专利名称：以无血培养基制备a群链球菌制剂的方法及无血培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵工程领域，涉及一种利用无血培养基代替血培养基 制备A群链球菌制剂的方法，特别涉及一种以无血培养基制备A群链球菌制剂 的方法及无血培养基。
背景技术：
A群链球菌制剂又称OK-432，属于生物治疗药物，是A群链球菌弱毒株经
培养、扩增、青霉素处理后制成的冻干品，已应用于临床治疗，如癌性胸腹水
及恶性肿瘤的免疫治疗等，其性能稳定且抗癌疗效显著。但由于传统制备工艺
中常用含血及血浆培养基，使该制剂成本相对较高，并且容易带入异源性物质，
增加热源物质含量，注射给药易引起患者的过敏反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法。 本发明的另一 目的是提供一种无血培养基。
以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法如下 该方法包括以下步骤
(1) 、无血培养基的准备对无血培养基在4500r/min的条件下离心30min、 抽滤，以保证培养基澄清无杂质，然后灭菌待用；
(2) 、传代在无菌室内开启A群链球菌弱毒株工作种子批，在斜面培养 基上在37。C的条件下，培养20小时传三代，然后分别接种在无血培养基，在 37°C、 120r/min的条件下振荡培养20小时制备种子液，在传代前要进行革兰氏
染色镜检，如发现污染杂菌则废弃；
(3) 、制备A群链球菌制剂；将制好的生产用种子液接种在无血培养基中， 在37°C、 140r/min的条件下振荡培养20小时，在接种前要进行革兰氏染色镜检， 如发现污染杂菌则废弃；
(4) 、菌体灭活将青霉素和过氧化氢加入培养物内灭活，经过振荡、45 。C水浴30min， 4500r/min离心30min;
(5) 、产品收集经过菌体灭活后的培养物用生理盐水悬浮，二次离心后 将沉淀物在-37'C冻干72小时得到白色菌体干粉制剂即A群链球菌制剂，称重 后密封保存于无菌瓶中。其中的青霉素由华北制药集团有限公司生产制造；所 使用的A群链球菌为A群链球菌ATCC19615 ，由吉林省疾病防止控制中心提供； A群链球菌弱毒株工作种子批由吉林大学生命科学技术研究所提供。
上述步骤中
灭菌所用的设备为YXQ-SG41-280高压灭菌锅，由上海医用核子仪器厂生 产制造；
离心所用的设备为RC-3BPLUS低速大容量冷冻离心机，由美国Du Pont公 司生产制造。
振荡所用的设备为HZQ-Q全温振荡器，由哈尔滨东联电子技术开发有限公 司生产制造；
水浴所用的设备为DK-89-I电子恒温水浴锅，由天津市斯泰特一起有限公 司生产制造；
冻干所用的设备为Lyolab3000冷冻干燥机，由丹麦生产制造； 镜检所用的设备为HK光电显微镜，由台湾OLYMPUS公司生产制造。
无血培养基
无血培养基的优化
重点考察培养基氮源、碳源和能源对菌体生物产量的影响，选择胰蛋白胨、 葡萄糖和酵母粉含量为考察因素，以生物产量为试验指标，设计均匀实验，实 验结果进行偏最小二乘回归建模确定最佳配比。
经过回归分析可得出最佳培养基重量配比为胰蛋白胨1.2%、葡萄糖0.9%、 酵母粉0.4%、氯化钠0.5%、磷酸二氢钾0.5%、其余为水；pH值为7.4 7.6。其 中的胰蛋白胨及酵母粉由英国OXID公司生产制造。试验设计及结果如表1所 示。
表l优化实验设计及结果
x2x3实验指标 y(g/1)
实验号l胰蛋白胨 (%)2葡萄糖 (%)3酵母粉 (o/o)11(0.5)2(0.4)3(0.25)0.1745
22(0.75)4(0.6)6(0.4)0.1825
33(1.0)6(0.8)2(0.2)0.1785
44(1.25)1(0.3)5(0.35)0.2730
5(1.5)3(0.5)1(0.15)0.2750
66(1.75)5(0.7)4(0.3)0.3120
77(2.0)7(0.9)7(0.45)0.3095
实验结果进行偏最小二乘回归建模分析，得到最优指标因素组合为: xl，2。/。;x2,0.9。/。;x3,0.4。/。;最优组合目标函数y=0.3435g/l。
得到如下二次多项式回归模型
y^.4594081國0.083747x广0.540402x2-0.458285x3+0.010952x!2+0.221875x22+0.0030 65x32 +0.097986乂^2+0.130168乂^3+0麓083乂询；
同时得到Press值和误差分析图，从图1可知，在考察氮源、碳源和能源三 个组分(3个潜变量)时，Press值最小且误差最小，说明回归模型的拟合程度 较好。
A群链球菌在无血培养基和含血培养基中的生长情况及形态特征
对不同培养基的种子液和发酵液中的菌体分别进行革兰氏染色镜检，通过 观察，菌体细胞呈圆形或卵圆形，直径0.5 2.0um，在液体培养基中，以成对 或链状出现，不运动，不生芽孢，革兰氏阳性，视野内无杂菌。从图2中的对 比可知，A群链球菌在无血培养基与含血培养基上的形态均符合A群链球菌的 形态特征，这说明A群链球菌在无血培养基上生长良好。
