专利名称：一种从无花果树树叶中提取超氧化物歧化酶的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及利用生物技术从无花果树树叶
中提取超氧化物歧化酶(SOD)。
背景技术：
无花果英文名Fig，学名FicuscaricaL。为桑科(Moraceae)榕属 (FicusL.)多年生亚热带落叶果树，小乔木或灌木。又称寿果、明日果、 蜜果，原产于地中海沿岸的西亚沙特阿拉伯、也门一带沙漠绿洲里，是 人类最早栽培的果树之一。无花果叶含有黄酮、果胶、树脂、e-谷甾醇、 P-香树脂醇、蛇麻脂醇、棕榈酸、缬草酸、愈疮木酚、廿八烷、芸香苷、 苯甲醛、呋喃香豆素，补骨脂素，佛手柑内酯，其中某些被认为是抗癌 活性成分。
超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD,EC 1.15.11)是一种金属 酶，分子量为31000—33000，由两个亚基组成。SOD广泛存在于生物细 胞内和植物叶绿体基质中。
1938年Mann和Keilin首次从牛血红细胞中分离出一种蓝色的含铜蛋 白(Hemocuprein) ; 1969年McCord禾卩Fridovich发现这种含铜蛋白能催 化超氧阴离子自由基(02— )发生歧化反应，将其命名为超氧化物歧化 酶(Superoxide dismutase， SOD) 。 SOD是生物体内超氧自由基的专一 清除剂，能清除人体内产生的超氧阴离子自由基(02—■)，消除活性氧 毒性，在生物体内自由基产生与消除的动态平衡中起着重要作用，是生
物体内一种重要的防御酶。由于具有巨大的药用价值和广阔的应用前 景，多年来对SOD的研究与应用一直受到科学界和企业界的极大关注。
SOD的基础和应用研究进展十分迅速，并已进行了临床试验。其临 床应用主要集中在抗炎症、抗肿瘤、抗衰老及皮肤病、心血管病等疾病 的预防和治疗。随着研究工作的不断深入，SOD的应用也越来越广泛， 国外已有专利生产SOD消炎药、含SOD的化妆品、抗辐射SOD胶囊、治 疗局部缺血症SOD药剂等。美国、日本及西欧一些国家开发的重组人
soD药物，已经进行入ii期和in期临床研究。我国也开展了基因重组
SOD的研究。
目前从植物中提取SOD的工艺流程植物组织或器官—组织破碎， 盐溶液提取—离心收集上清液—硫酸铵分级沉淀—收集沉淀—水或缓 冲液溶解—丙酮沉淀—pH7.8磷酸钾缓冲液溶解—离心除去不溶杂蛋白 —透析—Biogel P-60柱层析—收集活力组分—硫酸铵沉淀—pH7.8磷酸 钾缓冲液溶解，透析—DE-32柱层析—收集活力组分—DE-32柱层析— 收集活力组分，浓縮得到SOD成品
相关资料表明，国内外有关SOD分离提取工艺中均采用乙醇、丙 酮有机溶剂。若大规摸生产SOD，需回收乙醇、丙酮等有机溶剂，不仅 浪费人力物力，而且有机溶剂易燃易爆，用于工业生产将有重大的安全 隐患。
发明内容
本发明提供一种从无花果树树叶中提取超氧化物歧化酶的方法，从 而可解决现有生产方法中采用有机溶剂提取导致生产成本高，需回收乙 醇、丙酮等有机溶剂，浪费人力物力，及有机溶剂易燃易爆，用于工业
生产将有重大安全隐患等一系列问题。以无花果树树叶为原料，采用无 有机溶剂提取超氧化物歧化酶的方法未见有文献报到。本发明采取的技 术方案是包括下列步骤 一、抽提
选新鲜或低温保鲜的无花果树树叶100克，清洗，加入50(K1000mL 含0.1 0.5mMEDTA/0.1 0.5。/o甘油0.01 0.05% P -巯基乙醇、pH7.8的磷 酸钠缓冲液，匀浆，抽提1~2小时，除渣过滤，5000~8000rpm离心10min;
二、 盐析
向上清液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，8000 10000rpm离心 10min，向上清中补加硫酸铵至85%饱和度，静置1~2小时， 8000 10000rpm离心10 20min。沉淀用50 80ml的5~10mM， pH7.8的 磷酸钠缓冲液溶解，并在4"C下对该缓冲液透析40 60小时，8000 10000rpm离心5 10min，收集上清液；
三、 阴离子交换层析
将上清液加入经5~10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用5 10mM， pH7.8的磷酸钠 缓冲液洗脱未结合的蛋白，采用5 10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液含 0.1 0.2M的氯化钠洗脱目的蛋白，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测 其酶活性，合并活性峰，冻干浓縮至3 5ml;
四、 Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析
将前经冻干浓縮的样品，加入经5 10mM, pH7.8的磷酸钠缓冲液 平衡的Sephacryl S-100HR层析柱，用5~10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液 洗脱，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，合并活性峰；进
