4舌Tris(0.5M)、石粦酉吏盐(0.25M)详口各种还原剂的荧光素-荧光素酶反应的光输出过程。图4:反应混合物中的不同Tris浓度对在ATP4企测系统(具有少量ATP(5nM)和较大量的荧光素酶(5mg/l-8.3xl()-8M))(图A)或者荧光素酶检测系统(具有少量荧光素酶(5.0xl0—5mg/l-8.3xl(T13M))和过量(1.5mM)ATP)(图B)中的荧光反应的反应动力学的影响。图5:图4A和4B的ATP和荧光素酶测定系统的每一个荧光反应的总光输出。用不同Tris-磷酸盐离子浓度的每一反应动力学曲线的积分在1~420分4中之间加以确定。获4寻的总荧光以兆4立(兆数，MegaCount)(106位)表示为磷酸盐离子浓度的函数。图6:磷酸盐浓度对图4A和4B的ATP和荧光素酶测定系统的突光反应的半衰期(在孵育10分钟后计算的)的影响。半衰期是焚光衰减至初始值一半需要的时间。实施例实施例l:铵和磷酸盐离子的不同浓度的影响本实施例表明了不同浓度的Tris和磷酸盐对荧光素-荧光素酶反应的性能的影响。将4.0MTris(铵离子源)的原液)用磷酸(H3P04)中和直至达到pH7.0。该原纟爰沖〉容液含有2.0M的;寿酸盐。该原液用来制成一系歹'J分另ll包含2.2、1.1、0.55、0.275、0.138、0.069、0.034禾口0.017MTris的4全测试剂。在这些^H则试剂中^5岸酸盐浓度分别为1.1、0.55、0.275、0.138、0.069、0.034、0.017和0.0085M磷酸盐。检查每一种试剂的pH为7.0,并且如果需要就用少量的H3P04(若干[il的2MH3P04溶液)进行调整。以这种方式加入的磷酸盐阴离子对于上述磷酸盐浓度没有显著影响。每一种检测试剂通过将25(Vl的新鲜制备的原液(30mMATP、3mMD-荧光素、100mM石JU戈石克酉臾盐，用1MNaOH调节至pH=7.0)力口入到2250(il的才企测试剂中而补充D-荧光素、ATP和石危代石克酸钠(Na2S2S03)。荧光素酶在具有Mg和Ca(D，PBS++)的Dulbecco's-PBS(含有0.05g/ml海藻糖和0.016g/mlBSA)中进4亍冻干。荧光素酶样品通过在200)al水中重新构建冻干的荧光素酶进行制备。然后将所得溶液通过将150Jul的重新构建荧光素酶加入到含有5mMMgCl2、5mMCaCl2、5mMEDTA、0.4%Thesit(—种非离子去污齐'J)和0.1%牛血清白蛋白(BSA)的15mlPBS(8.1mMNaH2P04、1.5mMKH2P04、2.7mMKCl、137mMNaCl)中而3希释10(H咅。这形成含有27ng/ml荧光素酶的"焚光素酶样品，，溶液。为了测量每一个Tris-磷酸盐浓度的荧光素-荧光素酶反应的荧光动力学，将100jal的每一种检测试剂(具有D-荧光素、ATP和碌^4戈石克酸盐的TrisJ粦酸盐稀溶液)力口入到白色96孑W敛一反的孔中(在加入100(il样品之后)。将该樣i板在樣M反摇晃器上以1100rpm4展荡10秒，然后立即放入TopCom^-NXT微板闪烁和荧光计数器中。所得荧光光信号在将微板加载到计数器中之后立即进行检测。在5分钟和10分钟后重复该一全测。之后，以15分钟间隔期重复纟企测该信号直至总时间为420分钟。在连续检测之间，微板在计数器中恒定保持在22。C。发出的光量化为位/秒(cps),计数时间3秒/孔。在不同反应混合物中的最终Tris浓度为1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016和0.008M。磷酸盐浓度分另'J为0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008和0.004M磷酸盐离子。反应混合物中的Mg2+、D-荧光素、ATP、；克代-充酸盐和荧光素酶终浓度分别为2.5mM、150fiM、1.5mM、5mM和14pg/pl。图1示出了逐渐增加荧光素-荧光素酶反应混合物中的Tris-石粦酸盐浓度对光信号的初始高度和衰减的影响。为了比较每一个反应混合物的总光输出(表示为109位)，通过在0~420分钟之间积分曲线的方禾呈来计算曲线下的面积。曲线的这些方禾呈是利用MicrosoftExce产專欠件的选项"伴随方牙呈的趋势线(trendlinewithequation)"获得的。这些光输出计算的结果概括在表3中。