专利名称：具有非功能性l-或d-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的产乳酸酵母细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及确定的基因修饰酵母、制备这些酵母的方法和用这些基 因修饰酵母生产乳酸的发酵方法。
背景技术：
乳酸通过工业发酵方法生产。发酵利用各种类型的细菌物种实施， 这些细菌物种消耗糖类(主要是葡萄糖)并将这些糖类转变为所需酸。 随着乳酸的产生，发酵培养基的酸性逐渐增强。大多数产生这些有机酸 的细菌在强酸性环境下表现并不好——它们在那些条件下不能存活或 者产生产物极慢以至于没有经济意义。
基于这个原因，商业酸发酵方法通过随着酸形成添加中和它们的试 剂来进行緩冲。这使得液体培养基维持在或接近中性pH,并允许细菌 有效生长和生产。然而，这使酸转变成盐，其随后必须被分解以获得其 所需酸形式的产物。
最常见的緩冲剂是钙化合物，其中和有机酸以形成相应的钓盐。在 从发酵液中回收4丐盐后，通过加入无机酸——通常是疏酸来进行分解， 以再生有机酸和形成该无机酸的不溶钙盐。因此该过程涉及緩沖剂和无 机酸的直接花费以及处理和处置不需要的钓盐副产物的成本。如果生物 催化剂能够在较低的pH条件下有效生长和生产的话，则这些成本可以 得到降低或者被免去。
酵母物种已被视为是用于如此低pH发酵的候选物。许多酵母物种 天然发酵己糖糖类为乙醇，但少数(如果有的话)天然产生比如乳酸这
样的有机酸。因此，已经作出了对各种不同酵母物种作出基因修饰以插 入一个或多个将使得细胞能产生乳酸的基因的努力。为将糖类代谢从乙 醇生产转向为乳酸生产，还已对这些细胞做基因修饰以破坏或缺失天然丙酮酸脱羧酶(pDC)基因。该工作描述于，例如，W099/14335、 WO 00/71738 Al、 WO 02/42471 A2、 WO 03/049525 A2、 WO 03/102152 A2 和WO 03/102201A2。
还有一个需要是，提供甚至更好的用于有机酸发酵方法的生物催化 剂。尤其是，需要提高这些发酵方法的生产力和产量，尤其是在非緩沖 的低pH发酵方法中。
发明内容
一方面，本发明是带有至少一个功能性外源乳酸脱氢酶(LDH)基 因的基因修饰酵母细胞，该酵母细胞不能在作为唯一碳源的D-乳酸、L-乳酸或D-和L-乳酸二者上生长。
本发明还是带有(a)至少一个整合进其基因组的功能性外源乳酸脱氢酶(ZX>//)基因和(b)至少一个天然L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的缺失或破坏的基因修饰酵母细胞。
在优选实施方案中，当所述LD//基因是丄-LD/Z基因时至少一个L-乳酸:高铁细胞色c氧化还原酶基因被缺失和破坏，以及当假如ZZ>//基因是D-ZZ>//基因时，至少一个天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因被缺失或破坏。
本发明还是一种发酵方法，其中本发明的基因修饰酵母细胞于发酵 条件下培养于包括可发酵糖类的发酵液中以产生乳酸或其盐。
本发明还是一种产生上述基因修饰酵母细胞的方法，包括(a)破 坏或缺失酵母细胞中天然L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因， 和(b)用含功能性外源ZD//基因盒的载体转化具有缺失或破坏的L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的酵母细胞以将ZX)/f基因盒 整合进酵母基因组中。在破坏或缺失L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 基因的情况下，优选丄/)//基因盒包括功能性丄-/^//基因，和在破坏或 缺失D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的情况下，优选其包括功 能性D-丄D/Z基因。
本发明是产生上述基因修饰酵母细胞的方法，包括a)用含有外源 L-ZX)/Z基因盒的构建体转化带有天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原
酶基因的酵母细胞以产生带有整合进其基因组中的功能性外源L-LD// 基因的突变体，和随后(b)破坏或缺失天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧 化还原酶基因。
本发明是生产上述基因修饰酵母细胞的方法，包括用含有(a)天 然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5'侧翼区；(b)天然L-乳酸: 高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区，和(c)位于构建体天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5，侧翼区下游和天然L-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶基因3，侧翼区上游的外源L-丄Z)/Z基因盒的构建体 转化带有天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的酵母细胞，该构 建体缺乏功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因盒。
本发明进一步为生产第一方面的基因修饰酵母细胞的方法，包括a) 用含有外源D-ZZ)//基因盒的构建体转化带有天然D-乳酸:高铁细胞色素 c氧化还原酶基因的酵母细胞以产生带有整合进其基因组中的功能性外 源D-丄Z)/Z基因的突变体，和然后(b)破坏或缺失天然D-乳酸:高铁细 胞色素c氧化还原酶基因。
此外，本发明是一种生产第一方面的基因修饰酵母细胞的方法，包 括用包含(a)天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5'側翼区； (b)天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区和(c)位 于构建体天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5'側翼区下游和 天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区上游的外源 D-丄DZ/基因盒的载体转化带有天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 基因的酵母细胞，所述载体缺失功能性D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还 原酶基因盒。
已发现本发明的基因修饰细胞比含有相同外源LD//基因盒但带有 功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因(在L-LD7/基因盒的情 况)或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因(在D-LDH基因盒的情 况)的类似细胞以更高的生产力和更高的乳酸滴度生产乳酸，尤其是在 低pH条件下。转化的细胞缺乏在含有乳酸作为唯一碳源的培养基上生 长的能力，而且如果需要的话，基于转化体无法在作为唯一碳源的乳酸 上生长，L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的缺失能够使得转 化的细胞被鉴定。此外，已发现根据本发明L-乳酸:高铁细胞色素c氧化 还原酶基因的缺失提高转化的细胞的酸抗性，尤其是提高其对乙醇酸的抗性。这允许利用比如含乙醇酸培养基这样的酸性培养基选择出成功的 转化体。利用比如乙醇酸这样的酸作为选择剂的能力使得在转化品系以
缺失或破坏L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因时避免使用抗生素 或者其它抗性基因标记成为可能。
图1是描绘pMM22质粒的图。 图2是描绘pMM28质粒的图。 图3是描绘pMM35质粒的图。 图4是描绘pBH76质粒的图。 图5是描绘pMM38质粒的图。 图6是描绘pMI318质粒的图。 图7是描绘pMI321质粒的图。 图8是描绘pMI355质粒的图。 图9是描绘pMI356质粒的图。 图10是描绘pMI433质粒的图。 图11是描绘pMI449质粒的图。 图12是描绘pMI454质粒的图。 图13是描绘pMM44质粒的图。 图14是描绘pMM45质粒的图。 图15是描绘pCM149质粒的图。
具体实施例方式
本发明的基因修饰酵母是通过进行对宿主酵母细胞的特定基因修 饰制备的。宿主酵母细胞是一种作为野生型品系天然能够将至少一种糖 类代谢为丙酮酸的细胞。它可能天然不能在作为唯一碳源的乳酸上生 长。S. bulderi是这样的酵母细胞的例子。在本发明的其它实施方案中， 该细胞经过基因修饰以使其不能在作为唯一碳源的乳酸上生长。当如本 文所述被转化以导入外源丄-/^>//基因时，该宿主酵母细胞优选为作为野 生型品系具有天然功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的细 胞。宿主酵母细胞优选为作为野生型品系包含至少一个天然功能性D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的细胞，如果如下文所述它用外源
D-丄DZ/基因转化的话。
L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶是编码功能性L-乳酸:高铁细胞 色素c氧化还原酶的基因，其催化L-乳酸至丙酮酸的代谢。尽管这样的 一种酶可以帮助细胞代谢丙酮酸至L-乳酸的逆反应，但它在催化乳酸返 回至丙酮酸的逆反应中有效得多，因此尽管存在该功能性基因野生型细 胞也基本上不产生L-乳酸。L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶还已知为 分类名称(S)-乳酸:高铁细胞色素-c 2-氧化还原酶或L-乳酸脱氢酶(细胞 色素)。适宜地，L-乳酸高铁细胞色素c氧化还原酶基因是具有鉴定为 SEQ. ID. NO. 1 (野生型马克斯克鲁维氏酵母(AT. m"n;/am^)品系的L-乳酸高铁细胞色素c氧化还原酶基因Cra2) 、 SEQ. ID. NO. 79 (野 生型东方伊氏酵母(/. on'e"tofe)品系的CraZ4基因)或SEQ. ID. NO. 81 (野生型东方伊氏酵母品系的基因)的编码区的基因，或与 SEQ. ID. NOs. 1 、 79或81的至少一个至少40%，优选至少75%,更优 选至少90%和甚至更优选至少95%同源的基因。适宜地，L-乳酸高铁 细胞色素c氧化还原酶基因是这样的基因，其编码具有鉴定为SEQ. ID. NO. 2、 SEQ. ID. NO. 80或SEQ. ID. NO. 82的氨基酸序列的蛋白质，或 编码与SEQ. ID. NO 2、 80或82的至少一个至少40%,优选至少75%, 更优选至少90%和甚至更优选至少95%同源的蛋白质。
D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶是编码功能性D-乳酸:高铁细胞 色素c氧化还原酶的基因，其催化D-乳酸至丙酮酸的代谢大大强于其催 化该逆反应。D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶还已知为分类名称(R)-乳酸:高铁细胞色素-c 2-氧化还原酶或D-乳酸脱氢酶(细胞色素)。适 宜地，D-乳酸高铁细胞色素c氧化还原酶基因是具有鉴定为SEQ. ID. NO. 83(野生型马克斯克鲁维氏酵母品系的D-乳酸高4失细胞色素c氧 化还原酶(DAZ)/ )基因)、啤酒糖酵母(S. ceMT^/ae)的Z)ZZ>/基因 或东方伊氏酵母的DLD /基因的编码区的基因，或与至少 一 个这样的基 因至少40%,优选至少75%,更优选至少90%和甚至更优选至少95% 同源的基因。适宜地，D-乳酸高铁细胞色素c氧化还原酶基因是这样 的基因，其编码具有鉴定为SEQ. ID. NO. 84的氨基酸序列的蛋白质、具 有由啤酒糖酵母D丄D/基因编码的蛋白质的氨基酸序列的蛋白质、具有 由东方伊氏酵母D丄Z)/基因编码的蛋白质的氨基酸序列的蛋白质或与 这些蛋白质之一至少40% ,优选至少75%,更优选至少90%和甚至更
优选至少95%同源的蛋白质。
"构建体，，是用于转化细胞的DNA序列。构建体可以是例如环状质 粒或载体形式，线性化质粒或载体形式，可以是环状质粒或载体的部分 (比如通过用一种或多种限制酶消化质粒或载体获得的)，或者可以是 利用质粒、载体或基因组DNA作为模板制备的PCR产物。
