一种检测土壤脲酶活性的分析方法

专利名称：：一种检测土壤脲酶活性的分析方法
技术领域：
：本发明涉及土壤中脲酶活性的测定，具体地说是一种检测土壤中脲酶活性的分析方法。技术背景土壤中的脲酶是名称为尿素胺基水解酶的一类酶的总称，它能催化尿素水解成二氧化碳和氨，并对尿素的水解产物的后续转化及其作用具有重要的影响。脲酶NH2C0NH2_^2NH3+C02+H20+H20因此，土壤中脲酶活性的强弱影响到土壤尿素氮代谢过程中氮素的气态损失，间接影响氮肥的利用效率。土壤中脲酶的活性受土壤条件如水分、温度、土壤质地的强烈影响，同时也受到农田耕作制度、管理措施以及不同作物的影响。因此，对土壤中脲酶活性的检验有很重要的意义。而到目前为止，有关脲酶活性的测定基本都是参照O.X.哈兹耶夫[苏]著，郑洪元、周礼恺、张德生译的《土壤酶活性》一书中的方法。该种方法步骤麻烦，需要专用的分析设备，且培养批次的不同具有差异性和不确定性，使其难以适应土壤中脲酶活性的定性比较和定量研究；同时，该种方法样品的前期处理比较麻烦，降低了实验的效率，增加了实验结果的不准确性。
发明内容本发明的目的在于提供一种检验土壤中脲酶活性的分析方法。该方法是在借鉴前人测定方法的原理基础上，对脲酶活性的测定步骤和显色方法进行了改进(对测定方法进行改进)，从而减少样品处理和试验步骤的复杂性，使分析结果更加精确可靠，分析重现性更好。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种检测土壤中脲酶活性的分析方法，1)分别称取n份5-10g过l-2隱筛的土壤风干样品于n支粗试管中，n>2，每支试管中分别加入2-4mL甲苯处理10-15分钟后，向各试管中加入10-40mL0.5M磷酸盐缓冲溶液(pH6.7);然后向n-l支试管中加入5-10mL重量浓度10-20%的底物尿素溶液，向另l试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；混匀后，塞上不透气的橡皮塞，将试管放在39-4rC的恒温培养箱中培养48h,每24h振荡一次；同时作试剂空白对照，即不加土壤，其余同样品处理；2)分别向上述试管中加入5-15mL重量浓度0.5%-1%的氯化亚汞溶液以终止反应，并用重量浓度15-18%氯化钾溶液将试管内溶液稀释至20mL;3)振荡30分钟，用致密滤纸过滤；4)用扩散法测定生成的氨量；在Conwey皿的内室，注入2mL0.1NHCI和两滴万用指示剂，吸取4-6niL的滤液(朋/1含量不多于100wg)放入皿的外侧，加入5mLK2C03饱和溶液以析出气态氮；立即将皿盖好，仔细摇荡后在室温下放置48h;用0.1NNaOH回滴过剩的酸至绿色，以测的结合的氨；5)计算生成的氨量；6)计算脲酶活性计算公式为x=[(Via-V2b)*1.4*V3]*100/(W*T*V4)式中x为脲酶活性(mgNH/-N.lOOg-1.48h");V!为置于皿中内室的0.INHCI的毫升数；V2为用于滴定过剩酸的0.INNaOH的亳升数；a=0.99-1.05为0.INHCI滴定度的修正值；b=0.99-1.05为0.INNaOH滴定度的修正值；1.4为当量于lmL0.INHCI的NH/-N的毫克数；V3为反应混合物的总体积(mL);、用于分析得滤液体积(mL);W为称取土样重(g);T为培养的时间(h);100为换算为100g的系数。培养后加入的氯化亚汞溶液，可用重量浓度50%的三氯醋酸溶液或者重量浓度0.5%-1%碘化汞(^12)代替。