图1和表3示出了，在荧光素酶4企测反应混合物中逐渐增加的铵离子和磷酸盐离子导致初始光信号以及总光输出的增加，直至0.5MTris/0.25M石寿酸盐的终浓度。高于这些浓度，初始光信号和(4交小程度上)总光输出相对于利用0.5MTris/0.25M磷酸盐获得的值降低，表明这些浓度高于最佳浓度。如从表3清楚的，当相比于较低或极低的铵/磷酸盐浓度，使用超最佳浓度的铵和磷酸盐离子仍然导致改进的光输出。因此，本发明的方法不局限于使用低于最佳或最佳浓度。表3:根据图1的作为Tris和磷酸盐浓度的函数的荧光素-荧光素酶反应的光输出<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>实施例2:不同铵离子源的影响本实施例表明了，如果将乙醇胺或磷酸铵用于为焚光素酶反应提供铵离子而对光输出的有利影响。将4.0M乙醇胺(H2NCH2CH2OH)和3.0M铵-磷酸盐((NH4)2HP04)的原液用磷酸(H3P04)中和直至达到pH7.0。以与实施例1中描述的相同方式制成稀释液。此外，用来形成检测混合物和检测其在荧光素-焚光素酶反应中的光输出的所有方法和其他化学物质标准化，因此与实施例1相同。该检测中的乙醇胺终浓度为1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016和0.008M，并且磷酸盐的浓度分别为0.5、0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008和0.004M。才艮据本发明，终浓度为1M的乙醇胺一皮^人为是提供1M铵离子的含水中性反应混合物。因此，反应混合物中的铵离子浓度被认为与铵离子源的浓度相同。在(NH4)2HP04的情况下，该铵盐同时提供铵离子和磷酸盐离子。在检测的稀释液中，最终混合物中的铵(NH4+)浓度为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031和0.016M，并且在最终反应混合物中，这些稀释液分别含有1.4、0.70、0.35、0.17、0.085、0,043、0.021和0.11M磷酸盐。每一种检测的铵-磷酸盐稀释液还含有少量的28mMMOPS(3-(N-吗啉代)丙磺酸)。图2示出了在包含不同量的乙醇胺-磷酸盐(图A)或铵-磷酸盐(图B)的荧光素-荧光素酶反应混合物中的光信号的测定结果。通过在曲线下方的表面积计算的反应动力学的定量示于表4(乙醇胺-磷酸盐稀释液)和表5(铵-磷酸盐稀释液)中。相比于Tris-磷酸盐，渐增的乙醇胺-磷酸盐浓度产生更好的光输出，4旦直到具有0.5M乙醇胺/0.25M磷酸盐。相比于具有0.5M乙醇胺与0.25M磷酸盐的反应混合物，在l.OM乙醇胺/0.5M磷酸盐处，反应形成了减少的光输出。明显地，这些浓度高于最佳但仍然是有用的。逐渐增大的铵-磷酸盐组合物直至500mM铵和350mM的磷酸盐也引起增加的光输出。在更高浓度处，光输出降低。表4:根据图2A的作为乙醇胺和磷酸盐浓度的函数的荧光素-荧光素酶反应的光输出<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表5:4艮据图2B的作为4妄和磷酸盐浓度的函数的荧光素-荧光素酶反应的光输出<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例3:不同类型的还原剂的影响本实施例表明了，用来保护荧光素酶的反应性巯基不被氧化的不同类型的还原剂的影响。这对于延长酶活性可能4艮重要(DeLucaetal.Biochemistry3:935(1964);andLeeetal"Biochemistry8:130-136(1969))。不同保护剂与不含还原剂的对照样品(在包含4妄和石寿酸盐离子(0.5MTris和0.25M;寿酸盐)的荧光素-荧光素酶反应中)进4亍比4交。制备含100mM以下还原剂的原液二硫代石克酸钠(Na2S204)、二碌L苏糖醇(DTT)、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、錄"<石克酸钠(Na2S203)和亚碌L酸钠(Na2S03)。TCEP原液通过〉容解其盐酸盐(TCEP.HC1)进行制备。将3.5MTris/1.8M磷酸盐原液稀释成1.2MTris/0.62M石粦酸盐(或对于Na2S204,1.11M/0.56M)的浓度。