专利名称：木霉菌分生孢子粉尘剂的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于防治温室叶部病害的生防真菌——木霉菌(Trichoderma viride)分生孢子粉尘剂的生产方法，确切的说是一种重寄生真菌的新型生防制剂的制备方法及其应用。
背景技术：
随着保护地种植面积的快速发展，经济价值较高的蔬菜如黄瓜、番茄、辣椒等长年单一种植，病害发生越来越重，尤其是灰霉病等，常造成减产20-30％，甚至绝收。保护地蔬菜病害防治历来以化防为主，靠频繁施药来控制病害，不仅成本高，费工费时，而且蔬菜中农药残留量高，即危害人体健康，又影响出口创汇，因此越来越多的有毒化学农药逐渐被限制使用。目前，世界各国都在加大生物农药的研究和开发力度，研制、开发对人、畜无毒，对环境无污染的微生物农药已成为热点。木霉菌作为一类有重要生防价值的拮抗性真菌，早在20世纪三十年代就已经发现对植物病原真菌有拮抗作用，现在已经明确其作用机制，包括产生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、竞争作用等。木霉菌强烈的竞争及生存能力在抑制病原菌的过程中起着重要作用，是一种很有开发利用价值的生防菌种。国际上已开发注册有木霉菌产品，我国也有一些木霉菌的专利，但作为生产上可真正应用的制剂却寥寥无几。现有大多数木霉菌研究都是用于防治作物土传病害的，已有关于木霉菌防治叶部病害的研究，多为分生孢子水剂。实践证明，通过液体深层发酵很难获得纯的木霉菌分生孢子，往往混和有许多的厚垣孢子和菌丝而使菌剂不能进行正常喷雾，即使喷雾可以进行，又存在液体发酵产生的分生孢子抗逆性差，在作物体表不易定植，制成的分生孢子水剂储存时间短等问题。同时采用喷雾的方法又增加温室内的湿度，而高湿是温室叶部病害流行的关键因子，在很大程度上制约了木霉菌在防治植物叶部病害方面的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于防治温室蔬菜叶部病害(灰霉病、叶霉病等)的木霉菌分生孢子生物防治粉尘剂的制备方法及其应用，以克服常规喷雾法导致温室内湿度增加给防治病害带来的不利影响。
本发明的目的是按如下内容实现的所采用的生防菌取自蔬菜作物叶表的木霉菌，经纯化后转移至试管斜面内作母菌剂，在三角瓶内振荡培养为液体菌种，再经固体发酵使其产生分生孢子，该分生孢子与超细度载体混合后制成分生孢子粉尘剂。用本方法生产的木霉菌分生孢子小而轻，耐干燥、抗逆境。
所述木霉菌分生孢子粉尘剂按如下技术加工工艺流程制备而成1)斜面母菌种制备取蔬菜叶片5-10克，加无菌水50-100毫升，经振荡后加水成1000-10000倍稀释液；取马铃薯150-200克，葡萄糖15-20克，孟加拉红0.04-0.07克、硫酸链霉素0.03-0.05克，琼脂17-20克，水1000毫升，配制成母菌种培养基；取稀释液与菌种培养基以1∶9混合后倒入培养皿内制成培养基平板，在25-28℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；2)二级菌种制备取马铃薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氢钾1-2克，硫酸镁0.5-1克，水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6-8，分装在250-1000毫升三角瓶中，装液量为100-300毫升，在121℃下灭菌20-40分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为150-200转/分，发酵温度28-31℃，发酵时间为3-5天，得到二级菌种；3)固体发酵所采用的固体发酵培养基成分以重量百分比计算为培养料为麦麸或秸秆粉或玉米渣70-80％、稻壳20-30％，水为培养料的50-100％，制作方法是将培养料与水充分混合后制成固体培养基装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在121℃下灭菌40-60分钟，接入二级菌种，接菌量为固体培养基的5-10％，发酵温度为25-30℃，接菌后第3-5天翻动一次，发酵时间7-10天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子；4)木霉菌分生孢子粉尘剂的生产将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5-10％分生孢子母粉、5-10％300-350目轻质碳酸钙、80-90％300-350目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉尘剂。
将木霉菌分生孢子粉尘剂通过喷粉器喷施于塑料大棚及各种温室中防治棚菜叶部病害。
本发明的优点在于按照本发明所提供的技术参数获得的木霉菌分生孢子，小而轻，易飘散，耐干燥，耐储存。木霉菌分生孢子借助喷粉器向“烟”一样在大棚空间漂浮，能沉降到植株各层次，并可沉积附着到比较隐蔽部位，棚壁、立柱等各个地方，比常规孢子喷雾法施药次数少，用量小，防效高，操作方便易行，且喷粉后不影响其它农事操作。同时可降低温室(塑料棚)内的湿度，使花器及叶面不结水或少结水，木霉菌孢子借助晨露及温室内早晚的湿度即可萌发、繁殖，达到对病原菌的重寄生目的。以每667m2用药0.5-1千克，防治温室蔬菜灰霉病、叶霉病等叶部病害，防治效果达60％-85％。