本发明方法改进的依据土壤中的脲酶是名称为尿素胺基水解酶的一类酶的总称，是由增值的和裂解的微生物细胞释放出来、累积在土壤中的胞外酶，它们都参与土壤中尿素的分解转化过程。它们在测定过程中均需要培养的条件。土壤脲酶活性的测定主要依据尿素水解生成的氨或者碳酸气的量，或是剩余的未分解的基质的量。尿素残留量法主要依据测定未分解的尿素的量，根据施入的土样和反应后测得的尿素含量的差值，求出水解的尿素的量；蒸馏法就是将尿素水解时生成的氨从反应混合物中蒸馏出，使它与酸结合，用滴定法测出结合的氨量。不过此方法应特别小心，因为尿素的未水解部分在蒸馏氨的过程中与碱共热时可能氨水解和产生脱氨基作用；比色法就是基于尿素水解生成的氨能与Nessler试剂反应和酚盐形成有色化合物，以此测定氨量；量度C02法是用"C标记的尿素作为基质，在气体检测室中测定放射性"C02的量。不过此方法对设备的要求比较高。与此相同，本方法中土壤脲酶活性的测定也是以尿素水解时生成的氨在Co丽ey扩散皿中，通过用标准酸吸收测定，通过计算单位时间内单位土壤产生的氨量来表征土壤脲酶的活性，该方法操作简单。本试验中加入甲苯，就是为了抑制土壤中微生物的活性，准确测定土壤中的脲酶活性。本发明所使用的测定原理为尿素水解生成的氨在扩散皿中被标准酸吸收，然后在指示剂的指示作用下，釆用酸碱滴定法用标准碱反滴剩余的标准酸，以测定用于结合氨的酸量，进而计算单位时间内生成的氨的量来表征脲酶的活性。与过去的分析方法相比较，本发明的优点主要有1)所需设备简单、成本低，降低了试验成本。本发明中的培养试验是在直径10-15mm、长为100-150mm的普通玻璃试管中进行，不需用原来方法中提及的分光光度计、凯氏定氮仪等专用仪器。2)所使用的方法不需要显色，减少操作过程的复杂性，简化了操作步骤，省略显色过程，减少对分光光度计等设备要求高的依赖性。3)操作简单，分析结果稳定可靠，重现性好。原来方法需要设置灭菌土壤作为对照，本方法只需用一个不加底物的溶液作为对照；同时，由于本发明所涉及到的加入的甲苯，抑制了微生物(胞内酶)的活性，提高了测量结果(酶活性)的准确度。4)用来终止酶促反应的试剂可以是氯化亚汞溶液、50%的三氯醋酸溶液和碘化汞(Hgl2)中的任何一种。具体实施方式1.0.5M磷酸盐缓冲溶液(pH6.7):称取69gNaH2P04.H20溶于800mL蒸馏水中，用10MNaOH溶液调节pH到6.7,用蒸馏水稀释至1000mL。2.甲苯，分析纯。3.10%-20%尿素溶液称取10-20g尿素，用蒸馏水定溶至100mL。4.0.5%-1%氯化亚汞溶液称取0.5-lg氯化亚汞，用蒸馏水定溶至100mL。5.17%氯化钾溶液称取17g氯化钾，用蒸馏水定溶至100mL。6.O.INHCI溶液用装有洗耳球的10mL刻度管吸取盐酸(比重1.19)8.3mL，注入盛有150-200mL蒸馏水的烧杯中，冷却，然后吸入1000mL容量瓶中。定溶至刻度。7.0.1NNaOH溶液称取40.OOg氢氧化钠，用蒸馏水定溶至1000mL。8.K2C03饱和溶液将碳酸钾溶于蒸馏水中，直至过饱和。9.凡士林或真空润滑油10.万用指示剂0.1%甲基红和亚甲蓝的醇溶液以4:1的比例混合。保存在暗处。使用前，将混合液稀释(它与醇和水的混合比为1:1:2)。获得的红色溶液，用O.1NNaOH中和至褐紫色。操作步骤1)称取5g过2mm筛的土壤风干样品n份于n支粗试管中，分别加入2-4mL甲苯处理。