术语"天然的，，当在本文中关于遗传材料(例如基因、启动子、终止 子或其它DNA序列)使用时，指在该酵母物种的野生型细胞基因组中 发现的遗传材料(除不影响功能的个体对个体突变之外)。"天然能力" (及其变形，比如"天然能够")指野生型细胞执行指定功能的能力。例 如，细胞天然能够将糖类代谢为丙酮酸，如果该物种的野生型细胞在任 何基因修饰之前具备该能力的话。基因被视为在细胞内是"功能性"的， 如果它在该细胞内发挥生产活性蛋白质的功能的话。
本发明中，"外源，，意指任何遗传材料，该遗传材料对于宿主细胞不 是天然的。
适宜的酵母细胞包括那些来自假丝酵母属(OmA^)、糖酵母属 (Sacc/w讓ycw )、裂殖糖酵母属(57n'msacc/zorcw 戸)、克鲁维氏酵 母属(A7w"eromyces )、毕赤氏酵母属(尸zc/n'(3 )、伊氏酵母属(/xrac/zewha ) 和汉逊氏酵母属(//朋""w/a)的细胞。来自假丝酵母属、克鲁维氏酵母 属、糖酵母属和伊氏酵母属的细胞是尤其优选的。特别优选的细胞是 C. sowore腦's 、 马克斯克鲁维氏酵母、AT. f/ erm自/enmy 、 C. mW/z^ eso^c^a、 S. 和东方伊氏酵母。最优选的细胞是马克斯克
鲁维氏酵母、啤酒糖酵母、C. so"o^朋^和东方伊氏酵母。东方伊氏酵 母有时称作克鲁斯氏假丝酵母(Cam^to^w"0或库德齐维氏毕赤氏酵 母(尸/c/ /"h(^/(T^eWO 。马克斯克鲁维氏酵母和C. sowore"w^的适宜 品系包括描述于WO 00/71738 Al 、 WO 02/42471 A2、 WO 03/049525 A2、 WO 03/102152 A2和WO 03/102201A2中的那些。东方^f尹氏酵母的适宜 品系是ATCC品系32196。
本发明的细胞还包含至少 一 个整合进其基因组的功能性外源乳酸 脱氢酶(丄Z)//)基因。ZD/Z基因是编码功能性乳酸脱氢酶的基因。LZ)// 基因特异于L-ZX>//或Z)-丄Z)//的生产，它们分别使细胞能够生产L-或 D-乳酸对映异构体(或其盐)。有可能本发明的经修饰的细胞包含L-和D-ZZ)//基因二者，且因此能够生产乳酸对映异构体二者。然而，优选仅L-或仅D-ZX)//基因存在，由此该细胞生产更多的光学纯乳酸产物。 适宜的ZX>//基因包括获自细菌、真菌、酵母或哺乳动物来源的那 些。特定的L-丄DZ/基因的例子是获自瑞士乳杆菌(丄./^/ve"c^)、干 酪乳杆菌(丄.c""O 、巨大芽孢杆菌(及meg^ehwm)、乳酸片球菌(尸. ac^/"c"cO和牛来源的那些。特定的D-Z^/7基因的例子是获自瑞士乳 杆菌、约氏乳杆菌(丄.yo/z朋omO 、德氏乳杆菌保加利亚亚种(丄. Zm/ganct^)、《急氏享L斥干菌(厶t/e/6n/ech'z')、才直4勿專'L斥干菌(L. p/awton/m ) 和戊糖乳杆菌(L / e"tomO的那些。与这些L-丄DZ/或D-Z^/Z基因中 任一相同或至少80%同源的功能性基因是适宜的。如果需要，则获自这 些来源任一的天然基因可接受诱变，以提供以通用真核起始密码子 (ATG)起始的编码序列或为其它目的。优选的L-AD/Z基因是获自瑞士 乳杆菌的基因、或与这样的基因至少80%、 85%、 90%或95%同源的 基因。另一优选的L-ZjD/Z基因是获自巨大芽孢杆菌的基因，或与这样的 基因至少80%、 85%、 90%或95%同源的基因。优选的D-丄DZ/基因是 获自瑞士乳杆菌的基因，或与这样的基因至少80%、 85%、 90%或95 %同源的基因。
DNA、 RNA或其它遗传材料以及蛋白质氨基酸序列的百分比同源 性可以利用BLAST版本2.2.1软件以默认参数容易地算出。具有至少 XX。/。同一性分数(用BLAST版本2.2.1算法以默认参数)的序列，被 S见为至少XX%同源。
尤其适宜的ZX)/f基因包括编码具有与WO 03/049525的SEQ. ID. NO, 45相比或WO 03/049525的SEQ. ID. NO. 49相比具有至少60% , 特别是至少80%、 85%或95%的同一性分数的氨基酸序列的酶的那些。 尤其适宜的Z^/7基因也包括编码具有与WO 03/049525的SEQ. ID. NO. 46或50至少60%、 80%、 85%或95%同源的蛋白质序列的酶的那些。
转化的细胞还包含单个丄D/f基因或多个ZZ)/Z基因，比如1-10个 LZ)/Z基因，尤其是1-5个LDZ/基因。当转化的细胞包含多个丄Z)Z/基因 时，个别基因可以是相同基因的拷贝，或包括两个或更多个不同ZZ)// 基因的拷贝。外源ZZ)//基因的多个拷贝可以整合进宿主细胞基因组中 的单个基因座(这样它们彼此相邻)，或几个基因座。
外源ZZ>//基因处于一或多个启动子和一或多个终止子的转录控制 下，二者在经修饰的酵母细胞中都是功能性的。如本文所使用的，术语 "启动子"指位于结构基因翻译起始密码子上游(伊，5，)的非转录序列 (通常在约1至1000 bp，优选1-500 bp,尤其1-100 bp内)，且其控制 结构基因的转录起始。类似的，术语"终止子"指位于结构基因翻译结束 密码子下游(伊，3，)的非转录序列(通常在约1至1000 bp,更一般 1-500碱基对和尤其是1-100碱基对内),且其控制结构基因转录的结束。 启动子或者终止子与结构基因可操作地连接，如果它在基因组中的位置 相对于结构基因的位置是如此的以使启动子或终止子根据具体情况而 定完成其转录控制功能的话。
一种适宜的启动子类型与酵母基因天然启动子至少50%、 70%、 90 %、 95%或99%同源。更适宜的启动子类型与宿主细胞天然的基因的启 动子至少50%、 70%、 90%、 95%或99%同源。尤其有用的启动子包 括酵母丙酮酸脱羧酶(尸DC/J 、磷酸甘油酸激酶(尸G《)、木糖还原 酶(；W )、木糖醇脱氢酶(AD//) 、 L- ( + )-乳酸-细胞色素c氧化还原 酶和转录延伸因子-1 (7^/^7)和转录延伸因子-2 (7^/。)基 因的启动子，尤其是来自宿主细胞的各基因。尤其有用的启动子包括宿
主细胞的尸zx:/、尸ga:、 r五F/或7EF2基因启动子的功能性部分，或与
这样的启动子至少80%、 85%、 90%或95%同源。
一种适宜的终止子类型与酵母细胞天然基因终止子至少50%、 70 %、 90%、 95%或99%同源。该终止子可以与宿主细胞天然的基因的终 止子至少90%、 95%或99%同源。尤其有用的终止子包括酵母丙酮酸 脱羧酶(尸DC/,、木糖还原酶(ZA)、木糖醇脱氢酶(XD//) 、 L-乳 酸-高铁细胞色素c氧化还原酶基因或异-2-细胞色素C ( CYC )基因的终 止子，或来自酵母中半乳糖基因家族的终止子，尤其是所谓的 终止子。特别优选的终止子包括宿主细胞尸DC/基因终止子的功能性部 分，或与其至少80%、 85%、 90%或95%同源。
天然(相对于宿主细胞)启动子和终止子，与各自上游和下游侧翼 区的使用，可允许zz>//基因向宿主细胞基因组中特定基因座的靶向整 合，且允许同时的丄dz/基因整合和比如尸dc/基因这样的另一天然基 因的缺失或破坏。
当向宿主细胞中导入多个外源丄1)//基因时，对于不同的z^/z基因 位于不同类型的启动子和/或终止子的控制下是可能的。
外源LD//基因可随机整合进宿主细胞基因组或插入至一个或多个 耙向的位置。靶向的位置的例子包括一个或多个需要缺失或破坏的基因 的基因座，比如尸DC/基因的基因座或L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧 化还原酶基因的基因座。
在细胞包含功能性L-ZX)//基因盒的实施方案中，本发明的经修饰的 细胞最优选包括至少一个天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 的缺失或破坏。"缺失或破坏"意指，基因的完整编码区被消除(缺失)， 或该基因、其启动子和/或其终止子区被修饰(比如通过缺失、插入或突 变)从而使得该基因不再产生蛋白质或蛋白质活性形式，或者产生具有 显著降低(至少75%降低，优选至少90%降低)的活性的酶。缺失或 破坏可通过基因工程方法、强制进化或诱变完成，之后经过适当的选择 或筛选以鉴定所需突变。如果该细胞包含多个L-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶基因(相同基因的多个拷贝或者两个或更多个不同L-乳酸: 高铁细胞色素c氧化还原酶旁系同源物(pamlog)),这些基因的至少一 个被缺失或者破坏，且优选缺失或破坏所有这些L-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶基因。
在细胞包含功能性D-ZX>//基因盒的实施方案中，本发明的经修饰 的细胞优选包括至少一个天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 的缺失或破坏。如前，当野生型品系中存在该基因的多个拷贝或等位基 因时，优选缺失或破坏所有这些基因。
本发明的基因修饰酵母细胞可以包括对细胞提供一个或多个所需 特性的附加的基因修饰。特别重要的附加修饰包括缺失或破坏丙酮酸脱 羧酶基因，由此降低细胞产生乙醇的能力。
另一个特别重要的附加修饰是一个(或多个)单独或集体赋予细胞 发酵戊糖糖类为所需发酵产物的能力的修饰。在后 一 种类型的修饰中 有，(l)插入功能性木糖异构酶基因，(2)产生催化木糖向木糖醇转变的酶 的天然基因的缺失或破坏，(3)功能性木糖醇脱氢酶基因的缺失或破坏， 和/或(4)导致细胞超表达功能性木酮糖激酶的修饰。向酵母细胞中导入 这些修饰的方法描述于，例如WO 04/099381中，其引入本文作为参考。
特别重要的第三种修饰是， 一个或多个功能性选择标记盒向宿主细 胞基因组中的整合，以允许对成功转化体的选择。
L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的缺失或破坏可以以
多种途径完成，包括通过基因工程的方法、强制进化或诱变，伴随选择 或筛选以鉴定所需突变体。
紫外线和EMS诱变法可用于缺失或破坏L-或D-乳酸:高铁细胞色素 c氧化还原酶基因。这些方法是熟知的。在这些方法中，在足以达到细 胞高杀死率(60-99%,优选90-99% )的条件下，细胞被暴露于紫外线 辐射或诱变物质。未死细胞之后被铺平板且选择或筛选带有缺失的或破 坏的L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的细胞。在缺失或破 坏L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的情况下，这容易通过选择对 乙醇酸有抗性的细胞来完成。
(缺失或破坏L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因或产生 其它修饰)的对宿主细胞的基因工程改造可通过设计和构建适宜的构建 体并用这些构建转化宿主细胞在一个或多个步骤中方便地完成。可使用 电穿孔和/或化学(比如基于氯化4丐-或乙酸锂的)转化法。各情况中的 构建体可用特定的限制酶切割，可用作环状DNA或用作产生PCR产物 的模板。
在适宜的缺失或破坏L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 的基因工程方法中，缺失构建体可通过首先克隆天然L-或D-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶基因的两个非邻接DNA序列和/或其上游或下游 侧翼区方便地组装。在本上下文中"非邻接的"意指DNA序列在野生型 基因组中不直接彼此相邻，而相反通过一些其它的遗传材料(其可以少 至一个碱基对)在野生型基因组中彼此分离。在它们之间，这些非邻接
序列之一包括L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的5，側翼区 (包括全部或部分启动子区和全部或部分L-或D-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶编码序列)，且另一序列包括L-或D-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶基因的3'侧翼区(包括全部或部分终止子区和/或全部或部分 L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶编码序列)。非邻接序列可以分 别克隆。作为选择，整个区域，包括5，和3，侧翼以及L-或D-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶基因可伴有随后该基因的至少部分缺失进行克隆 以使其非功能化。非邻接序列可分别包括全部或部分L-或D-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶启动子和终止子区。之后产生包含朝向相同方向 的两个非邻接序列的缺失构建体，并将该构建体用于转化宿主细胞。该
