专利名称：：Eb病毒相关癌症的早期诊断方法及各自的试剂和试剂盒的制作方法
技术领域：
：EB病毒(EBV)是嗜淋巴细胞的人疱渗病毒，可以建立终身潜伏。在儿童时期，EBV感染通常是无症状的。然而，在青少年和成人中，EBV初次感染可导致自限性淋巴组织增生病、感染性单核细胞增多症(IM)。在EBV初次感染后，病毒存在于器官中，并终身通过唾液分泌。此外，在每10000个人外周B细胞中，约有1个潜伏存在所述病毒。在罕见的情况下，EBV感染可以导致所谓的X-连锁淋巴细胞增生综合征(XLP-综合征)或Duncan综合征，其与X染色体上的基因缺陷相关。EBV在世界范围流行，约95%的成人群体对EBV为血清阳性。潜伏存在病毒的B细胞具有在细胞培养中发展成永生化细胞的能力，而这些细胞不受调控的增殖在体内通常受功能性细胞免疫的抑制。然而，在免疫抑制患者中，例如经历器官移植的患者，或感染HIV的患者，EBV感染的B细胞可以不受控制的增殖，从而导致B细胞淋巴瘤。由于该刺激细胞增殖和使感染细胞永生化的性质，所述病毒与多种人类恶性病强烈相关，特征是高滴度的抗EBV抗体谱，和增加的循环EBVDNA水平。除上述在免疫抑制患者中的B细胞淋巴瘤外，EBV还与伯基特(Burkitt)淋巴瘤、鼻咽癌(NPC)和唾液腺癌强相关，还与霍奇金(Hodgkin)淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤和胃腺癌较低程度的相关。然而，尚未完全阐述清楚EBV在上述恶性肿瘤的病因学中扮演的特定角色。在通过任何合适的核酸扩增方法(例如PCR技术)确定给定样品中的EBNA1基因负荷的情况下，可以使用本发明中提出的寡核苷酸引物组。本发明公开的、用于确定样品中的EBNA1基因负荷的寡核苷酸引物包括SEQIDNO:l-4提出的核苷酸序列，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成，其中SEQIDNO:l和3表示上游引物，即正义引物，而SEQIDNO:2和4表示下游引物，即反义引物。此外，SEQIDNO:l-4提出的核苷^列的互补序列、变体和片段也是本发明所预期的。在对照基因B动蛋白，且确定方法是PCR技术的情况下，用于检测肌动蛋白的合适的寡核苷酸引物可以包括SEQIDNO:21(上游，正义)和SEQIDNO:22(下游，反义)中提出的核苷酸序列，及其互补序列、变体或片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列組成。为了评估所获得的结果，可以和参照比较选定的标志物基因的表达水平。该参照可以是正常的组织，即，非癌组织，优选的是与生物学样品相同的组织类型。参照可以源自自其中收集生物学样品的受试者，或任何其它合适的来源，例如来自另一个供体的健康组织或培养的细胞。如果目的基因的表达水平超过了一定值，例如，与参照样品比较的预定阈值，则认为基因的表达水平改变。根据选定基因的生物学功能，与参照样品相比，表达水平可以增加或降低。在另一个方面，本发明涉及用于执行发明的方法的试剂盒。因此，本发明的特征还在于用于诊断受试者的EBV-相关癌症的试剂盒，包括至少一种用于确定EBV基因负荷的试剂(例如通过确定EBNA1基因负荷)，和至少一种用于确定标志物基因的表达水平的试剂，所述标志物基因选自EBV基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAPK。在发明的一个实施方案中，试剂盒包括的试剂是寡核苷酸，优选的寡核苷酸引物对。所述寡核苷酸可包括SEQIDNO:1-30中提出的核苷酸序列的任一种，及其互补序列、变体和片段，或基本由上述序列组成，或由上述序列组成。到目前尚未说明，本文中使用的术语和表述具有以下含义。[0096关于核酸的"片段"，涉及给定核苷酸序列的3，和/或5，截短形式。此类片段包括例如这样的核酸，所述核酸与全长对应物相比，在其3，和/或5，端短一个或多个核苷酸。