10-15分钟后，向各试管中加入30mL0.5M嫌酸盐缓冲溶液(pH6.7);然后向n-l支试管中加入10mL10%的底物尿素溶液，向另l试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；混匀后，塞上不透气的橡皮塞，将试管放在4(TC(土rC)恒温培养箱中培养48h。每24h振荡一次；同时作试剂空白对照；2)加入10mL1%的氯化亚汞溶液以终止反应，用氯化钾溶液稀释至20mL;3)振荡30分钟，用致密滤纸过滤；4)用扩散法测定生成的氨量；在Co歸ey皿的内室，注入2mL0.1NHCI和两滴万用指示剂，吸取5mL(NH4+-N含量不多于100)dg)滤液放入皿的外侧，加入5mLK2C03饱和溶液以析出气态氮。立即将皿盖好，仔细摇荡后在室温下放置48h。用0.1NNaOH回滴过剩的酸至绿色，以测得结合的氨；5)计算生成的氨量；6)计算脲酶活性计算公式为x=[(Va-V2b)*1.4*V3]*100/(W*T*V4)式中x为脲酶活性(mgNH;-N.lOOg:48h-0;V为置于皿中内室的0.INHCI的体积数(mL);V2为用于滴定过剩的酸的0.INNaOH的体积数(mL);a为0.INHCI滴定度的修正值；b为0.INNaOH滴定度的修正值；1.4为当量于lmL0.INHCI的NH4+-N的亳克数；V3为反应混合物的总体积(mL);V4用于分析得滤液体积(mL);W为称取土样重(g);T为培养的时间(h);100为换算为100g的系数。实施例1本实施例所使用的黑土釆自于中国科学院海伦生态试验站，设三个不同的处理l号位对照，既不经过任何处理和添加任何土壤添加剂在25'C培养24h以上的普通土壤；2号为添加脲酶抑制剂HQ且在25。C培养24h以上的土壤；3号为添加脲酶抑制剂NBPT且在25X:培养24h以上的土壤。土壤含水量均为20%(风干土重)。2号和3号添加脲酶抑制剂的土壤，其中两种抑制剂的添加量都是50ppm,用上述方法检测黑土三种处理的脲酶活性。每种土壤得具体分析步骤如下1)称取5g过2mm筛的土壤风干样品4份于4支粗试管中，分别加入2-4mL甲苯处理。10-15分钟后，向各试管中加入30mL0.5M磷酸盐缓冲溶液(pH6.7);然后向3支试管中加入10mL10%的尿素溶液，向另l试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；混匀后，塞上不透气的橡皮塞，将试管放在40。C(土rC)恒温培养箱中培养48h。每24h振荡一次；同时作试剂空白对照；2)加入10mL1%的氯化亚汞溶液以终止反应，用氯化钾溶液稀释至20mL;3)振荡30分钟，用致密滤纸过滤；4)用扩散法测定生成的氨量；在Co丽ey皿的内室，注入2mL0.1NHCI和两滴万用指示剂，吸取51^(冊4+州含量不多于100jag)的滤液放入皿的外侧，加入5mLK2C03饱和溶液以析出气态氮。立即将皿盖好，仔细摇荡后在室温下放置48h。用0.1NNaOH回滴过剩的酸至绿色，以测得结合的氨量；5)计算生成的氨量;6)计算脲酶活性试验结果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表中数据可以看出，各处理之间结果差异达到显著水平，较小的标准差值表明该分析方法结果之间的偏差较小，精确度较高，重现性好。实施例2本实施例所使用的三种不同种植作物的棕壤均采于中国科学院沈阳生态实验站其中4号土壤前茬作物为水稻，5号土壤前茬作物为玉米，6号土壤前茬作物为大豆。三种不同耕作制度的土壤均在含水量为20%(风干土重)，温度在25。C条件下培养24h以上，测定其脲酶活性，具体步骤如下底物为20%的尿素溶液，加入5mL，其余步骤同实例1。