本发明适用于大多数木霉菌株，方法简单，省水省电，适合于不同规模生产，市场前景广阔。
具体实施例方式
实施例1木霉菌分生孢子粉尘剂的制备工艺流程如下1.斜面菌种制备取番茄叶片5克，加无菌水50毫升，经振荡后加水稀释成1000倍稀释液；取马铃薯150克，葡萄糖20克，孟加拉红0.07克，硫酸链霉素0.03克，琼脂17克，水1000毫升，配成母菌种培养基。制作方法为将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加入琼脂，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉红并使之完全溶化后装入三角瓶灭菌，在121℃下30灭菌分钟，倒平板前加入硫酸链霉素。取稀释液与母菌种培养基以1∶9重量比例混合倒入培养皿内制成培养基平板，在25℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作母菌种。其试管斜面培养基为常规PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)。
2.二级菌种制备取马铃薯150克，葡萄糖15克，磷酸二氢钾1克，硫酸镁0.5克，水1000毫升，配制成二级发酵培养液。制作方法为将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸20分钟，用纱布滤去马铃薯块，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖或蔗糖并使之完全溶化后，调pH值为6，分装在250毫升三角瓶中，装液量为100毫升，在121℃下灭菌20分钟。在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为170转/分，发酵温度28℃，发酵时间为3天，得到二级菌种一分生孢子液。
3.固体发酵所采用的固体发酵培养基成分以重量百分比计算为培养料为秸秆粉80％、稻壳20％，水为培养料的100％。制作方法为将培养料与水充分混合后制成固体培养基装入耐高温塑料袋中，在121℃下灭菌40分钟，接入二级菌种，接菌量为培养基重量的10％，发酵温度为25℃，接菌后第3天翻动一次，发酵时间7天，培养料变成绿色即耐干燥木霉菌分生孢子。
4.木霉菌分生孢子粉尘剂的生产将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取10％分生孢子母粉、10％300目轻质碳酸钙、80％350目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉尘剂。
将木霉菌分生孢子粉尘剂用农用喷粉器每667m2温室喷粉1千克，防治番茄灰霉病，在发病前或发病初期施用，防治效果达80％以上。
实施例21.斜面菌种制备取黄瓜叶片8克，加无菌水80毫升，经振荡后加水稀释成8000倍稀释液；取马铃薯180克，葡萄糖18克，孟加拉红0.05克，硫酸链霉素0.04克，琼脂18克，水1000毫升，配成母菌种培养基。制作方法为将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加入琼脂，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉红并使之完全溶化后装入三角瓶灭菌，在121℃下30灭菌分钟，倒平板前加入硫酸链霉素。取稀释液与母菌种培养基以重量比例1∶9混合倒入培养皿内制成培养基平板，在26℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作母菌种。其试管斜面培养基为常规PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)。
2.二级菌种制备取马铃薯180克，葡萄糖18克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁0.8克，水1000毫升，配制成二级发酵培养液。制作方法为将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸20分钟，用纱布滤去马铃薯块，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖或蔗糖并使之完全溶化后，调pH值为7，分装在500毫升三角瓶中，装液量为200毫升，在121℃下灭菌30分钟。在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为180转/分，发酵温度29℃，发酵时间为4天，得到二级菌种-.分生孢子液。
3.固体发酵所采用的固体发酵培养基成分以重量百分比计算为培养料为麦麸75％、稻壳25％，水为培养料的80％。制作方法为将培养料与水充分混合后制成固体培养基装入耐高温塑料袋中，在121℃下灭菌50分钟，接入二级菌种，接菌量为培养基重量的8％，发酵温度为28℃，接菌后第4天翻动一次，发酵时间8天，培养料变成绿色即耐干燥木霉菌分生孢子。
4.木霉菌分生孢子粉尘剂的生产将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5％分生孢子母粉、10％325目轻质碳酸钙、85％300目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉尘剂。