对于每一种还原剂，检测緩冲液通过将100卩il的每一种还原剂原液(对于Na2S204，10pi)稀释在800|ilTris-磷酸盐緩冲溶液(对于Na2S204，890(il)中进行制备。该检测緩沖液通过向100|il新鲜制备的溶液中加入30mMATP、3mMD-荧光素，pH7.0而完成。荧光素酶才羊品和光4言号4企测如上所述实施。反应混合物中的还原剂的终浓度对于DTT、TCEP、Na2S203和Na2S03而言为5mM以及对于Na2S204为0.5mM。每一反应的光信号的时间过程(图3)和所得光输出(表6)表明了，在反应混合物中用于保护荧光素酶不被氧化的还原剂的存在导致了光输出的显著增加。此外，结果表明了作为荧光素-荧光素酶测定中的非石克醇还原剂的连二亚石克酸盐、碌u代石克酸盐、亚硫酸盐和TCEP的合适性。表6:根据图3的作为不同还原剂的函数的荧光素-荧光素酶反应的光输出<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>实施例4:不同铵/磷酸盐离子浓度对在ATP检测与焚光素酶检测检测中荧光素-荧光素酶反应的不同影响本实施例表明，在荧光素-荧光素酶反应混合物中逐渐增加的4妄离子和磷g臾盐离子的量与对焚光素酶检测系统相比，对ATP检测系统具有不同的影响。对于这个实验，制备了16中不同试剂混合物；8个混合物(用于ATP测定)含有大量的焚光素酶、少量的ATP和浓度逐渐增加的Tris-磷酸盐，而8个混合物(用于焚光素酶测定)含有大量的ATP、少量的荧光素酶和逐渐增加量的Tris-磷酸盐。最终反应混合物的每一组分终浓度示于表7中。为了减少可能由试剂之间的小浓度差引起的变化，所有试剂在可能的情况下从相同原液进行制备。"荧光素酶样品"通过将冻干荧光素酶对照样品(PerkinElmerInc.)在水中重新构建并在具有Ca/Mg的Dulbecco，sPBS(D，PBS++)中将其稀释至l.OxlO—7g/1荧光素酶溶液而制备。"ATP样品"通过在0，？88++中稀释重新构建的冻干ATP标准物(PerkinElmerInc.),获得1.Ox10-8mMATP〉容液而制备。在检测ATP时为了检测荧光素-焚光素酶反应的荧光动力学，将100jil具有荧光素酶的每一Tris-磷酸盐浓度的试剂移入96孔CulturePlateTM(PerkinElmerInc.)中并加入100|il的"ATP样品"。同样，在该相同微板中，通过移入100(il具有ATP的每一Tris-磷酸盐浓度的试剂并加入100pi的"荧光素酶样品"测量在测定荧光素酶时的反应动力学。将该微板在微板振荡器上摇晃10秒并用TopSeal-ATM(PerkinElmerInc.)密封。之后，立即将该^反方文入TopCount-NTX中以冲企测发出的光。立即才全测萸光信号，是指在混合试剂和样品之后约1分钟，以及在5分钟和10分钟之后。以后，以15分钟间隔重复才企测该信号，直至总时间为420分钟。在连续测量之间，将樣l板在计数器中恒定保持在22°C。发出的光定量为位/秒(cps),计数时间3秒',/孑L。图4A示出了逐渐增力口的Tris-磷酸盐浓度对在ATP检测设置中的反应动力学的影响，而图4B示出了对荧光素酶4佥测的影响。为了进一步说明ATP和荧光素酶检测系统之间的差异，对每一个曲线的总荧光(即在1~420分钟之间的曲线下方的积分并以106位表示)进行计算并作为磷酸盐浓度的函数图示在图5中。图6示出了对于ATP和焚光素酶检测的磷酸盐浓度和荧光的半衰期(即，对于荧光衰减至其初始值的一半所需时间(分钟))之间的关系。初始荧光在孵育10分钟之后进4亍评估。ATP和荧光素酶检测测定清楚地相对于反应混合物中增加的铵/磷酸盐离子不同地实施。在ATP测定中，其中荧光素酶-ATP比率朝着该酶转移，更高的Tris-磷酸盐离子浓度抑制总荧光。而在焚光素酶测定中，其中荧光素酶-ATP比率朝着ATP转移，高达100mMTris-磷酸盐的存在增强总荧光。表7:对于ATP或荧光素酶4企测;险测，在200pi反应混合物/孔的每一组分的浓度最终反应混合物中的组分的浓度ATP测定(8个不同反应混合物)荧光素酶测定(8个不同反应混合物)化学粉质求^t浓度海藻糖HEPESBSATrisPCM-NaClCaCl2MgCkKC1D-荧光素ATP荧光素酶2.5g/15mM0.5g/11.5mM390195J974919105j0mM205105J5530■15107j4mM*69mM0.45mM0.25mM1.3mM0.5mM5.0xl0-9M5.0mg/1pH7.02.5g/15mM0.5g/11.5mM390195974919105|0205105553015107|4mM'人.69mM0.45mM0.25mM1.3mM0.5mM1.5x10-3m5.0xl0-5nig/1pH7.0对于存在于用于样品制备的PBS++中的磷酸盐离子的校正权利要求1.