试验结果如下:处理重复脲酶活性(mgNH4+-N.100g_1.48h_1)标准差差异显著性(P復05)测定值均值重复17.05471重复27,01297.01910.0329a重复36.9897重复17.42392重复27.48757.47090.0412b重复37.5012重复l7.99863重复28.09218.07170.0653c重复38.1245表中数据同样显示了分析结果的稳定性及较高的精密度。权利要求1.一种检测土壤中脲酶活性的分析方法，其特征在于1)分别称取n份5-10g过1-2mm筛的土壤风干样品于n支粗试管中，n≥2，每支试管中分别加入2-4mL甲苯处理10-15分钟后，向各试管中加入10-40mL0.5M磷酸盐缓冲溶液；然后向n-1支试管中加入5-10mL重量浓度10-20％的底物尿素溶液，向另1试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；混匀后，塞上不透气的橡皮塞，将试管放在39-41℃的恒温培养箱中培养48h，每24h振荡一次；同时作试剂空白对照，即不加土壤，其余同样品处理；2)分别向上述试管中加入5-15mL重量浓度0.5％-1％的氯化亚汞溶液以终止反应，并用重量浓度15-18％氯化钾溶液将试管内溶液稀释至20mL；3)振荡30分钟，用致密滤纸过滤；4)用扩散法测定生成的氨量；在Conwey皿的内室，注入2mL0.1NHCI和两滴万用指示剂，吸取4-6mL的滤液放入皿的外侧，加入5mLK2CO3饱和溶液以析出气态氮；立即将皿盖好，仔细摇荡后在室温下放置48h；用0.1NNaOH回滴过剩的酸至绿色，以测的结合的氨；5)计算生成的氨量；6)计算脲酶活性计算公式为x＝[(V1a-V2b)*1.4*V3]*100/(W*T*V4)式中x为脲酶活性(mgNH4+-N.100g-1.48h-1)；V1为置于皿中内室的0.1NHCI的毫升数；V2为用于滴定过剩酸的0.1NNaOH的毫升数；a＝0.99-1.05为0.1NHCI滴定度的修正值；b＝0.99-1.05为0.1NNaOH滴定度的修正值；1.4为当量于1mL0.1NHCI的NH4+-N的毫克数；V3为反应混合物的总体积(mL)；V4用于分析得滤液体积(mL)；W为称取土样重(g)；T为培养的时间(h)；100为换算为100g的系数。2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于培养后加入的氯化亚汞溶液，可用重量浓度50%三氯醋酸溶液或者重量浓度0.5%-1%碘化汞代替。全文摘要本发明涉及一种检测土壤中脲酶活性的分析方法1)称取筛分的土壤风干样品n份于n支粗试管中，分别加入甲苯处理10-15分钟后，向各试管中加入磷酸盐缓冲溶液；然后向n-1支试管中加入的尿素溶液，向另1试管中加入等量的蒸馏水作为样本对照；混匀后，塞上橡皮塞，恒温培养培养48h；2)往试管中加入的氯化亚汞溶液以终止反应，用氯化钾溶液稀释至20mL。振荡，过滤；3)用扩散法测定生成的氨；4)计算脲酶活性。本发明的优点为1)与传统方法相比，省略了显色比色过程，简化了操作步骤；2)减对分光光度计等设备要求高的依赖性；3)准确度高，易操作；4)结果稳定可靠，重现性好。文档编号C12Q1/34GK101270386SQ20071001068公开日2008年9月24日申请日期2007年3月21日优先权日2007年3月21日发明者武志杰,陈利军,隽英华申请人:中国科学院沈阳应用生态研究所