构建体插入一些转化体中L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 的基因座。同源双交换(cross-over)重组事件在一些转化体中导致功能 性L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因缺失。成功的转化体可 以(1)通过对乙醇酸的抗性(对于L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 基因破坏或缺失的情况)进行选择或(2)由缺乏在作为唯一碳源的乳 酸上生长的能力或基于通过使用下文中更充分描述的选择标记赋予细 胞的特性进行筛选。作为选择，筛选可通过PCR完成。PCR或DNA印 迹分析可用于证实所需缺失已经发生。
L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶缺失构建体还可包括一个 或多个功能性结构基因，尤其是LD/Z基因盒，插入到L-或D-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶基因5，侧翼部分的下游和L-或D-乳酸:高铁细胞 色素c氧化还原酶基因的3'側翼部分的上游。该方法允许结构基因在L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的基因座的插入。在优选情 况中，结构基因是Z^/Z基因盒，该情况中L-或D-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶基因的缺失和ZX)/Z基因盒在L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧 化还原酶基因的基因座插入可在单个转化步骤中完成。成功的转化体可 通过PCR或DNA印迹杂交法筌定，或通过用任何一种方便的测定方法 检测插入的结构基因的活性来鉴定。在结构基因是ZX>//基因的情况中， 成功的转化体可通过它们生产乳酸的能力来鉴定。L-乳酸:高铁细胞色素 c氧化还原酶基因被缺失或破坏的转化体可根据它们对乙醇酸的抗性进 行选择。
L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶缺失构建体还可包括选择 标记基因来替代结构基因，或者除包括结构基因外还包括选择标记基
但不是必需的r "选择标记基因"是」种编码转化的细胞在选择培养基中
存活和/或生长所需的蛋白质的基因。 一般的选择标记基因编码蛋白质， 其(a)赋予对抗生素或其它毒素(比如零霉素(zeodn)(印度斯坦链异 壁菌(S^e; ma〃o^'c/2z^ /n力d^to"i^) ble博来霉素抗性基因)、G418 (Tn903的卡那霉素抗性基因)或潮霉素(来自大肠杆菌(E co/z)的氨基 糖苷抗生素抗性基因))的抗性，(b)补充细胞营养缺陷(比如氨基 酸亮氨酸缺陷(马克斯克鲁维氏酵母丄^72基因)或尿嘧咬缺陷(辨如, 马克斯克鲁维氏酵母或哞酒糖酵母WM3基因))，(c)使细胞能够合成
简单培养基中无法获得的关键营养物或(d)赋予细胞在特定碳源上生
长的能力，(比如来自啤酒糖酵母的Affi/J或M五ZJ基因，其赋予在作 为唯一碳源的蜜二糖上生长的能力。优选的选择标记包括零霉素抗性基 因、G418抗性基因、M五ZJ和Affi"ZJ基因和潮霉素a^A,抗性基因。 选择标记盒还将包括可操作地连接于选择标记基因的启动子和终 止子序列，且其在宿主细胞中是可操作的。适宜的启动子包括前述有关 ZZ^基因描述的那些，以及其它比如WO 99/14335、 WO 00/71738、 WO 02/42471、 WO03/102201、 WO 03/102152和WO 03/049525中描述的。
尤其优选的启动子是酵母物种，尤其是宿主品系的rEF/、尸ga:或尸dc/ 启动子(或其功能性部分)或与比如r五F/、尸g〖或尸dc/这样的启动
子至少80、 85、90或95%同源的序列。适宜的终止子包括前面关于丄D// 基因所描述的。
选择标记基因类似地位于构建体上L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧 化还原酶基因5'侧翼部分的下游和L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还 原酶基因3，侧翼的上游。在用该构建体转化的细胞的部分中，同源重组 事件导致选择标记盒(和结构基因盒，如果存在的话)分别整合于CTS2 或DLZ)/基因座。成功的转化体可根据由选择标记基因赋予其的特征进 行选择。其中L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因被缺失或破坏的转 化体可基于它们对乙醇酸的抗性进行选择和/或针对它们不能在作为唯 一碳源的乳酸上进行生长进行筛选。如前，PCR和DNA印迹分析方法 可用于对转化体进4亍表征。
转化酵母品系以插入外源LD/Z基因的方法描述于WO 99/14335、 WO 00〃1738、 WO 02/42471、 WO 03/102201、 WO 03/102152和WO 03/049525;根本本发明这些方法一般可应用于转化细胞。构建体可用特 定的限制酶切割，用作环状DNA，或者用作;漠板产生PCR产物。
用于靶向的插入丄D7/基因盒于宿主细胞的L-或D-乳酸:高铁细胞色 素c氧化还原酶基因的基因座(同时缺失L-或D-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶基因)的构建体如上所述。当不需要将LD/Z基因盒插入L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的基因座时，可以使用不同 设计的载体。
通常，通过制备包含LD//基因盒(即结构基因和相关启动子和终 止子序列)的构建体来插入外源ZZ)Z/基因。为线性化或片段化，该构
建体可包各种类型的限制位点。构建体还可包含主链部分(比如用于在 大肠杆菌中繁殖的)，其许多可通过商业可获得的酵母或细菌载体容易 地获得。
丄Z)/7插入构建体优选包含一个或多个选择标记基因盒。ZX)//基因 盒的把向整合可通过生成带有与耙基因上游(5，-)和下游(3，-)侧翼同 源的非邻接序列的构建体来完成。这些非邻接区各自合适地为约50至 3000 bp长，优选约200-2000 bp长。这些非邻接序列各自或均可包括靶
i安排i构建体中位于两个非邻^接序列之间:；优选-的革^基因(C L-或 D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因基因外)是丙酮酸脱羧酶(尸DC)
基因，因为本发明的细胞优选带有至少一个天然尸zx:基因的破坏或缺
失。因此，优选的非邻接序列取自天然尸DC基因的基因座。然而，以 类似方式利用LDH插入构建体中来自靶基因的基因座的非邻接序列， 其它天然基因可用作丄D/7基因盒插入的靶。
AD/Z盒(包括相关启动子和终止子，如果不同于靶基因的那些的话) 和选择标记(以及可能需要的相关启动子和终止子)将位于ZX>//插入 构建体中介于与靶基因上游和下游侧翼同源的区域之间、在5 ，同源侧翼 下游且在3'同源侧翼上游。
如果使用选择标记盒，则它类似地位于载体中介于取自靶基因的基 因座的两个非邻接序列之间，如前述。
用该构建体转化的部分细胞将经历同源重组事件，其中靶基因被缺 失或破坏，且ZX>//盒(和选择标记盒，如果存在的话)整合在靶基因 的基因座。在靶基因是尸DC基因的优选情况中，转化体将带有尸DC基 因的缺失或破坏。成功的转化体可利用上述方法通过已知方式选择。
当丄D7/插入和L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因缺失或 破坏依次进行时，这些步骤可以任一顺序进行，即，L-或D-乳酸:高铁 细胞色素c氧化还原酶基因缺失可先进行，之后是丄DZ/插入，或者LD// 插入可以先进行，之后是L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 缺失或破坏。
当L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因被先缺失，在ZZ>/f插入 和/或其它随后的转化中有可能利用L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 基因自身作为选择标记。在这样一种情况中，丄Z)/Z转化载体包括L-乳酸:
高铁细胞色素c氧化还原酶基因盒，其中L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还 原酶基因可操作地连接于启动子和终止子序列。L-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶基因盒位于LD//插入载体中来自靶基因的基因座的非邻接 序列之间。部分转化体将在靶基因的基因座处包含ZX>//盒和L-乳酸:高 铁细胞色素c氧化还原酶盒二者(在这种情况中靶基因优选是PDC基因 或其它需要缺失或破坏的基因)。成功的转化体可根据它们在作为唯一 碳源的乳酸上生长的能力或者通过上述其它方法进行选择。
根据本发明如果人们想要利用L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 基因第二次作为选择标记基因，则第 一次L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还 原酶标记基因随后必需缺失或破坏。完成这个的方便途径是设计构建体 从而使L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因盒侧翼为同向重复序列。 同向重复序列是相同的DNA序列，其可以是对宿主细胞天然的但优选 对宿主细胞是非天然的，且其在构建体上彼此朝向相同的方向。该同向 重复序列有利地是约50-1500 bp长。同向重复序列不必需编码任何东西。 在少数转化体中，该构建体允许同源重组事件发生，从而导致L-乳酸: 高铁细胞色素c氧化还原酶标记基因和一个同向重复序列的缺失。通常 必需在非选择性培养基上生长转化体以允许在同向重复序列间发生自 发的同源重组。亦如前述，其中L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 已缺失的细胞可根据它们对乙醇酸的抗性进行选择或者针对它们不能 在作为唯 一 碳源的乳酸上生长进行筛选。
优选缺失或破坏宿主细胞中的天然尸DC基因，由此转化的细胞具 有降低的产乙醇能力。如果宿主细胞包含多个尸DC基因，则尤其优选 缺失或破坏全部尸DC基因，尽管可能缺失少于全部这样的尸DC基因。 尸Z)C缺失可利用类似于描述于WO 99/14335、 WO 02/42471、 WO 03/049525、 WO 03/102152和WO 03/102201中的那些的方法完成。尸DC 缺失还可用ZD//基因盒或其它结构或选择标记基因盒的同时插入来完 成。在特别重要的方法中，(1 )克隆来自尸DC基因的基因座的非邻接 序列，任选地与部分功能性尸DC基因一起；(2)产生包含非邻接序列 的构建体(任选地包含尸Z)C结构基因的非功能部分)，和(3)用该构 建体转化宿主细胞。同源重组事件导致功能性尸DC基因在部分转化体 中的缺失或破坏。如果需要缺失或破坏多个尸DC基因则这可以重复。 在一些酵母物种中，比如东方伊氏酵母，存在多个紧密同源的尸Z)C基
因或等位基因。已经发现在这样的情况中，来自任一基因的基因座的非
邻接序列可用于构建体中以缺失或破坏尸DC基因二者。用于破坏尸Z)C 基因的构建体可包括一个或多个插入到天然尸DC基因5'側翼部分下游 和天然尸Z)C基因3'侧翼部分上游的功能性结构基因。该结构基因优选 为包括与结构基因可操作地相连的功能性启动子和终止子序列的盒的 部分。该方法允许在单个转化步骤中实现尸DC基因的缺失和功能性基 因盒的插入。该构建体可包括选择标记基因盒来替代结构基因，或者除 包含结构基因外还包含选择标记基因盒。而且，如前述，选择标记基因 盒位于载体上，介于取自被靶向的尸Z)C基因的基因座的非邻接序列之 间，且将在部分转化体中被插入到功能性尸DC基因的基因座中。
插入功能性木糖异构酶基因、缺失或破坏产生催化木糖向木糖醇转 化的酶的天然基因、缺失或破坏功能性木糖醇脱氢酶基因将细胞修饰为 超表达功能性木酮糖激酶的合适方法描述于，例如WO 04/099381,其 引入本文作为参考。
在本发明的发酵方法中，本发明的细胞培养于包含可被转化的细胞 发酵的糖类的发酵培养基中。该糖类可以是己醣糖类，比如葡萄糖，聚 糖或其它葡萄糖聚合物，葡萄糖寡聚体比如麦芽糖，麦芽三糖和异麦芽 三糖，潘糖，果糖和果糖寡聚体。如果细胞天然具有或经过修饰以赋予 了发酵戊糖糖类的能力，则发酵培养基可包括比如木糖、木聚糖或其它 木糖寡聚体这样的戊糖糖类。这样的戊糖糖类是含半纤维素的生物质的 合适水解产物。在寡聚糖的情况中，可能必需向发酵液中添加酶以将它 们消化成被该细胞发酵的相应单糖。