优选的，这些片段具有足以保留全长版功能的长度，即，在用于核酸扩增的寡核苷酸引物的情况下，此类片段优选的具有至少9个核苷酸的长度，更优选的至少12,最优选的至少15个核苷酸。"基因"是基因组DNA的一部分，其编码多肽。[OOlOOj"表达产物"是基因表达的产物，包括转录产物即mRNA，和翻译产物，即多肽。本文中使用的"表达水平"涉及基因转录的程度。可以通过任何合适的方法学，确定本发明中的表达水平，例如，通过Northern印迹、转录-介导的扩增或其它已知技术，来确定特定mRNA的存在或量。还可以通过确定编码蛋白质的存在来确定表达水平，例如通过4吏用Western印迹、免疫染色、免疫沉淀或其它已知的技术。如本发明中公开的，还可以通过评估基因的外遗传状态，直接确定表达水平。启动子过度甲基化提示表达水平是低的或实质上不存在的，而未甲基化的启动子区域提示目的基因是表达的。通过RT-PCT(mRNA)或Western印迹(蛋白质)，或通过甲基化特异的PCR(DNA片段)显示，特定基因的启动子的曱基化程度与基因表达水平相关。本发明中使用的"基因负荷(geneload)"涉及细胞或含有细胞的样品中的某一基因或基因组的拷贝数，特别是EBV基因组。换言之，表述"基因负荷"指细胞或生物学样品中，某一基因的量，例如EBV基因EBNA1。所述量可以定性地确定，即，通过确定它比参照样品的量更高、相等或更低；或定量地确定，例如通过与具有定义的拷贝数的参照比较，计算目的基因的拷贝数。如本文中使用的，确定基因负荷还可以包括检测基因的存在或缺失，所述基因例如EBNA1。在过去几年中，发现病毒DNA负荷是后续临床事件的良好预兆剂(prognosticator)(Tan等人，(2006)5AfCC"騰r6:227)。本文中示例性描述的发明可以适合在缺少任何一种或多种元件或一种或多种限制的条件下实践，不特别限于本文公开的内容。因此，例如术语"包括"、"包含"、"含有"等，应该理解为广泛地，不带限制的。此外，本文中使用的术语和表述是作为说明而非限制的术语使用的，此类术语和表述的使用没有任何意图排除所示和所描述特征的任何等价方式或其部分，应认识到在发明要求保护的范围内存在不同的修饰。因此，应该理解，虽然本发明特定的公开了优选的实施方案和任选的特征，但是本领域熟练的技术人员可以借助本文公开的发明的修饰和变化，从而此类修饰和变化也认为在本发明的范围内。本文已经广泛的、普遍的描述了发明。每种落入普遍公开内容内的更小的种类和亚属也构成发明的一部分。其包括具有附加条件或负限制的发明的普遍描述，所述条件或限制是从所述属中去除任何主题，不论其是否是本文中特别叙述过的特定材料。[00109根据下列示例性实例和权利要求，发明的其它特征和优势将更显而易见。应该理解，实施例仅出于示例性的目的，不应该理解为对本发明范围的限制。实施例还通过常规的酚/氯仿方法从拭子的细胞沉淀中抽提基因组DNA。表1中总结了特异针对基因EBNA1、未甲基化的LMP1、甲基化RASSF1A、甲基化CHFR、甲基化DAPK和肌动蛋白的PCR引物序列，以及预期的PCR产物大小。对于PCR反应，向^本积为25^1的PCR混合物中添加2jil的亚硫酸氢盐修饰的DNA，所述混合物含有lxPCR緩冲液、1.5mMMgCl2、lOOpmol的各种脱氧核苷三鳞酸、lOOpmol的各种使用的引物，和一单位的AmpiTaqGold(AppliedBiosystems,Branchburg，NJ)。在95"C实施PCR扩增10分钟，然后进行34圏以下循环94匸下30秒，特异的退火温度55X:下45秒，和72X:下90秒。每个反应都包括阳性的甲基化对照(Namalwa细胞DNA，每个细胞1份EBV基因组)、阴性甲基化对照(正常的鼻咽上皮组织)和空白水对照。通过2%琼脂糖凝胶电泳分析MMSP产物，并将其用溴化乙锭染色。重复所有的实验，用于评估结果的可重复性，与Namalwa细胞相比，半定量的评估EBVDNA负荷，其中Namalwa细胞^:个细胞1拷贝EBV基因组作为参照。[00124表2中描述了样品评估产生的结果。表2.