一种检测样品中的荧光素酶活性的方法，包括在荧光素和ATP以及二价阳离子存在下孵育所述样品以允许产生光信号，其中，所述光信号的总光输出通过在包括铵离子和至少20mM磷酸盐离子的反应混合物中实施所述孵育而被增强，以及检测所述光信号。2.冲艮据权利要求1所述的方法，其中，所述^岸酸盐浓度大于60mM。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述磷酸盐离子是由H3P04、H2PCV或HP042—、P043—或它们的组合4是供的。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述铵离子是由铵盐、胺或两性离子化合物、或它们的组合4是供的。5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述铵离子是由基于胺的緩冲液提供，优选地由Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)或Bis-Tris(二(2-羟乙基)亚氨基-三(羟曱基)曱烷提供的。6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述胺是伯胺或仲胺，优选是选自由单乙醇胺、二乙醇胺、单乙胺和二乙胺组成的组中的胺。7.才艮据前述4又利要求中任一项所述的方法，其中，所述铵离子浓度为至少20mM，优选为至少60mM,更^尤选为大于100mM。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应混合对勿的pH在5~9的范围内。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述孵育是在没有外源性加入或补充的含石危醇化合物如DTT、谷胱甘肽或CoA下实施的，优选地其中所述孵育是在没有DTT下实施的。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述反应混合物进一步包括还原剂。11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述还原剂是非硫醇化合物，优选地是选自由三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)、硫代硫酸盐、亚石克酸盐和连二亚碌酸盐组成的组中的组合物。12.—种包括磷酸盐和铵离子的用于4金测荧光素酶活性的4企测试剂。13.—种用于检测焚光素酶活性的试剂盒，包括根据权利要求12所述的测试剂和底物混合物。14.才艮据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述底物混合物是冻千形式。15.根据权利要求13或14所述的试剂盒，进一步包括纟田胞溶解剂。16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述细胞溶解剂存在于所述斥全测试剂中。17.根据权利要求13~16中任一项所述的试剂盒，进一步包括荧光素酶一示准物。18.磷酸盐和4安离子的组合物在增强荧光素酶冲企测系统中的荧光素-荧光素酶反应的总光输出中的应用。全文摘要本发明涉及利用生物荧光来检测酶活性的方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及一种新的具有增加的光输出的检测系统，用于荧光素酶活性如荧光素酶报告酶活性的灵敏且便利检测。提供了一种检测样品中的荧光素酶活性的方法，包括在荧光素和ATP存在下孵育样品以使产生光信号，其中所述光信号通过在包括磷酸盐和铵离子的反应混合物中实施该孵育而被增强，以及检测该光信号。本发明还涉及在这样的方法中使用的试剂盒。文档编号C12Q1/66GK101218354SQ200680025178公开日2008年7月9日申请日期2006年5月12日优先权日2005年5月13日发明者哈里·范卢内,约翰·若尚·布吕热曼申请人:珀金埃尔默生命与分析科学有限公司