培养基通常将含有特定细胞所需的营养物，包括氮源(比如氨基酸、 蛋白质，比如氨或铵盐这样的无机氮源等)和各种维生素、矿物质等。
其它的发酵条件，比如温度、细胞密度、底物的选择、营养物的选 择等，对于本发明来说不是关键的，且通常进行选择以提供经济的方法。
这在某些程度上依赖于品系耐受升i的丄度^能力。优选温度，尤i是
生产阶段期间，是约30-45。C。
在生产阶段期间，发酵培养基中的细胞浓度通常为约0.1-20,优选 约0.1-5,甚至优选约1-3 g干细胞/升发酵培养基。
发酵可以是需氧、微需氧或厌氧进行的。如果想要的话，如WO
03/102200所述，氧摄取速率可用作过程控制。本发明的细胞，在甚至 厌氧条件下，也以良好的体积和比生产力表现良好的将糖类发酵为乳酸
或乳酸/乙醇混合物的能力。
在发酵生产阶段期间可以对培养基进行緩冲从而使得pH维持在约 3.5~约9.0范围，比如约4.5-约7.0。适宜的緩沖剂是在乳酸形成时中 和乳酸的碱性材料，且包括，例如，氲氧化钩、碳酸4丐、氢氧化钠、氢 氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铵、氨、氪氧化铵等。通常，那些已被 用于常规发酵方法的緩沖剂在此处也是适宜的。
在緩沖发酵中，比如乳酸这样的酸性发酵产物在形成时被中和成相 应的乳酸盐。因此酸的回收涉及游离酸的再生。这通常通过取出细胞和 用比如硫酸这样的强酸酸化发酵液来完成。形成盐副产物(在用钓盐作 为中和剂和硫酸作为酸化剂的情况下是石膏)，其从酸分离。之后通过 比如液液提取、蒸馏、吸收等，比如T.B. Vickroy,第3巻，Comprehensive Biotechnology第38章,(ed. M. Moo國Young)， Pergamon, Oxford, 1985; R. Datta等人,FEMS Microbiol. Rev., 1995, 16:221-231;美国专利号 4,275,234、 4,771,001、 5,132,456、 5，420,304、 5,510,526、 5,641,406和 5,831,122和WO 93/00440中描述的技术回收酸。
然而，优选的是允许发酵培养基的pH从通常为5.5或更高的起始 pH降低至或低于酸性发酵产物的pKa，比如在约1.5 ~约3.5范围，在 约1.5~约3.0范围，或在约1.5~约2.5范围。本发明的细胞具有预料 不到的甚至在终pH降至低于3.5、低于3.0、低于2.5和甚至低于2.0的 非緩沖发酵培养基中良好生长和生产的能力。
还可能通过将整个过程中的pH维持在或低于乳酸的pKa来进行发 酵。在这样的情况中，在发酵过程之前或发酵过程开始时发酵液的pH 被调节至或低于乳酸的pKa,并随着发酵的进展维持在该水平。在该实 施方案中，pH优选维持在约1.5 约3.5范围内，约1.5~约3.0范围内， 或约1.5至约2.5范围内。
乳酸从低pH发酵培养基中的回收可利用比如美国专利号6,229,046 中描述的方法来进行。
本发明的方法可连续、分批或其一些组合进行。L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的缺失或破坏根据具 体情况而定可导致几项益处。乳酸滴度常被提高。当宿主细胞为比如马 克斯克鲁维氏酵母这样的克鲁维氏酵母属品系时尤其可以看到这一点。 与不具有L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶缺失的类似品系相比，乳酸 产量以及乳酸生产速率也被提高。而且，这尤其在经修饰的克鲁维氏酵 母属品系中可以看到。另 一 个好处是看到低丙酮酸产生。
提供以下实施例以用于阐明本发明，但无意于限制其范围。所有部 分和百分比均按重量计，除非另行指明。
实施例1A:马克斯克鲁维氏酵母品系CD607的诱变和带有对乙醇酸抗 性的突变品系(CD635 )的选择。
马克斯克鲁维氏酵母品系CD607描述于WO 03/102152的实施例 3D。该品系带有其丙酮酸脱羧酶基因缺失和在该基因座的外源乳酸脱氢 酶基因插入。根据以下规程，品系CD607的细胞通过暴露于紫外线或甲 磺酸乙酯经受诱变
W殺
将来自新鲜YPD (Difco #0427-17， Sparks, MD,含10 g/L酵母提 取物，20 g/L蛋白胨，20 g/L葡萄糖和15 g/L琼脂)板的细胞重悬于2 mL 酵母蛋白胨+和附加的50 g/L葡萄糖中至约OD,为6。将该细胞悬浮 液的十个125itil等分试样移液入300iLil96-孔微量滴定板的十个孔中。将 微量滴定板暴露于12,500 )LiJoule/cm2紫外线以杀死90-99%的细胞。之 后向微量滴定板中再加入两个125|iil等分试样的细胞悬浮液作为^t拟处 理的对照。将十二个孔的每一个中的细胞悬浮液转移到1.5mL微量离心 管(microfuge tube )中。之后将十二个微量离心管在黑暗中3(TC搅动中
(225rpm )过夜温育以允许细胞在铺平板到选择板上之前进行恢复
(recover)。
然后将来自九个紫外线处理过的细胞悬浮液和来自 一个;f莫拟处理 过的细胞悬浮液的lOOpl等分试样铺平板到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA, Difco Laboratories, Cat. No. 0013-17, Sparks, MD) + 15 g/L乙醇酸板 上以选择乙醇酸抗性品系。30。C下温育这些板几天直至出现集落。从九 个平板的每一个分离单个集落用于进一步分析。
EMS鼓
将来自新鲜YPD板的细胞重悬于2 mL磷酸緩沖盐水中至约OD600 为6。将十二个该细胞悬浮液的200|ul等分试样移液入十二个14mL保 护帽盖(snap-cap)管中，并向十二管中的十个中加入4 甲磺酸乙酯
(EMS, Sigma Chemical Co., St. Louis ， MO， catalog # M0880, 1.17g/mL 溶液)。剩余的两管用作模拟处理的对照。然后将管于3(TC下搅动中
(225rpm)温育30分钟，以再杀死90-99%的细胞。暴露于EMS后， ^使十二管中的细^^形成沉淀，用5.0% Na2S203洗涤两次以中和EMS， 并用水洗涤一次。将细胞重悬于100 juL YPD培养基中，并于30。C搅动 中(225 rpm )温育6小时以允许细胞在铺平板到选择板上之前进行恢复。 恢复后，将来自九个EMS-处理过的细胞悬浮液和来自一个模拟处 理的细胞悬浮液的100)1^铺平板到？0八+ 15 g/L乙醇酸板上以选择对乙 醇酸的抗性。30。C下温育这些板几天直至出现集落。分离单个集落用于 进一步分析。
如下进行对诱变细胞的筛选。将约2X 108个已经在上述方法之一 中诱变的细胞铺平板到包含15 g/L乙醇酸的(PDA)板上，并于30。C温 育。在这些板上生长的集落于30。C和225rpm的搅动在带挡板的摇瓶中 生长于不含緩冲液的YP ( 10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨)+ 100 g/L 葡萄糖中过夜。之后用来自这些摇瓶的2 g/L细胞干重接种生产瓶。生 产瓶在30。C和70 rpm的搅动培养于YP + 50 g/L葡萄糖中。定期抽取样 品以利用比如WO 03/102201实施例1M中描述的方法经HPLC测量葡 萄糖、乳酸、乙醇和丙酮酸。
将一个品系命名为品系CD635。品系CD635得自上迷UV诱变处 理。88小时后，与亲本品系CD607产生小于9 g/L相比，品系CD635 产生约13 g/L乳酸。在该时间段期间，品系CD635比品系CD607消耗 葡萄糖稍多，并达到显著更高的乳酸产量。品系CD635能够在作为唯一 碳源的乳酸上生长。
实施例1B:马克斯克鲁维氏酵母品系CD635的进一步诱变以及具有对 乙醇酸抗性的突变品系(CD832、 CD839、 CD840、 CD841、 CD850、 CD851和CD853 )的选择。
用实施例1A中描述的方法使品系CD635 (实施例1A)的细胞接受 诱变，对所得诱变的细胞选择能够在含有25 g/L乙醇酸的PDA上生长 的集落。从总共23个诱变事件中，铺平板了约5.9 X 109细胞，从中产 生了几个对乙醇酸有抗性的集落。这些集落中的一些来自于用EMS诱 变，其它来自于用紫外线诱变，以及另一些来自于自发突变。
乙醇酸抗性集落分别在摇瓶内的YP + 100 g/L葡萄糖中于3(TC和 250rpm的搅动过夜生长。通过离心收集生物质，并将2 g/L细胞干重接 种入带挡板的摇瓶中的50 mL YP + 50 g/L葡萄糖内。摇瓶培养于30°C 和250 rpm的搅动约92小时。与亲本品系CD607和CD635相比，产生 显著更高的终乳酸滴度的七个突变体，被命名为品系CD832、 CD839、 CD840、 CD841、 CD850、 CD851和CD853。
品系CD832、 CD839、 CD840、 CD841、 CD850、 CD851和CD853 不能在作为唯一碳源的乳酸上生长，从而指示rmCTS2基因在这些突变 体中已经成为非功能性的。因此以高保真FailSafe酶和以基因组DNA 为模板，用PCR分别对这些品系的每一个扩增《wCZ82编码区加 《mCZ82编码区上游和下游 500 bp。所得~2.75 kbp PCR产物经Qiagen 柱纯化进4亍纯化并在整个A:mC7B2编码区测序。
品系CD635能够在作的为唯一碳源的乳酸上生长，这指示，它包含 功能性《mCZS2差^。来自CD635的CTS2基因的测序证实，其具有野 生型C1^2序列。品系CD635的KmCra2基因的DNA序列示作SEQ. ID. NO. 1。由该CFS2基因编码的蛋白质的氨基酸序列示作SEQ. ID. NO. 2。
品系CD832、 CD839、 CD840、 CD841、 CD850、 CD851和CD853 都缺乏在作为唯一碳源的乳酸上生长的能力，且与品系CD607相比具有 提高的对乙醇酸抗性。这些特征各自表明这些品系缺失功能性KwCra2 基因。各种情况中这些品系的《wCTS2编码区内的DNA序列显示，与 具有野生型CTS2序列的品系CD635的fmCT52基因相比，ATmC)^2基 因编码部分中有突变。由这些编码区产生的酶的氨基酸序列也显示差 别。DNA和氨基酸序列差别为
品系CD832:氨基酸位置457的点突变导致无义突变，将精氨酸变 成终止密码子。该突变将该蛋白质截短135个氨基酸。
品系CD839:氨基酸位置272的点突变导致错义突变，将脯氨酸变 成苏氨酸。
品系CD840:氨基酸位置222的点突变导致无义突变，将色氨酸变 成终止密码子。该突变将该蛋白质截短370个氨基酸。
品系CD841:氨基酸位置147的点突变将组氨酸变成酪氨酸。 品系CD850:氨基酸位置309的双点突变将丝氨酸转变成苯丙氨酸。 品系CD851:碱基对219 (氨基酸位置74 )的二碱基对缺失产生移 码突变，导致氨基酸位置76产生终止密码子并将该蛋白质截短。
品系CD853:氨基酸位置62的四碱基插入导致移码突变，在氨基 酸位置76产生终止密码子，并将该蛋白质截短。
实施例2A:在马克斯克鲁维氏酵母CFB2基因5，和3'侧翼区之间含有 G418抗性基因盒的质粒(pMM22，图1 )的构建。
通过与已知啤酒糖酵母L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因基 因同源性的同源性比较，在野生型品系马克斯克鲁维氏酵母(称作 CD21， ATCC 52486 )基因组DNA序列中鉴定了马克斯克鲁维氏酵母L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因(^mCTS2)基因编码区。用鉴定 为SEQ. ID. NO. 3和SEQ. ID. NO. 4的引物且以基因组DNA为模板，利 用PCR扩增了直接位于《wCyB2编码区5'的 2kbp侧翼区，导入了 Mw/ 和尸W/限制位点。类似地，用鉴定为SEQ. ID. NO. 5和SEQ. ID. NO. 6 的引物且以基因组DNA为模板，利用PCR扩增了直接位于Cra2编码 区3，的 2kbp侧翼区，导入了力/7a/和A/goAZ/「限制位点。
用M/w/和尸W/消化称作pVR29 (描述于WO 03/102152的实施例 1C和图4)的质粒，且将5XmCTS2侧翼与所得片段连接以产生称作 pMM21的质粒。质粒pMM21包含位于G418抗性基因盒上游的《wCZS2 5'侧翼。
用和iVgoM/F消4t质粒pMM21,且将所得片4爻与3'ATmCT52 側翼相连以产生称作pMM22的质粒(图1 )。质粒pMM22包含位于 G418抗性基因盒上游的ATmCra2 5'侧翼，和位于G418抗性基因盒下游 的fwCZ82 3'侧翼。
实施例2B:通过用质粒pMM22 (图1,实施例2A )转化马克斯克鲁维 氏酵母品系CD607产生带有整合的ZD// ^ ^、缺失的尸DC基因和缺失 的^wC1^2基因的马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD936)。