行酶活检测及相关鉴定。
本发明以新鲜无花果树树叶为原料，经抽提，盐析，离子交换层析，
分子筛层析，制备出稳定的高活性的SOD。本发明所述无花果树树叶中 SOD的提取制备，工艺简单、成本低、可扩大生产且环保无污染。本工 艺提取的无花果树树叶SOD具有活性高和稳定性好等特点，在医药、 保健品及化妆品工业中具有巨大的应用潜力。
图1无花果叶SOD的SDS-PAGE电泳图谱，图中
lanel:箭头所示为经S-100纯化的SOD lane2: DEAE离子柱分离的SOD
M:低分子量标准蛋白Marker
图2无花果叶SOD的PAGE电泳NBT活性染色图谱，图中 Laneh NBT染色，Lane2:考马斯亮蓝染色。
具体实施方式
实施例1 一、抽提
选新鲜或低温保鲜的无花果树树叶100克，清洗，加入500mL含 0.1mMEDTA/0.1Q/。甘油0.01Q/。e-巯基乙醇、pH7.8的磷酸钠缓冲液，匀 浆，抽提1小时，除渣过滤，5000rpm离心lOmin;
二、盐析
向上清液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，8000rpm离心lOmin， 向上清中补加硫酸铵至85%饱和度，静置1小时，8000rpm离心lOmin。 沉淀用50ml的5mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解，并在4"C下对该缓冲
液透析40小时，8000rpm离心5min，收集上清液；
三、 阴离子交换层析
将上清液加入经5mM ， pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用5~10mM， pH7.8的磷酸钠 缓冲液洗脱未结合的蛋白，采用5mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液含0.1M 的氯化钠洗脱目的蛋白，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性， 合并活性峰，冻干浓縮至3ml;
四、 Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析
将前经冻干浓縮的样品上用5mM， pH7.S的磷酸钠缓冲液平衡的 Sephacryl S-100 HR层析柱，用5mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液洗脱，以 紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，合并活性峰。
实施例2 一、抽提
选新鲜或低温保鲜的无花果树树叶100克，清洗，加入750mL含 0.3mMEDTA/0.3。/。甘油0.03%3-巯基乙醇、pH7.8的磷酸钠缓冲液，匀 浆，抽提1.5小时，除渣过滤，7000rpm离心10min;
二、 盐析
向上清液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，9000rpm离心10min， 向上清中补加硫酸铵至85。/。饱和度，静置1.5小时，9000rpm离心15min。 沉淀用70ml的8mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解，并在4。C下对该缓冲 液透析50小时，9000rpm离心8min，收集上清液；
三、 阴离子交换层析
将上清液加入经8mM ， pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的
DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用7mM， pH7,8的磷酸钠缓 冲液洗脱未结合的蛋白，采用7mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液含0.15M的 氯化钠洗脱目的蛋白，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性， 合并活性峰，冻干浓縮至3.5ml;
四、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析
将前经冻干浓縮的样品上用8mM， pH7.S的磷酸钠缓冲液平衡的 Sephacryl S-100 HR层析柱，用8mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液洗脱，以 紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，合并活性峰。
实施例3 一、抽提
选新鲜或低温保鲜的无花果树树叶100克，清洗，加入1000mL含 0.5mMEDTA/0.5。/。甘油0.05。/。P-巯基乙醇、pH7.8的磷酸钠缓冲液，匀 浆，抽提2小时，除渣过滤，8000rpm离心10min;