将木霉菌分生孢子粉尘剂用农用喷粉器每667m2温室喷粉0.5千克，防治黄瓜灰霉病，在发病前或发病初期施用，防治效果达75％以上。
实施例31.斜面菌种制备取番茄叶片10克，加无菌水100毫升，经振荡后加水稀释成10000倍稀释液，取马铃薯200克，葡萄糖1 5克，孟加拉红0.04克，硫酸链霉素0.05克，琼脂20克，水1000毫升，配成母菌种培养基。制作方法为将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加入琼脂，加水补足1000毫升，然后加入葡萄糖及孟加拉红并使之完全溶化后装入三角瓶灭菌，在121℃下30灭菌分钟，倒平板前加入硫酸链霉素。取稀释液与母菌种培养基以重量比例1∶9混合倒入培养皿内制成培养基平板，在28℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作母菌种。其试管斜面培养基为常规PDA培养基(马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克、水1000毫升)。
2.二级菌种制备取马铃薯200克，蔗糖20克，磷酸二氢钾2克，硫酸镁1克，水1000毫升，配制成二级发酵培养液。制作方法为将马铃薯去皮后切成1厘米见方的小块，加1000毫升水煮沸30分钟，用纱布滤去马铃薯块，加水补足1000毫升，然后加入蔗糖并使之完全溶化后，调pH值为8，分装在1000毫升三角瓶中。装液量为300毫升，在121℃下灭菌40分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为200转/分，发酵温度31℃，发酵时间为10天，得到二级菌种-分生孢子液。
3.固体发酵所采用的固体发酵培养基成分以重量百分比计算为培养料为玉米渣70％、稻壳30％，水为培养料的50％。制作方法为将培养料与水充分混合后制成固体培养基装入耐高温发酵瓶中，在121℃下灭菌60分钟，接入二级菌种，接菌量为培养基重量的5％，发酵温度为30℃，接菌后第5天晃动一次，发酵时间10天，培养料变成绿色即耐干燥木霉菌分生孢子。
4.木霉菌分生孢子粉尘剂的生产将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5％分生孢子母粉、5％350目轻质碳酸钙、90％325目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉尘剂。
将木霉菌孢子粉尘剂用农用喷粉器每667m2温室喷粉0.8千克，防治番茄叶霉病，在发病前或发病初期施用，防治效果达60％以上。
权利要求
1.一种木霉菌分生孢子粉尘剂的生产方法，其特征在于包括如下具体步骤1)斜面母菌种制备取蔬菜叶片5-10克，加无菌水50-100毫升，经振荡后加水成1000-10000倍稀释液；取马铃薯150-200克，葡萄糖15-20克，孟加拉红0.04-0.07克、硫酸链霉素0.03-0.05克，琼脂17-20克，水1000毫升，配制成母菌种培养基；取稀释液与菌种培养基以1∶9混合后倒入培养皿内制成培养基平板，在25-28℃下培养48小时，经分离获得木霉菌菌株，经纯化后转移至试管斜面内作斜面母菌种；2)二级菌种制备取马铃薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氢钾1-2克，硫酸镁0.5-1克，水1000毫升，配制成二级发酵培养液，调pH值为6-8，分装在250-1000毫升三角瓶中，装液量为100-300毫升，在121℃下灭菌20-40分钟，在无菌室内将斜面母菌种转入摇瓶，摇床转速为150-200转/分，发酵温度28-31℃，发酵时间为3-5天，得到二级菌种；3)固体发酵所采用的固体发酵培养基成分以重量百分比计算为培养料为麦麸或秸秆粉或玉米渣70-80％、稻壳20-30％，水为培养料的50-100％，制作方法是将培养料与水充分混合后制成固体培养基装入耐高温塑料袋或发酵瓶中，在121℃下灭菌40-60分钟，接入二级菌种，接菌量为固体培养基的5-10％，发酵温度为25-30℃，接菌后第3-5天翻动一次，发酵时间7-10天，至培养料变成绿色即木霉菌分生孢子；4)木霉菌分生孢子粉尘剂的生产将满载木霉菌分生孢子的固体培养料经常温干燥后，用万能粉碎机粉碎成木霉菌分生孢子母粉，按重量百分比取5-10％分生孢子母粉、5-10％300-350目轻质碳酸钙、80-90％300-350目硅藻土充分混合后制成分生孢子粉尘剂。
2.一种如权利要求1所述木霉菌分生孢子粉尘剂的应用，其特征在于将木霉菌分生孢子粉尘剂通过喷粉器喷施于塑料大棚及各种温室中防治棚菜叶部病害。
全文摘要
本发明公开一种木霉菌分生孢子粉尘剂的生产方法及其应用，利用从蔬菜叶表分离获得的木霉菌，纯化后转移至PDA试管斜面内作母菌种，通过调节温度、pH值、供氧量等技术参数使其产生分生孢子液，再采用固体发酵获得大量耐干燥分生孢子，将分生孢子粉碎后与超细度硅藻土混合制成木霉菌分生孢子粉尘剂，该粉尘剂采用喷粉的方法用于保护地蔬菜生产，对由灰霉病菌、叶霉病菌等病原菌引起的叶部病害防效达60－85％。
文档编号C12R1/885GK101024816SQ20071001026
公开日2007年8月29日 申请日期2007年2月2日 优先权日2007年2月2日
发明者庄敬华, 陈捷, 杨长成, 高增贵 申请人:沈阳农业大学, 上海交通大学