本发明的有益效果是利用无血培养基代替含血培养基培养制备A群链球
菌制剂，降低了制剂中潜在的异源性物质，避免使用血液成分还能有效降低培
养基成本；利用数学建模对无血培养基优化进行实验设计，对试验结果进行统
计分析，简化了实验步骤，得到培养基最佳重量配比，保证了制剂生物产量不
减少和产量的稳定性。
图1为本发明的潜变量个数与Press值(a)及误差(b)关系图。
图2为A群链球菌在无血培养基(a)及含无血培养基(b)内的生长形态。
具体实施例方式
方法实施例包括以下步骤 (1)、无血培养基的准备将无血培养基在4500r/min的条件下离心30min， 抽滤，以保证培养基澄清无杂质，然后灭菌待用；
(2)、传代在无菌室内开启A群链球菌弱毒株工作种子批，在斜面培养基 上在37。C的条件下，培养20小时传三代，然后分别接种在无血培养基，在37 。C、 120r/min的条件下振荡培养20小时制备种子液，在传代前要进行革兰氏染 色镜检，如发现污染杂菌则废弃；
(3) 、制备A群链球菌制剂；将制好的生产用种子液接种在无血培养基中， 在37°C、 140r/min的条件下振荡培养20小时，在接种前要进行革兰氏染色镜检， 如发现污染杂菌则废弃；
(4) 、菌体灭活将青霉素和过氧化氢加入培养物内灭活，经过振荡、45 。C水浴30min， 4500r/min离心30min;
(5) 、产品收集经过菌体灭活后的培养物用生理盐水悬浮，二次离心后 将沉淀物在-37"C冻干72小时得到白色菌体干粉制剂即A群链球菌制剂，称重 后密封保存于无菌瓶中。
无血培养基实施例l:
按胰蛋白胨1.0%、葡萄糖0.8%、酵母粉0.2%、氯化钠0.5°/。、磷酸二氢钾 0.5%、其余为水;pH值为7.4比例配制培养基，按回归方程计算生物产量为0.2055 g/1。实际试验中得到生物产量为0.1997 g/1同等配比的含血培养基生物产量为 0.2010 g/1 。
无血培养基实施例2:
按胰蛋白胨0.8%、葡萄糖0.7%、酵母粉0.3%、氯化钠0.5%、磷酸二氢钾 0.5%、其余为水；pH值为7.5比例配制培养基，按回归方程计算生物产量为 0.3240g/l。实际试验中得到生物产量为0.3302 g/1同等配比的含血培养基生物产量为0.3260 g/1 。
无血培养基实施例3:
按胰蛋白胨1.2%、葡萄糖0.9%、酵母粉0.4%、氯化钠0.5%、磷酸二氢钾 0.5%、其余为水；pH值为7.6比例配制培养基，按回归方程计算生物产量为 0.2389g/l。实际试验中得到生物产量为0.2410 g/1同等配比的含血培养基生物产 量为0.2410g/1 。
权利要求
1、一种以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法，该方法包括以下步骤无血培养基的准备将无血培养基在4500r/min的条件下离心30min、抽滤，以保证培养基澄清无杂质，然后灭菌待用；传代在无菌室内开启A群链球菌弱毒株工作种子批，在斜面培养基上在37℃的条件下，培养20小时传三代，然后分别接种在无血培养基，在37℃、120r/min的条件下振荡培养20小时制备种子液，在传代前要进行革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌则废弃；制备A群链球菌制剂；将制好的生产用种子液接种在无血培养基中，在37℃、140r/min的条件下振荡培养20小时，在接种前要进行革兰氏染色镜检，如发现污染杂菌则废弃；菌体灭活将青霉素和过氧化氢加入培养物内灭活，经过振荡、45℃水浴30min，4500r/min离心30min；产品收集经过菌体灭活后的培养物用生理盐水悬浮，二次离心后将沉淀物在-37℃冻干72小时得到白色菌体干粉制剂即A群链球菌制剂，称重后密封保存于无菌瓶中。
2、 一种用于制备权利要求1所述的A群链球菌制剂的无血培养基，其重 量配比为胰蛋白胨1.2%、葡萄糖0.9%、酵母粉0.4%、氯化钠0.5%、磷酸二 氢钾0.5%、其余为水；pH值为7.4 7.6。
全文摘要
本发明公开了一种以无血培养基制备A群链球菌制剂的方法及无血培养基，该方法是将A群链球菌弱毒株工作种子批经过传代，在无血培养基中制备种子液及培养，所得培养物经过菌体灭活、冻干工序得到白色菌体干粉制剂即A群链球菌制剂的过程；所用无血培养基重量配比为胰蛋白胨1.2％、葡萄糖0.9％、酵母粉0.4％、氯化钠0.5％、磷酸二氢钾0.5％、其余为水，pH值为7.4～7.6；本发明利用无血培养基代替含血培养基培养制备A群链球菌制剂，降低了制剂中潜在的异源性物质，避免使用血液成分还能有效降低培养基成本；该重量配比的培养基保证了制剂生物产量不减少和产量的稳定性。
文档编号C12R1/46GK101096647SQ20071005572
公开日2008年1月2日 申请日期2007年6月6日 优先权日2007年6月6日
发明者卢日峰, 吴战宇, 邱芳萍, 维 郎 申请人:长春工业大学