对NPC早期诊断和预后的评估<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>§:Y:NPC，N:非NPC;*:5-3是可以诊断为NPC，2:不确定；0:非NPC[00125EBVEBNA1基因存在于所有NPC中，但不存在于正常上皮细胞中。因此，其似乎对于诊断和预测NPC是关键的。LMP1在超过60。/。的NPC中表达。EBNA1和LMP1阳性的样品获得100%确定的NPC诊断。为了诊断LMP1阴性样品中的NPC，需要有阳性的EBNA1，加上甲基化RASSF1A或同时甲基化CHFR/DAPK为阳性。因此，NPC诊断的基准是EBNA1的可检测性，加上未甲基化LMP1、甲基化RASSF1A或甲基化CHFR/DAPK中任一项的可检测性。[00126来自98例匹配的NPC(具有活组织检查和拭子/刷子/漱口液)，35例不匹配的NPC活组织检查，和34例正常对照样品的结果，显示对拭子样品92。/。的癌症检测率，从而MMSP检测方法的特异性是约90。/。(表3)。灵敏度等价于从105个细胞检测出2个细胞，假阳性和阴性少于5%。表3.匹配的NPC样品中的MMSP结果<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>[00127因此，本发明首次提供了高特异性、高灵敏度、非侵入式的方法,用于EBV相关癌症(例如鼻咽癌)的早期诊断。权利要求1.诊断受试者中EB病毒相关癌症的方法，其包括(a)从所述受试者收集生物学样品；(b)通过确定EBNA1基因负荷，以及至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP的基因的表达水平，来确定所述生物学样品中EB病毒基因负荷的量；和(c)将确定的所述生物学样品中的所述基因的表达水平和参照比较。2、权利要求l的方法，其还包括在b)前，从所述生物学样品中分离和纯化DNAo3、4又利要求2的方法，其中分离和纯化的DNA是基因组DNA。4、根据权利要求1-3的任一项的方法，其中通过确定至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSFIA、CHFR和DAP中的基因的外遗传状态，来确定表达水平。5、根据权利要求4的方法，其中外遗传状态是甲基化状态。6、根据权利要求5的方法，其中甲基化状态是通过甲基化特异性PCR(MSP)来确定的。7、根据权利要求6的方法，其中甲基化特异性PCR是多重甲基化特异性PCR(MMSP)。8、根据权利要求l-7的任一项的方法，其还包括确定EBNA1的基因负荷，以及LMP1和RASSFIA的表达水平。9、根据权利要求8的方法，其还包括确定CHFR和/或DAP的表达水平。10、根据权利要求1-9的任一项的方法，其还包括确定对照基因的表达水平，作为样品DNA质量的对照。11、根据权利要求10的方法，其中将持家基因用作为对照基因。12、根据权利要求ll的方法，其中使用肌动蛋白和/或甘油醛-3肩酸脱氬酶(GAPDH)作为对照基因。13、根据权利要求1-12的任一项的方法，其中EB病毒相关癌症选自B细胞和T细胞淋巴瘤，其包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤，与免疫抑制相关的淋巴瘤，和致死性中线肉芽肿；癌症，其包括鼻咽癌(NPC)、唾液腺癌、和胃腺癌；以及肉瘤，其包括平滑肌肉瘤。14、根据权利要求1-13的任一项的方法，其中c)中的参照是正常组织。15、根据权利要求1-14的任一项的方法，其中，确定EBNA1的基因负荷包括使用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQIDNO:l或SEQIDNO:3中提出的核苷#列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQIDNO:2或SEQIDNO:4中提出的核苷,列，或其变体、互补序列和片段。