培养对应于CD607 (参见实施例1A)的马克斯克鲁维氏酵母集落， 且离心20 ml细胞。质粒pMM22用A7ze/和AAae/ ( 二者均切割质粒上的 尺mCT32側翼)消化，且所得片段用于用标准电穿孔法转化马克斯克鲁 维氏酵母品系CD607。根据对G418的抗性选择转化体。
所选择出的转化体在酵母氮基(YNB )+ 1 %乳酸板和YNB( 6.7g/L 酵母氮基(Yeast Nitrogen Base ) , Difco Laboratories, Sparks MD, Cat No. 0392-15 )+ 1 %葡萄糖上筛选。选择出在乳酸培养基中显示减弱的生 长的转化体。使用称作SEQ. ID. NO. 7和SEQ. ID. NO. 8的引物，用内 翻外(inside-out)集落PCR对这些转化体进行筛选。5'引物位于5'CTS2 侧翼中破坏构建体同源区的外部且3，引物位于G418盒中。所选择的转 化体各显示fwCTS2基因座处的G418盒插入。分离了来自这些转化体 中的四个的基因组DNA,并用称作SEQ. ID. NO. 9和SEQ. ID. NO 10 的引物进行了对《wCyS2基因座的PCR分析。这些引物位于C7B2编码 区的上游和/或下游~500 bp以确保该基因座的完整扩增。相对于天然 CTS2编码区具有提高大小的PCR产物指示对于这四个转化体各自的 G418盒对基因的取代。这些转化体中的 一个被命名为品系CD936。
实施例2C:通过用质粒pMM22 (图1,实施例2A)转化马克斯克鲁维 氏酵母^屑CD635产生带有整合的丄Z)/Z差^、缺失的尸ZX:基因和缺失 的KmCT62基因的马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD998)。
以实施例2B中描述的一般方式用质粒pMM22转化品系CD635(实 施例1A)的细胞。根据对G418的抗性选择转化体。
所选择出的转化体在YNB+ 1%乳酸板和YNB + 1%葡萄糖上筛 选。所有转化体在乳酸培养基中显示减弱的生长。利用如实施例2B所 述的内翻外集落PCR筛选这些转化体，且发现转化体中有11个在 KmCra2基因座有G418盒插入。分离了来自这些转化体的4个的基因 组DNA，且如实施例2B所述进行了对《mCFS2基因座的PCR分析。 如前述的，引物位于^TmC1^2编码区的上游和/或下游 500bp以确保该 基因座的完整扩增。相对于天然fmCTS2编码区具有提高的大小的PCR 产物指示对于这四个转化体中有三个由G418盒对fmCra2基因的取代。 这三个转化体中的一个净皮命名为品系CD998。
实施例3A:在K Aew oto/erara同向重复序列间包含fmCyB2基因盒 的质粒(pMM28,图2)的构建。
使用鉴定为SEQ.ID.NO. ll和SEQ. ID. NO. 12的引物，通过PCR 从称作CD21的野生型马克斯克鲁维氏酵母品系基因组DNA PCR扩增 完整马克斯克鲁维氏酵母CTS2 (fmCra"基因盒，包括启动子和终 止子区，其中导入Saw///和限制位点。将PCR产物与用^w2/// 和Sa//消化的称作pUC18的商业载体(获自Invitrogen Corp., Carlsbad， CAUSA)相连。所得质粒称作pMM25。
从AT. Awmo^/era朋的基因组DNA PCR-扩增了鉴定为SEQ. ID. NO. 13的705 bp序列，其中导入了印/ /和^//限制位点，所用引物鉴定为 SEQ. ID. NO. 14和SEQ. ID. NO. 15。该Ae/7m^0/erara序列不编码任 何活性蛋白质。质粒pMM25用5^/^和^//消化，且将AT. Aewwfo/era朋 序列与之相连至《附CTS2盒上游(5，)以形成被命名为pMM27的质粒。
利用被鉴定为SEQ.ID.NO. 16和SEQ. ID. NO. 17的引物，PCR扩 增了添加了 Sam///和Zma/限制位点的相同的AT. Awmc^o/enmy序列。 质粒pMM27用Sam///和Zma/消化，且将《 Awmo/o/erara序列与之 相连至KwCTi52盒下游(3，)以形成被命名为pMM28的质粒(图2)。 质粒pMM28包含侧翼为朝向相同方向的〖AwmoM/eraw同向重复序 列的fwCTB2盒。
实施例3B:在相同《.A^7m^o/eraw序列之间和5，和3'fwCZ82側翼区 之间包含啤酒糖酵母A/E丄/基因表达盒的质粒(pMM35,图3)的构建。
称作pNC16的载体获自National Research Energy Laboratories in Golden， Colorado。该质粒包含处于啤酒糖酵母尸DC7启动子和啤酒糖 酵母04ZJ0终止子控制下的啤酒糖酵母A/五丄/基因。用称作SEQ. ID. NO. 18和SEQ. ID. NO. 19的引物PCR扩增了添加了 Sg///和限制 位点的AffiX/基因盒。质粒pMM28 (图2,实施僻3A)用^wz///和 消化并与A/￡X/盒相连。这同时缺失了质粒pMM28的ATmCZS2盒并将 其取代为A/EZJ盒。将所得质粒命名为pMM31。它包含侧翼为《. ^ze，由/w證同向重复序歹'J的MEX/盒。
使用PCR用鉴定为SEQ. ID. NO. 20和SEQ. ID. NO. 21的引物，且 以基因组DNA为模板，扩增了导入了 Xw"/和S"c/限制位点的直接位
于fmCTS2编码区3，的 2kbp侧翼区。所得片段与；^"//5^/-消化的质 粒pMM31连接以将3，CTS2侧翼插入本身即位于^ffi丄/盒下游的〖 Aermoto/erara同向重复序列的下游(3，)。将所得质粒命名为pMM32。 使用PCR用鉴定为SEQ. ID. NO. 22和SEQ. ID. NO. 23的引物，且 以基因组DNA为模板，扩增了导入了爿W//和A/^r/限制位点的直接位 于KmCra2编码区5'的 2kbp侧翼区。所得片段与爿^///^^/-消化的质 粒pMM32连接。所得质粒(称作pMM35,图3),包含，按顺序，5XwCTB2 側翼区、第一个AT. AwmWo/era似同向重复序列、M五ZJ盒、第二个〖 Awmofo/era朋同向重复序列和3 ，A「wCyS2侧翼区。
实施例3C:通过用质粒pMM35转化野生型马克斯克鲁维氏酵母品系产 生带有缺失的《mCyS2基因的马克斯克鲁维氏酵母突变体(CD1287)。
质粒pMM35用仏m/和A%e/消化，并用于用标准电穿孔法转化野 生型马克斯克鲁维氏酵母品系细胞。通过铺平板于YNB + 2X蜜二糖， 添加32mg/LXaGa/ ("5-溴-4-氯-3-。引咮-beta-D-半乳糖苷，LabScientific, Inc.， Livingston, NJ, Cat. No. X-566)，选择转化体的生长。所有在该 培养基上生长的转化体均显示蓝色。随后将它们在蜜二糖板上划线以做 进一步分析。用鉴定为SEQ. ID. NO. 7和SEQ. ID. NO. 8的引物，经5， 内翻外集落PCR,筛选在KmCTB2基因座发生同源重组的转化体。产生 阳性PCR产物的集落经过了 YNB + 2 %蜜二糖和32 mg/L ^aGa/上的两 次单集落分离以消除背景污染。从这些品系获得基因组DNA。
用被鉴定为SEQ. ID. NO. 24和SEQ. ID. NO. 25的引物，经PCR扩 增得到完整f mCTiB2基因座。四个集落给出了预期的在《mCra2处发生 同源重组从而导致M￡X/基因盒在ATmCra2基因座的插入的PCR产物。 这些集落中的一个被命名为CD1286。
品系CD1286在非选择性培养基上划线两轮，并针对单个集落分离 物铺平板，以筛选A/E丄/盒的环出序列。约1300个集落中有三个显示 白色，从而指示A^丄/基因的不存在。从这三个集落获得基因组DNA, 且再次使用被鉴定为SEQ. ID. NO. 24和SEQ. ID. NO. 25的引物进行对 整个《mCK82基因座的PCR。全部三个集落均给出预期的环出事件的 PCR产物，从而指示盒已从细胞基因组中缺失。这些品系中的一 个4皮命名为CD1287。
实施例4A:包含5，《m尸Z)C/侧翼区、瑞士乳杆菌Z^/Z基因表达盒、侧 翼为AT. AwmWo/erara ATmC1^2基因表达盒，和
3Xm尸DC/侧翼区的质粒(pMM38,图5)的构建。
用鉴定为SEQ. ID. NO. 26和SEQ. ID. NO. 26的引物，以基因组 DNA为模板扩增^々野生型马克斯克鲁维氏酵母品系的r五f7启动子 区，其中添加了 Ar/ "/zX^/位点。随后将该产物连接进称作pBH76的质 粒(图4)中得到被命名为pMM36的质粒。质粒pMM36按顺序包含 5，ATm尸Z)C/侧翼区、ATmTEF2启动子、Z7^D7/基因和ScO4ZJ0终止子。 然后用鉴定为SEQ. ID. NO. 28和SEQ. ID. NO. 29的引物，并以基因组 DNA为模板经PCR扩增3，fm尸DC7侧翼区，其中添加了 Xma//Pc//位 点。通过用A7w^ZP"7切割将该扩增子连接入质粒pMM28 (图2，实施 例3A)以得到称作pMM37的质粒。用鉴定为SEQ. ID. NO. 30和SEQ. ID. NO. 31的引物，扩增了来自质粒pMM36的《w尸DC7区和Z^ZZ)/Z表 达盒，其中添加了 A^W/M/e/位点，并将该区域连接入A^W/M/e/消化的 pMM37以产生质粒pMM38 (图5 )。质粒pMM38被设计用于Z^ZX>// 和fmCra2基因表达盒在马克斯克鲁维氏酵母尸DC/基因座的靶向插 入。
实施例4B:通过用质粒pMM38 (图5,实施例4A )转化品系CD1287 产生带有外源LD//J:茵、缺失的尸DC基因和环出的CYB2基因的马克 斯克鲁维氏酵母突变体(CD1300)。
质粒pMM38用M/e/消化，并用于用标准电穿孔法转化品系 CD1287。在YNB + 20/。乳酸板上选择转化体的生长。将在乳酸板上生 长的转化体在乳酸板和YPD板上划线。用鉴定为SEQ. ID. NO. 32和SEQ. ID.N0.33的引物，经3，内翻外集落PCR，筛选在尸DC7基因座发生同 源重组的转化体。将产生预期大小(2251bp) PCR产物的转化体针对单 个集落分离划线。从来自各阳性转化体的三个单独的集落分离物获得基 因组DNA,用鉴定为SEQ. ID. NO. 34和35的引物经由PCR扩增尸DC 基因座。之后通过评估它们是否产生乙醇来测试给出预期PCR产物 (8453 bp相对于野生型尸DC基因座的3730 bp,从而指示尸DC基因的 丧失和ZX)/Z基因的整合)的分离物的Pdc—表型。 一个不产生乙醇的品
系被命名为品系CD1298。品系CD1298包含缺失的尸DC基因、外源LD/f 基因盒、和来自质粒pMM38的CZS2基因盒。
品系CD1298在非选择性YPD培养基上划线三轮，且将细胞浆铺平 板于PDA + 7.5g/L乙醇酸板上。于3(TC72小时后，挑取集落，并利用 被鉴定为SEQ. ID. NO. 36和37的引物经集落PCR筛选《mCra2基因的 环出。四个集落给出了 CX82基因环出序列的正确产物大小(1109 bp 相对于包含CyB2盒的产物的5129 bp)。从这四个品系的每一个分离了 单个集落。基因组DNA获自各个这些单个集落，且利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 38和36的引物经PCR扩增出尸DC7基因座。两个品系产生了 具有盒环出序列预期大小的PCR产物(3249 bp相对于包含C1^2 盒的产物的7269 bp以及野生型PCR产物的2546)。这两个品系中的一 个被命名为品系CD1300。
实施例5A:品系CD635 (实施例1A)、 CD853 (实施例1A)和CD998 (实施例2C)的微需氧摇瓶表征
品系CD635、 CD853和CD998分别以低密度(0.05-0.10 OD600 ) 培养，并允许培养物在生长时产生发酵产物。向250 mL带挡板的摇瓶 中移液入50mL培养基(YP + 60g/L葡萄糖)，并用所需量的生物质接 种该培养基。之后瓶在30。C和70rpm定轨搅动中温育 92小时，在实验 过程中取样( 每24小时)以测试葡萄糖消耗、发酵产物累积以及生物 质生长。
培养92小时后，品系CD635(不是本发明的实例)已消耗了 17.6 g/L 葡萄糖并产生了 11.4 g/L乳酸。在相同的时间段中，品系CD853消耗 了 26.9g/L葡萄糖和产生了 23.3 g/L乳酸，略高于由品系CD635产生的 两倍。品系CD998消耗了 21.9g/L葡萄糖和产生了 18.5 g/L乳酸，比品 系CD635高出超过60%。品系CD635的乳酸得率为 65%,而品系 CD835和CD998的得率分别为 86.6 %和~84.5 % 。
实施例5B:评估品系CD635 (实施例1A ) 、 CD853 (实施例1A)和 CD998 (实施例2C)对乙醇酸的抗性。.