二、 盐析
向上清液中加入固体硫酸铵至40%饱和度，10000rpm离心10min， 向上清中补加硫酸铵至85%饱和度，静置2小时，10000rpm离心20min。 沉淀用50 80ml的10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解，并在4"C下对 该缓冲液透析60小时，10000rpm离心10min，收集上清液；
三、 阴离子交换层析
将上清液加入经10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用10mM， pH7.8的磷酸钠缓 冲液洗脱未结合的蛋白，采用10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液含0.2M的 氯化钠洗脱目的蛋白，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，
合并活性峰，冻干浓縮至5ml;
四、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析
将前经冻干浓縮的样品上用10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的 Sephacryl S-100HR层析柱，用10mM， pH7.8的磷酸钠缓冲液洗脱，以 紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，合并活性峰。 实例无花果树的叶SOD检测
(1) 酶活检测
采用邻苯三酚自氧化法测定SOD的酶活性。酶活性单位定义在 25。C下，与325nm波长处，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时， 所需要的酶量，定义为一个酶活力单位。
因此，每毫升反应液中酶活单位按下式计算
自氧化速率-样液氧化速率,
V-—自氧化速率 x反应液总体积xtffl1^ 50% 样液体积
(2) 纯度及分子量鉴定
参照Weber&Osbom方法，采用5%浓縮胶，15%分离胶，进行不连 续系统的SDS-PAGE，凝胶以考马斯亮蓝R-250染色，以pharmacia标 准蛋白为对照，考察产品的纯度及分子量。从电泳图谱(见附图1)可 见，本工艺提取的SOD达到电泳纯，亚基分子量为17800Da。
(3) NBT活性染色
参照Beauchamp和Fridovich方法，将提取的无花果树树叶SOD， 采用5%浓縮胶，10%分离胶，进行不连续系统的PAGE后，将凝胶进行 NBT染色，可见特异的SOD活性着色带(见附图2)。
权利要求
1、一种从无花果树树叶中提取超氧化物歧化酶的方法，包括下列步骤一、抽提选新鲜或低温保鲜的无花果树树叶100克，清洗，加入500～1000mL含0.1～0.5mM EDTA/0.1～0.5％甘油0.01～0.05％β-巯基乙醇、pH7.8的磷酸钠缓冲液，匀浆，抽提1～2小时，除渣过滤，5000～8000rpm离心10min；二、盐析向上清液中加入固体硫酸铵至40％饱和度，8000～10000rpm离心10min，向上清中补加硫酸铵至85％饱和度，静置1～2小时，8000～10000rpm离心10～20min。沉淀用50～80ml的5～10mM，pH7.8的磷酸钠缓冲液溶解，并在4℃下对该缓冲液透析40～60小时，8000～10000rpm离心5～10min，收集上清液；三、阴离子交换层析将上清液加入经5～10mM，pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱，用5～10mM，pH7.8的磷酸钠缓冲液洗脱未结合的蛋白，采用5～10mM，pH7.8的磷酸钠缓冲液含0.1～0.2M的氯化钠洗脱目的蛋白，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，合并活性峰，冻干浓缩至3～5ml；四、Sephacryl S-100 HR凝胶过滤层析将前经冻干浓缩的样品，加入经5～10mM，pH7.8的磷酸钠缓冲液平衡的Sephacryl S-100 HR层析柱，用5～10mM，pH7.8的磷酸钠缓冲液洗脱，以紫外检测并收集蛋白峰，同时检测其酶活性，合并活性峰；进行酶活检测及相关鉴定。
全文摘要
本发明涉及一种从无花果树树叶中提取超氧化物歧化酶的方法，属于生物技术领域，以新鲜无花果树树叶为原料，经抽提，盐析，离子交换层析，分子筛层析，制备出稳定的高活性的SOD。本发明所述无花果树树叶中SOD的提取制备，工艺简单、成本低、可扩大生产且环保无污染。本工艺提取的无花果树树叶SOD具有活性高和稳定性好等特点，在医药、保健品及化妆品工业中具有巨大的应用潜力。
文档编号C12N9/08GK101096663SQ200710055710
公开日2008年1月2日 申请日期2007年5月31日 优先权日2007年5月31日
发明者今 张, 雷 张, 张同海, 曲和之, 杜珊珊, 王拥军, 王晓平, 郝东云, 露 黄 申请人:王晓平;王拥军