16、根据权利要求1-15的任一项的方法，其中确定LMP1的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQIDNO:5或SEQIDNO:7中提出的核苷紗列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQIDNO:6或SEQIDNO:8中提出的核苷,列，或其变体、互补序列和片段。17、根据权利要求1-16的任一项的方法，其中确定RASSF1A的表达水平包括利用至少两种寡核普酸引物，其中，第一种引物包括SEQIDNO:9或SEQIDNO:ll中提出的核苷絲列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQIDNO:10或SEQIDNO:12中提出的核苷紗列，或其变体、互补序列和片段。18、根据权利要求1-17的任一项的方法，其中确定CHFR的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQIDNO:13或SEQIDNO:15中提出的核苷,列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQIDNO:14或SEQIDNO:16中提出的核香絲列，或其变体、互补序列和片段。19、根据权利要求1-18的任一项的方法，其中确定DAPK的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQIDNO:17或SEQIDNO:19中提出的核苷,列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQIDNO:18或SEQIDNO:20中提出的核苷醋列，或其变体、互补序列和片段。20、根据权利要求12-19的任一项的方法，其中确定作为对照基因的肌动蛋白的表达水平包括利用至少两种寡核苷酸引物，其中，第一种引物包括SEQIDNO:21中提出的核苷#列，或其变体、互补序列和片段，第二种引物包括SEQIDNO:22中提出的核苷,列，或其变体、互补序列和片段。21、根据权利要求l-20的任一项的方法，其中生物学样品选自鼻咽拭子、漱口液和体液。22、根据权利要求1-21的任一项的方法，其中受试者是哺乳动物。23、根据权利要求22的方法，其中受试者是人。24、通过权利要求l-23的任一项的方法获得的结果的用途，其用于发展针对EB病毒相关癌症的预防性或治疗性方案。25、寡核苷酸，其具有选自SEQIDNO:1-30提出的序列的核苷,列。26、用于诊断受试者中EB病毒相关癌症的试剂盒，其包括至少一种用于确定EBNA1基因负荷的试剂，和至少一种用于确定至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的表达水平的试剂。27、根据权利要求26的试剂盒，其还包括用于确定参照基因的基因表达水平的试剂。28、根据权利要求26或27的试剂盒，其中用于检测EBNA1基因负荷，至少一个选自EB病毒基因LMP1和细胞基因RASSF1A、CHFR和DAP中的基因的表达水平，和/或参照基因的表达水平的试剂是一种或多种寡核苷酸引物。29、根据权利要求28的试剂盒，其中一种或多种寡核苷酸引物包括SEQIDNO:l-30中提出的任一种核苷酸序列，或基本由上迷序列组成，或由上述序列组成。30、修饰DNA分子的方法，其中，DNA分子是变性的，与液体琼脂糖混合，移入冷的液体中形成琼脂糖珠，其中琼脂糖珠含有变性的DNA分子，其中，随后将获得的琼脂糖珠进行后续的修饰和纯化步骤。全文摘要本发明涉及诊断与受试者中EB病毒(EBV)感染相关的癌症类型的方法，利用确定EBV基因负荷和一些分子标志物的基因表达谱，所述标志物是与EBV相关癌症相关的病毒和细胞来源的。文档编号C12Q1/68GK101617056SQ200680056919公开日2009年12月30日申请日期2006年12月21日优先权日2006年12月21日发明者胡立夫申请人:伊诺基因卡尔生物技术私人有限公司