制备一式两份含有浓度为5 g/L ~ 25 g/L的乙醇酸的PDA板。还制 备不含乙醇酸的对照板。制备品系CD635、 CD853和CD998的稀释物
系列，将稀释物系列的各稀释物的5jiiL点在上述各板上。将接种的板培 养于30。C下三天。比较品系CD635在含有最高至15 g/L浓度的乙醇酸 的板上生长，但是不能在任何更高浓度的含乙醇酸的板上生长。品系 CD853表现在含有最高至25g/L乙醇酸的乙醇酸板上生长的能力。品系 CD998能够在含有最高至22.5 g/L乙醇酸的板上生长。这些测试指示， 乙醇酸可用作具有非功能性crs2基因的突变品系的选择性培养基。
实施例6:比较品系CD607 (实施例1A)、品系CD936 (实施例2B ) 和品系CD1300 (实施例3C)的微需氧摇瓶特征。
品系CD607、 CD936和CD1300分别在实施例5A描述的条件下培 养。培养93小时后，比较品系CD607已经消耗了 16.5 g/kg葡萄糖并产 生了 10.8 g/kg乳酸。在相同时间段中，品系CD936消耗21.6g/kg葡萄 糖并产生了 19.3 g/kg乳酸，略低于由品系CD607所产生的两倍。品系 CD1300消耗29.9g/kg葡萄糖并产生了 24.6 g/kg乳酸，高出品系CD607 超过125 % 。品系CD607的乳酸得率是65.5 % ,而品系CD936和CD1300 的得率分别为89.4%和82.3%。品系CD607在该时间范围还产生2.02 g/kg丙酮酸，而CD936和CD1300分别产生0.68 g/kg和0.83 g/kg丙酮 酸。也在该时间范围，CD607产生0.67 g/kg乙酸，相比而言CD936或 CD1300无乙酸生产。
在该实验中还对生长作了监控。93小时后，比较品系CD607已经 生长至OD600约5.7，而品系CD936和CD1300分别生长至OD600约 7.5和3.2。大大更低的品系CD1300的生长指示该品系的比生产力大大 高于比较品系CD607和品系CD936的。
实施例7A:东方伊氏酵母PGK (/o尸GA7)启动子区的克隆；带有在 /o尸Gf/启动子和啤酒糖酵母终止子控制下的大肠杆菌潮霉素 基因的质粒(pMI318,图6)的构建。
利用神支鉴定为SEQ. ID. NO. 39和SEQ. ID. NO. 40的引物，以与 WO 02/042471实施例22中描述的相同的方式从C. som^em^基因组 DNA获得C sw wm^尸G〖/基因的920 bp探针片段。从正在生长的东 方伊氏酵母品系分离基因组DNA并重悬于10 mM Tris-HCl + 1 mM EDTA ( pH 8 ) ( TE )中。东方伊氏酵母基因组DNA用///"dll切割，
且以C. soworm^尸G《/基因为探针用标准方法准备DNA印迹和杂交。 从琼脂糖凝胶分离得到 2 kbp大小的片段并将其克隆进/7/mmi-切割的 质粒中。大肠杆菌转化体与尸G《/探针的集落杂交导致含有大部分东方
伊氏酵母尸g〖/ (7o尸ga:/j蛋白编码序列但无启动子序列的///"^n片 段的分离，如测序所驺、证的。
包含/o尸G《/启动子区的基因组片段获自连接介导的PCR扩增 (Mueller, P.R.和Wold, B. 1989， "In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR." 5We"ce 246:780-786 )。 用 T4 DNA连接酶(New England BioLabs )将鉴定为SEQ. ID. NO. 41的接 头和鉴定为SEQ. ID. NO. 42的接头的混合物与//aelll消化的东方伊氏 酵母基因组DNA连接。连接混合物的样品用作50plPCR反应的模板， 该反应含有0.1 ^M^皮鉴定为SEQ. ID. NO. 43的引物和1 jxM被鉴定为 SEQ. ID. NO. 44的引物。在加入2 U Dynazyme EXT后将反应混合物加 热至94°C 3分钟。反应循环30次如下94°C 1分钟，68°C 2分钟和72°C 2分钟，最后72。C延伸10分钟。以该第一次PCR扩增的稀释样品作为 嵌套式PCR反应(50 pi)中的模板，该反应包含0.05 被鉴定为SEQ. ID. NO. 45的引物和0.5 jiM被鉴定为SEQ. ID. NO. 46的引物。在加入2 U Dynazyme EXT后将反应混合物加热至94°C 3分钟。反应然后循环30 次如下94°C 1分钟，67°C 2分钟和72°C 2分钟，最后72。C延伸10分 钟。
分离 600 bpPCR片段并测序。设计了被鉴定为SEQ. ID. NO. 47和 SEQ. ID. NO. 48的嵌套式引物，且除了使用印/zI消化的东方伊氏酵母 DNA以及使用退火温度65°C来实施PCR之外，与上述相似地将其与被 鉴定为SEQ. ID. NO. 49和SEQ. ID. NO. 50的寡核苷酸一同用于连接介 导的PCR扩增中。
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 51和SEQ. ID. NO. 52的引物和以东方 伊氏酵母基因组DNA为模板，PCR扩增东方伊氏酵母尸G《/启动子。 用克列诺酶填补该片段，然后用ZMI切割。凝胶分离633 bp片段，且 将其与通过用Z/zoI消化称作pMI270的质粒(描述于WO 03/049525图 4中)得到的4428 bp片段连接，用克列诺酶和0.1 mM dNTP填补该片 段，并用A7 "I消化。质粒pMI270包含与C. m"o^朋,;y尸G《/启动子和 啤酒糖酵母终止子连接的大肠杆菌潮霉素基因。所得质粒称作
PMI318(图6)。质粒pMI318包含在东方伊氏酵母尸G《/启动子和啤 酒糖酵母CL4ZJ0终止子控制下的大肠杆菌潮霉素基因。
实施例7B:包含在/o尸GA7启动子和啤酒糖酵母04丄/0终止子控制下 的潮霉素基因、和在/o尸Gf/启动子和啤酒糖酵母CTC/终止子控制下 的瑞士乳杆菌丄D/Z基因的质粒(pMI321，图7)的构建
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 53和SEQ. ID. NO. 54的引物，且以东 方伊氏酵母基因组DNA为模板，从实施例7A PCR扩增东方伊氏酵母 尸GA7启动子。用克列诺酶和O.l mM dNTP填补该片段，然后用M:ol 切割。凝胶分离633 bp片段。
质粒pVRl(描述于WO 03/102152图7中)包含在啤酒糖酵母 启动子和啤酒糖酵母CFC7终止子控制下的瑞士乳杆菌LD/Z基因。质 粒pVRl用消化，用克列诺酶填补，并用iVcol切割。将从质粒pVRl 得到的7386 bp片段与633 bp /o尸G《/ ^多f片段连接。将所得质粒命 名为pMI320。质粒pMI320包含在/o尸GA7启动子和啤酒糖酵母CTC/ 终乂子控制下的瑞士乳杆菌LD/Z基因。
质粒pMI318 (图6,实施例7A)和pMI320用J/ al和消化。
连接以形成质粒pMI321 (图7)。— 、' '
.潮霉素基因(及其终止子)位于质粒pMI321中介于用作同向重复 序列的两个拷贝的/o尸GK/启动子之间。该构建体可允许用质粒pMI321 转化的细胞参与同源重组以"环出，，潮霉素基因和终止子以及一个拷贝 的/o尸G《/启动子。
实施例7C:东方伊氏酵母尸DC (/o尸DCL4)启动子区的克隆；具有在 /o尸G《/启动子和哞酒糖酵母终止子控制下的大肠杆菌潮霉素 基因、在/o尸G〖/y^^f和啤酒糖酵母crc/终止子控制下的瑞士乳杆 菌LD/Z基因、和/o尸DCL45，側翼区的质粒(pMI355，图8)的构建。
根据生产商提供的说明书，将野生型东方伊氏酵母品系ATCC PTA-6658的基因组文库构建进SuperCosl ( Stratagene)粘粒载体中。用 称作SEQ. ID. NO. 55和SEQ. ID. NO. 56的引物从品系基因组DNA中经 PCR扩增尸Z)C-样序列。扩增了 700 bp的尸DC基因片段。利用杂交技术，如WO 03/049525中所述用标记的PCR片段作探针筛选该基因组文库， 分离包含尸DC基因的粘粒克隆并测序。利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 57 和SEQ. ID. NO. 58的引物并以东方伊氏酵母尸DC粘粒DNA为模板 PCR扩增可读框起始处上游自1000 bp至167bp的东方伊氏酵母 尸DCL4 5，区。用Sa/I和&cl切割该片段。凝胶分离836 bp片段，且将 其与用Sa/I和消化质粒pMI321 (图7,实施例7B )获得的6992 bp 片段连接。将所得质粒命名为pMI355 (图8)。
实施例7D:东方伊氏酵母尸Z)C (/o尸DCL4 )终止子区的克隆；具有 /o尸Z)CL4 5，侧翼区、在/o尸GA7启动子和啤酒糖酵母终止子控 制下的大肠杆菌潮霉素基因、在/o尸g《/y^^f和啤酒糖酵母cr:/終 止子控制下的瑞士乳杆菌ZZ)/Z基因、和/o尸Z)C" 3，侧翼区的质粒 (pMI356 (图9 )和pMI357 )的构建。
利用净皮鉴定为SEQ. ID. NO. 59和SEQ. ID. NO. 60的引物并以东方 伊氏酵母尸Z)CL4粘粒DNA(实施例7C)为模板，PCR扩增对应于尸Z)C 翻译终止密码子下游自233 bp至872 bp序列的东方伊氏酵母尸Z)C 3， 区。用J/ al切割该片段。凝胶分离630 bp片段，并与用j/ al 和5"mal消化pMD55 (图8，实施例7C )获得的7809 bp片段连接。将 所得质粒命名为pMI356 (图9 )。它包含位于/o尸DCL4差^ 5，区和部 分3'侧翼之间的来自质粒pMI355的潮霉素基因和LDH盒。
质粒pMI357以相似的方式制备，只是除存在的37o尸DCL4侧翼部 分不同于质粒pMI356之外。该区域对应于尸DC翻译终止密码子上游 5bp和下游216bp的序列。
实施例7E:通过用质粒pMI356 (图9，实施例7D )转化野生型东方伊 氏酵母品系在一步中产生具有缺失的/o尸DC/爿和/o尸DC/5基因和整合 的ZJzLDZ/基因的东方伊氏酵母突变体(CD1184)。
PTA:658。培养在潮霉素板上生长的转化的品:系。、选择不产生乙醇的转 化体作DNA印迹分析，这证实/o尸DCL4和/o尸DC/S基因二者的缺失 以及至少一个拷贝的ZJzZX^基因的插入。将该品系命名为CD1184。
实施例7F:包含/o尸DCL4 5'侧翼区、在/o尸GA7启动子控制下的ScA^EZJ
基因、在/o尸ga:/启动子和&crc/终止子控制下的瑞士乳杆菌zx)/z基
因、和/o尸Z)CL4 3，侧翼区的质粒pMI433 (图10)的构建。
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 61和SEQ. ID. NO. 62的引物且以东方 伊氏酵母基因组DNA为模板，PCR扩增东方伊氏酵母尸g《/启动子。 用克列诺酶和O.l mm dNTP填补该片段，然后用S/ /zI切割。凝胶分离 669 bp片段。用ATzoI切割称作pMI233的质粒(描述于WO 03/049525 图23C中)。用克列诺酶填补该片段，并用S/7W切割。且将4534bp和 669 bp片段连接，且将所得质粒命名为pMI319。质粒pMI319包含啤 酒糖酵母MEZJ (5"cMEZJ)基因和/o尸GA7启动子区。
质粒pMI319质粒用J;7al切割，用T4聚合酶制成平端，并用 切割。凝胶分离2317bp片段。将其与用消化质粒pMI357 (实施例 7D)得到的6498 bp片段连接，用克列诺酶制成平端并用切割。所 得质粒包含ScAffiX5基因(及其天然终止子)取代了质粒pMI357的潮 霉素基因。将所得质粒命名为pMI433 (图10)。
实施例7G:构建包含东方伊氏酵母CZS2 5'側翼区、在〖AwmWo/erara 同向重复序列之间的5WkffiZJ基因盒和东方伊氏酵母CZS2 3'侧翼区的 质粒pMI449 (图11 )和pMI454 (图12 )。
质粒pMM28 (图2,实施例3A)用SawHI消化，用克列诺酶填补， 再用消化。将所得4077 bp片段与pMI433 (图10,实施例7F )的 2317 bp ( ^克列诺酶填补的)片段连接。将所得质粒命名为 pMI445。
利用^皮鉴定为SEQ. ID. NO. 63和SEQ. ID. NO. 64的引物，以 CTS2-2粘粒克隆为模板，经PCR扩增东方伊氏酵母L-乳S臾:高铁细胞 色素c氧化还原酶(/oCraZ4)基因的3'侧翼区(对应于预计可读框下 游自90至676 bp的序列)。PCR产物用feci和消化，且将607 bp 片段与质粒pMI445的6386 bp Sacl - 片段连接。将所得质粒命名为 pMI448。
利用^皮鉴定为SEQ. ID. NO. 65和SEQ. ID. NO. 66的引物，再次以 CK82-2粘粒克隆为模板，经PCR扩增/oC1^24 5'侧翼区(对应于预计 可读框上游自913至487bp的序列)。PCR产物用S/ / I消化，且将454
bp片段与部分消化pMI448获得的6993 bp印/zI片段相连接。将所得质 粒命名为pMI449 (图11 )。
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 67和SEQ. ID. NO. 68的引物，再次以 C7S2-2粘粒克隆为^t板，经PCR扩增/oCZ8Z4 5'側翼区(对应于预计 可读框上游自466至7bp的序列)。PCR产物用S/7/zI消化，且将493 bp 片段与部分消化质粒pMI448获得的6993 bp 片段相连接。将所得 质粒命名为pMI453。
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 69和SEQ. ID. NO. 70的引物，以 CTS2-2粘粒为模板，经PCR扩增/oCK8Z4 3，側翼区(对应于预计终止 密码子自上游402 bp至下游77bp的序歹'J ) 。 PCR产物用J/ al和Smal 消化，且将506 bp片段与质粒pMI453的6886 bp」/ "I - 5W "I片段相连 接。将所得质粒命名为pMI454 (图12)。
实施例7H:用质粒pMI449和pMI454连续转化品系CD1184 (实施例 7E),之后再诱变产生东方伊氏酵母突变品系(CD1496)。
采用乙酸锂法用质粒pMI449转化品系CD1184,且根据YPD X-a-gal板上的蜜二糖酶活性选择转化体(蓝色集落)。在一些转化体中， 品系CD1184的/oCyB24基因被转化的DNA取代经集落PCR和DNA 印迹分析证实。经由通过〖AermoM/erara重复序列的同源重组事件， A^X5标记从那些转化体中的一个中环出，如由DNA印迹分析所证实 的。利用质粒pMI454将第二个CyBZ4等位基因从该转化体中缺失。通 过集落PCR分析转化体中1000 bp CTSZ4特定PCR产物的不存在。来 自质粒pMI454的标记从经如前的重组而具有笫二个CFBZ4等位 基因缺失的转化体中环出。将该转化体命名为品系CD1436。
除暴露条件为8 vL —小时外，在实施例1A设定条件下，对品系 CD1436进行EMS诱变。允许诱变的细胞在YPD上恢复6小时，之后 将它们铺平板于PDA十35 g/L乳酸板上并于3(TC温育一周。将比品系 CD1436产生更多乳酸和更少丙三醇的品系命名为品系CD1496。品系 CD1496具有尸DC/等位基因二者的缺失(被功能性L-丄Z)Z/基因盒取代， 以及缺失其两个天然/oCZSZ4等位基因各一 )。
实施例71:利用品系CD1184、 CD1436和CD1496摇瓶发酵。 除了起始葡萄糖浓度为100g/L和搅动为100rpm夕卜，以实施例5A 中描述的通常方式在微需氧摇瓶振荡发酵中评估品系CD1184和 CD1436。生产约80小时后各品系停止消耗葡萄糖。培养144小时后， 最终乳酸滴度是乳酸生产对于品系CD1184为约60 g/kg,且对于品系 CD1436为53 g/kg。乳酸得率对于品系CD1184为约88 % ，且对于品系 CD1436为86。/。。对于品系CD1184丙三醇得率为约5.5% ,且对于品系 CD1436为8.5%。
在一式两份微需氧培养中对品系CD1436和CD1496作类似评估。 培养144小时后，最终乳酸滴度为乳酸生产对于品系CD1436为约58 g/kg以及对于品系CD1496为65 g/kg。各品系乳酸得率为约68% 。对于 品系CD1436,丙三醇得率为约11%,且对于品系CD1496仅为约8%。
实施例7J:品系CD1436 (实施例7H )和CD1496 (实施例7H )的pH 3发酵。
品系CD1436和CD1496用于緩冲至pH为3.0的分开的发酵。在 各情况中将细胞接种至5L Braun-B发酵罐中，工作体积为3L。发酵开 始时，发酵液含IIO g/L葡萄糖。根据需要加入氢氧化钾以将发酵液的 pH维持在3.0。发酵温度为30°C。加入氧以将氧摄入速率维持在5-6 mmol/L國hr。
品系CD1436以0.77 g/l-hr的速率产生乳酸，至终得率为69% 。品 系CD1496以0.83 g/l画hr的速率产生乳酸，至终得率为64 % 。品系CD1436 和CD1496分别产生0.8和0.0 g/L丙酮酸。它们分别产生18和23 g/L 丙三醇。二者都不产生可测量的乙酸盐。
实施例7K:品系CD1436 (实施例7H)及其亲本品系CD1184 (实施例 7E)的pH3发酵。
品系CD1436及其亲本品系CD1184用于緩冲至pH为3.0的分开的 发酵。在各情况中将细胞接种至5LBraun-B发酵罐中，工作体积为3L。 发酵开始时，发酵液中含130 g/L葡萄糖。根据需要加入氢氧化钾以将 发酵液的pH维持在3.0。发酵温度为30°C。加入氧以将氧摄入速率维 持在2 mmol/L-hr。
品系CD1436在培养约160小时后产生66 g/L乳酸，而品系CD1184
仅产生56 g/L乳酸。品系CD1436还以比品系CD1184更高的容积率产 生乳酸(0.43对0.35 g/l-h)。此外，品系CD1436不积累乙酸盐或丙酮 酸，而品系CD1184产生约1 g/L丙酮酸和3 g/L乙酸盐。品系CD1436 消耗葡萄糖的总体乳酸得率为约67%,相对于其亲本的69%。获得了 可比的得率，因为品系CD1436比品系CD1184产生更多的丙三醇。
实施例8A:从包含外源Z)-LZ)Z/基因盒的马克斯克鲁维氏酵母品系缺失 DZX)/基因。
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 71和SEQ. ID. NO. 72的的引物，且以 基因组DNA为模板，扩增野生型马克斯克鲁维氏酵母品系的DZZ>/基 因的3，下游基因座，其中加入A^rl/Sa/1限制位点。所克隆的区域与质粒 pMM31 (实施例3B )连接以形成质粒pMM44 (图13 )。利用^皮鉴定为 SEQ. ID. NO. 73和SEQ. ID. NO. 74的的引物，且以基因组DNA为模板， 扩增野生型马克斯克鲁维氏酵母品系的D丄D/基因的5'下游基因座，其 中加入ZmaWcoI限制位点。所克隆的区域与质粒pMM31 (实施例3B ) 连接以形成质粒pMM45 (图14)。
利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 71和SEQ. ID. NO. 75的引物从质粒 pMM44扩增片段。利用被鉴定为SEQ. ID. NO. 74和SEQ. ID. NO. 76的 引物从质粒pMM45扩增另一片段。凝胶纯化所扩增的产物( 2.8 kbp 来自pMM44和 2.5 kbp来自pMM45 ),并用于转化包含外源D-ZZ>// 基因盒(并具有完整尸DC基因)的马克斯克鲁维氏酵母品系，其根据 与WO 03/102152中描述的类似方法制得。四小时的恢复之后，将细胞 铺平板于YNB 2 %蜜二糖+ 32 mg/L J^Ga/板。
用净皮鉴定为SEQ. ID. NO. 77和SEQ. ID. NO. 78的引物经内翻外集 落PCR筛选转化体在DLD1基因座的转化DNA的同源重组。引物分别 与所克隆的5'区上游区域以及选择标记ScAffiX/编码区同源。所筛选的 32个转化体中的三个给出了预期的1.8kbPCR产物，且针对单集落分离 物划线。
利用净皮鉴定为SEQ. ID. NO. 74和SEQ. ID. NO. 77的引物，从来源 于三个阳性转化体中的两个的单集落分离物的基因组DNA扩增完整 D丄D/基因座。所有的单集落都产生预期DZX>/基因敲除的产物。这些 品系中的一个^皮鉴定为品系CD1603。
品系CD1603和亲本品系分别在含有2MD-乳酸作为唯一碳源的 YNB板上划线。亲本品系在该培养基中生长良好，但品系CD1603显示 可忽略的生长。
品系CD1603和亲本品系以实施例5A中描述的通常方式分别培养。 在整个培养过程中用HPLC测量乳酸和副产物生产。与亲本品系相比， 品系CD1603中的乳酸生产得到提高。品系CD1603中的乳酸生产速率 和乳酸滴度都高于亲本品系中的。
实施例8B:品系CD1603 (实施例8A)及其亲本品系的pH3发酵。
品系CD1603及其亲本用于緩冲至pH3.0的分开的发酵。在各情况 中将细胞接种至5L Braun-B发酵罐中，工作体积为3L。发酵开始时， 发酵液含90 g/L葡萄糖。根据需要加入氢氧化钾以将发酵液的pH维持 在3.0。发酵温度为30。C。加入氧以将氧摄入速率维持在5-6 mmol/L-hr。 品系CD1603以0.58 g/l-hr的速率产生乳酸，至终得率为69% 。它 以0.8%的得率产生丙酮酸和以7.3%的得率产生丙三醇。亲本品系以仅 0.09 g/l-hr的速率产生乳酸，至终得率为68%。亲本品系的丙酮酸和丙 三醇得率分别为21%和6.9%。这些值指示，亲本品系在其形成乳酸时 即消耗乳酸，将其转变为丙酮酸。此外，亲本品系产乙酸盐的得率为15 %。
实施例9:带有外源丄/z丄D/Z基因和外源G418基因盒的S. 6wWeh酵母细 胞的生产。
S. ^Weh是这样一种酵母，其作为天然品系缺乏在作为唯一碳源的 乳酸上生长的能力。被鉴定为SEQ. ID. NO. 85和SEQ. ID. NO. 86的引 物与来自Universal基因步移试剂盒(BD Biosciences Clontech, Pal Alto, CA, Catalog No. Kl 807-1 )的API结合用于步移中以阐明6wWeh 基因上游的 1 kbp序列。利用被鉴定为SEQ, ID. NO. 87和SEQ. ID. NO. 88的引物上的S"c/z^Z^/克隆位点，将该上游序列的850 bp序列直接克 隆在丄/z丄D/Z差^上游，以产生被命名为pCM149 (图15)的质粒。质 粒pCM149按顺序包含，幼7EF/启动子、ZALD/f差^、微小糖酵母 (S"cc/zwow少c^ e力gz^ )尸G/终止子、在Sc尸Z)C7启动子和ScGa// 0终 止子控制下的G418基因盒。Se尸G/终止子通过利用被鉴定为SEQ. ID.
NO. 89和SEQ. ID. NO. 90的引物扩增微小糖酵母基因组DNA获得。 G418基因盒描述于WO03/102152的实施例1A (图4)。
用标准乙酸锂方法，用质粒pCM149转化野生型S. 6w/cfen' ( ATCC 品系MYA-403 )的细胞。将转化体铺平板于YPD + 300 mg/L G418上， 经LASSO测定，三个转化体产生淡紫暈圈，这指示这些品系生产乳酸。 将这三个品系分别接种于YPD摇瓶中，且发现全部三个都产生乳酸。 培养约24小时后全部三个品系产生5-7g/L乳酸。亲本野生型品系不产 生任何乳酸。
权利要求
1.具有至少一个功能性外源乳酸脱氢酶(LDH)基因的基因修饰酵母细胞，该酵母细胞缺乏在作为唯一碳源的D-乳酸、L-乳酸或者D-乳酸和L-乳酸二者上生长的能力。
2. 权利要求1的基因修饰酵母细胞，其具有至少一个功能性外源 L-乳酸脱氬酶(丄D//)基因并缺乏在作为唯一碳源的L-乳酸上生长的能 力。
3. 权利要求1的基因修饰酵母细胞，其具有至少一个功能性外源 D-乳酸脱氬酶(Z^/Z)基因且该酵母缺乏在作为唯一碳源的D-乳酸上生 长的能力。
4. 权利要求2或3的基因修饰酵母细胞，其为假丝酵母属、糖酵母 属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、伊氏酵母属或汉 逊氏酵母属的细胞。
5. 权利要求4的基因修饰酵母细胞，其为物种马克斯克鲁维氏酵 母、啤酒糖酵母、C. sowo/^朋^、 S. ZmWen或东方伊氏酵母的细胞。
6. 权利要求l的基因修饰酵母细胞，其中所述细胞经过基因修饰以 使其不能够在作为唯一碳源的乳酸上生长。
7. —种基因修饰酵母细胞，其具有至少一个功能性外源乳酸脱氬 酶基因，且与野生型品系相比具有减小的L-或D-乳酸:高铁细胞色素c 氧化还原酶活性。
8. 权利要求7的基因修饰酵母细胞，其具有至少一个功能性外源 L-乳酸脱氢酶基因，且其具有与野生型品系相比降低至少90 %的L-乳酸: 高纟失细胞色素c氧化还原酶活性。
9. 权利要求7的基因修饰酵母细胞，其具有至少一个功能性外源 D-乳酸脱氢酶基因，且其具有与野生型品系相比降低至少90%的D-乳 酸:高4失细胞色素c氧化还原酶活性。
10. 权利要求8或9的基因修饰酵母细胞，其为假丝酵母属、糖酵 母属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、伊氏酵母属或 汉逊氏酵母属的细胞。
11. 权利要求10的基因修饰酵母细胞，其为物种马克斯克鲁维氏酵 母、啤酒糖酵母、C. TO"wera&、 S. ^/tfen或东方伊氏酵母的细胞。
12. 基因修饰酵母细胞，其具有(a)至少一个整合进其基因组中的 功能性外源乳酸脱氢酶(丄Di/)基因和(b) (i)至少一个天然L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的缺失或破坏。
13. 权利要求12的基因修饰酵母细胞，其具有(a)至少一个L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的的缺失或破坏和(b)至少一个 整合进其基因组中的功能性外源L-乳酸脱氢酶基因。
14. 权利要求13的基因修饰酵母细胞，其为假丝酵母属、糖酵母 属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、伊氏酵母属或汉 逊氏酵母属的细胞。
15. 权利要求14的基因修饰酵母细胞，其为物种马克斯克鲁维氏 酵母、啤酒糖酵母、C. sowore似&、 S. 6z^fen'或东方伊氏酵母的细胞。
16. 权利要求13的基因修饰酵母细胞，其进一步具有至少一个丙 酮酸脱羧酶基因的缺失或破坏。
17. 权利要求13的基因修饰酵母细胞，其中被缺失或破坏的L-乳 酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因是具有被鉴定为SEQ. ID. NO. 1、SEQ. ID. NO. 79或SEQ. ID. NO. 81的序列的基因，或与任一这样的基因至少 40 %同源。
18. 权利要求13的基因修饰酵母细胞，其中的被缺失或破坏的L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因编码具有被筌定为SEQ. ID. NO. 2、 SEQ. ID. NO. 80或SEQ. ID. NO. 82的氨基酸序列的酶，或具有与其 任一个至少40%同源的氨基酸序列的酶。
19. 权利要求12的基因修饰酵母细胞，其具有(a)至少一个D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的缺失或破坏和(b)至少一个整 合进其基因组中的功能性外源D-乳酸脱氢酶基因。
20. 权利要求19的基因修饰酵母细胞，其为假丝酵母属、糖酵母 属、裂殖糖酵母属、克鲁维氏酵母属、毕赤氏酵母属、伊氏酵母属或汉 逊氏酵母属的细胞。
21. 权利要求20的基因修饰酵母细胞，其为物种马克斯克鲁维氏 酵母、啤酒糖酵母、C.卵"w^朋"、6w/^"'或东方伊氏酵母的细胞。
22. 权利要求19的基因修饰酵母细胞，其进一步具有至少一个丙 酮酸脱羧酶基因的缺失或破坏。
23. 权利要求19的基因修饰酵母细胞，其中所述被缺失或破坏的 D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因是具有净皮鉴定为SEQ. ID. NO.83 (野生型马克斯克鲁维氏酵母品系的D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还 原酶(DLD/)基因)序列的基因、啤酒糖酵母的DZX)7基因、东方伊 氏酵母的D丄Z)/基因，或是与至少一个这样的基因至少40 %同源的基因。
24. 权利要求19的基因修饰酵母细胞，其中所述被缺失或破坏的 D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因编码具有被鉴定为SEQ. ID. NO. 84的氨基酸序列的酶、具有由啤酒糖酵母D丄Z)/基因所编码的蛋白质 的氨基酸序列的蛋白质、具有由东方伊氏酵母DZX)/基因所编码的蛋白 质的氨基酸序列的蛋白质，或者与那些之一至少40%同源的蛋白质。
25. —种发酵方法，其中于发酵条件下在包含产生乳酸或其盐的可 发酵糖类的发酵液中培养权利要求1 ~24任一项的基因修饰酵母细胞。
26. 产生权利要求1 ~24任一项的基因修饰酵母细胞的方法，包括 (a)破坏或缺失酵母细胞中的天然L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因和(b)用包含功能性外源ZX)/7基因盒的栽体转化具有被缺失 或破坏的L-或D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的酵母细胞以将 ZX>//基因盒整合进酵母细胞基因组中。
27. 权利要求26的方法，其中的天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化 还原酶基因被缺失或破坏，且ZX)//基因盒包括功能性丄-丄D//差西。
28. 权利要求26的方法，其中的天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化 还原酶基因被缺失或破坏，且ZX>//基因盒包括功能性ZXLZ)//差/^。
29. —种生产权利要求13的基因修饰酵母细胞的方法，包括a) 用含有外源L-丄D/Z基因盒的构建体转化带有天然L-乳酸:高铁细胞色素 c氧化还原酶基因的酵母细胞以产生带有整合进其基因组中的功能性外 源L-ZX)/Z基因的突变体和然后(b)破坏或缺失天然L-乳酸:高铁细胞色 素c氧化还原酶基因。
30. —种生产权利要求13的基因修饰酵母细胞的方法，包括用含 有下述的构建体转化带有天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因 的酵母细胞(a)天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5'侧翼 区；(b)天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区和(c) 位于构建体上天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5'侧翼区下 游和天然L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区上游的外源 L-丄D/Z基因盒，该构建体缺乏功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原 酶基因盒。
31. —种生产权利要求19的基因修饰酵母细胞的方法，包括a) 用含有外源D-ZDZ/基因盒的构建体转化带有天然D-乳酸:高铁细胞色素 c氧化还原酶基因的酵母细胞以产生带有整合进其基因组中的功能性外 源D-ZX)i/基因的突变体，和然后(b)破坏或缺失天然D-乳酸:高铁细 胞色素c氧化还原酶基因。
32. —种生产权利要求19的基因修饰酵母细胞的方法，包括用包 含下述的载体转化带有天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因的 酵母细胞(a)天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5'侧翼区；(b)天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区和(c)位 于构建体上天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因5，側翼区下游 和天然D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶基因3'侧翼区上游的外源 D-LDZ/基因盒，该构建体缺乏功能性D-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原 酶基因盒。
33. —种方法，其包括(a)用含有功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶(CrS2)基 因盒的构建体转化酵母或真菌宿主细胞，所述酵母或真菌宿主细胞由于 不能合成有效量的功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶而缺乏将 L-乳酸代谢为丙酮酸的能力，(b )在含有乳酸作为唯 一碳源的选择性培养基上生长所得转化的 细胞，和(c)根据消耗乳酸的能力鉴定至少一个被CKS2基因盒转化的细胞。
34. —种细胞，其具有(1)整合进其基因组中除细胞天然的crs2基因的基因座之外的位置的功能性L-乳酸:高铁细胞色素c氧化还原酶 盒和(2)至少一个该细胞天然的CTiB2基因的缺失或破坏。
全文摘要
具有外源乳酸脱氢酶基因的酵母细胞通过降低细胞中的L-或D-乳酸高铁细胞色素c氧化还原酶活性来修饰。这导致细胞乳酸消耗的降低，并能提高发酵过程中的总体乳酸产量。具有降低的L-或D-乳酸高铁细胞色素c氧化还原酶活性的细胞可通过对比如乳酸或乙醇酸这样的有机酸的抗性来筛选。
文档编号C12N9/04GK101370932SQ200680051610
公开日2009年2月18日 申请日期2006年11月17日 优先权日2005年11月23日
发明者A·阿里斯蒂多, B·M·豪斯, C·A·邓顿, M·米勒, P·索米宁, P·范赫克 申请人:自然工作有限责任公司