专利名称：在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法
技术领域：
本发明公开了在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方 法，涉及酸性成纤维细胞生长因子制备工艺的改进，进一步讲是属于 植物基因工程技术领域。
背景技术：
成纤维细胞生长因子超家族至今发现有23个成员。酸性成纤维 细胞生长因子(acidic fibroblastgrowth factors ,简称aFGF)是其中一 员，它具有很强的促有丝分裂的能力，它能刺激多种细胞的DNA合成 与增殖，包括成纤维细胞，上皮细胞，内皮细胞，平滑肌细胞，成肌 细胞，软骨细胞及神经胶质细胞。此外，还认为aFGF可以直接刺激 引发内皮细胞及成纤维细胞的迁移。aFGF在个体发育、形态发生过 程的很多阶段、血管的生成及伤口的愈合过程中都发挥着重要作用。 酸性成纤维细胞生长因子在临床医学上有着广泛的应用。如神经元损 伤的修复，缺血性疾病的恢复，胃溃疡的愈合等。
目前，获得aFGF的传统方法是从动物组织中提取及在大肠杆菌 中原核表达，然而第一种方法产率低、价格昂贵，第二种方法是由原 核表达系统产生重组蛋白，由于缺少糖基化，磷酸化等翻译后修饰， 且常形成包涵体而影响所得aFGF的生物学活性。
发明内容
本发明提供一种在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方 法，目的是解决其常规制备方法产率低、成本高等缺欠，适用于工业 化生产。
本发明的技术解决方案如下
1、人源酸性成纤维细胞生长因子(HaFGF)植物病毒表达载体的
构建
将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列468bp连入改造的 植物病毒表达载体，随后转入农杆菌用于在烟草中瞬时表达。 2、在植物中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子
选取适宜苗龄的植物为材料进行农杆菌侵染，即用注射器针头在 叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌 液从伤处注入叶片，待植物病毒携带目的基因/^/^迅速在植物体中 扩散、表达、聚集。当此聚集达峰值时，收集植株，提取目的蛋白。
本发明的积极效果在于应用改造的植物病毒做载体在植物中瞬
时表达haFGF，表达量约为植物总可溶性蛋白的1%，蛋白生产成本 低，操作过程简单，生产蛋白较传统转基因法周期短，表达量高，方 便并保持了很好的蛋白活性。
图1本发明酸性成纤维细胞生长因子的蛋白电泳图。
具体实施例方式
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本 领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权 利要求范围之内。 实施例l
1 、 HaFGF植物马铃薯X病毒表达载体的构建
根据Aa/gf序列设计引物，经PCR扩增出/^/gf片段。PCR参 数94°C 3 min; 94°C 35 sec， 54°C 30sec， 72°C lmin共20个循环； 72°C lmin; 4。Cl0min。
应用平端连接法将/7a/gf序列连入经Sma I酶切的植物马铃薯X 病毒表达载体pGR107。构建成pGR107-haFGF。该质粒用冻融法转入 感受态农杆菌GV3101，得GV3101.pGR107-haFGF。
2、在烟草中瞬时表达HaFGF
以生长期为40天(五叶期或六叶期)的烟草幼苗为材料进行侵染。
挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101.pGR107-haFGF单菌落，接 种于5 ml含有50mg /L卡那霉素，12.5mg/L四环素和50mg/L利福 平的LB液体培养基中，28。C过夜培养。次日，按照l: 50的比例 将1 ml的菌液加入50 ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中，并 加入乙酰丁香酮至终浓度20 和MES至终浓度10 mM。 28°C过 夜培养。测定菌液的OD6。。值，选择OD6Q。值范围在0.8-1.0的菌液进 行下一步操作。于常温下4000rpm， 10分钟离心收集菌体，菌体沉淀 用含有终浓度100 乙酰丁香酮和终浓度10mMMES的等体积无菌水溶液重悬，室温放置2-3小时后用以侵染植物。用注射器针头在 叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌
液从伤处注入叶片。为了利于农杆菌中T-DNA的转移，在侵染后的 一天内，将被侵染烟草置于240C以下放置。之后转移至正常条件培
在侵染7-10天后，取经GV3101.pGR107.haFGF侵染的植株叶片 100mg，用蛋白提取缓冲液提取植物总可溶性蛋白。方法如下
取烟草叶片，快速称量后放入研钵，加入液氮进行充分研磨。成 粉末后转移到Eppendorf管中，加入预冷的蛋白提取缓冲溶液20(^1， 颠倒混匀，置于冰上。12000转/分在4。C条件下离心，取上清。用 H印arin S印haroseTM CL-6B进行纯化，得到一条在分子量约17kDa 处条带。
实施例2
1、 HaFGF植物碗豆早褐病毒表达载体的构建
根据/2"/gf序列设计引物，经PCR扩增出/^/gf片段。PCR参数 94°C 3 min; 94°C 35 sec， 54°C 30sec， 72°C lmin共20个循环;72 °C lmin; 4。Cl0min。
将/^/V序列连入经Wco I ， ￡co/ I双酶切的植物碗豆早褐病毒 表达载体pCAPE2。构建成pCAPE2-haFGF。该质粒用冻融法转入感受 态农杆菌GV3101，得GV3101.pCAPE2-haFGF。
2、在豌豆中瞬时表达HaFGF
以生长期为2周的豌豆幼苗为材料进行侵染。分别挑取经转化和鉴定的农杆菌GV3101. pCAPE2-haFGF单菌落 及GV3101. pCAPEl，接种于5 ml含有50mg /L卡那霉素和50mg/L 利福平的LB液体培养基中，28°C培养24-36小时。按照1: 50的比 例将1 ml的培养物加入50 ml的含有上述抗生素的LB液体培养基中， 并加入乙酰丁香酮至终浓度20 u M和MES至终浓度10 raM。 28"C过 夜培养后，测定菌液的0D,值，选择OD,值范围在0.8-1.0的菌液 进行下一步操作。于常温下4000转/分离心10分钟收集菌体，菌体 沉淀用含有100 uM乙酰丁香酮和10 mM MES的等体积无菌水溶液 重悬，室温放置2-3小时。两者l: l混匀后，用注射器针头在叶片 背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从 伤处注入叶片。为了利于农杆菌中T-DNA的转移，在侵染后的一天 内，将被侵染豌豆置于24。C以下放置。之后转移至正常条件培养。
在侵染7-10天后，取经GV3101. pCAPEl ， GV3101. pCAPE2-haFGF 侵染的植株叶片100mg，用蛋白提取缓冲液提取植物总可溶性蛋白。
方法如下
取豌豆叶片，快速称量后放入研钵，加入液氮进行充分研磨。成
粉末后转移到Eppendorf管中，加入预冷的蛋白提取缓冲溶液200|al, 颠倒混匀，置于冰上。12000转/分在4。C条件下离心，取上清。用 H印arin S印haroseTM CL-6B进行纯化，得到一条在分子量约17kDa 处条带。
权利要求
1、一种在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，主要包括以下步骤1)人源酸性成纤维细胞生长因子植物病毒表达载体的构建将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列468bp连入改造的植物病毒表达载体，随后转入农杆菌中用于在植物中瞬时表达；2)在植物中瞬时表达人源酸性成纤维细胞生长因子选取适宜苗龄的植物材料进行农杆菌侵染，即用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片，待植物病毒携带目的基因hafgf迅速在植物体中扩散、表达、聚集；当此聚集达峰值时，收集植株，提取目的蛋白。
全文摘要
本发明公开了在植物中瞬时表达酸性成纤维细胞生长因子的方法，涉及酸性成纤维细胞生长因子制备工艺的改进，进一步讲是属于植物基因工程技术领域。首先，进行人源酸性成纤维细胞生长因子植物病毒表达载体的构建，将编码人源酸性成纤维细胞生长因子DNA序列468bp连入改造的植物病毒表达载体，随后转入农杆菌GV3101中用于在植物中瞬时表达。选取适宜苗龄的植物材料进行农杆菌侵染，即用注射器针头在叶片背面主叶脉两侧各轻划一小伤痕，接着用除去针头的注射器将菌液从伤处注入叶片，待植物病毒携带目的基因hafgf迅速在植物体中扩散、表达、聚集。当此聚集达峰值时，收集植株，提取目的蛋白。
文档编号C12N15/12GK101307322SQ20071005563
公开日2008年11月19日 申请日期2007年5月16日 优先权日2007年5月16日
发明者刘晶莹, 朱筱娟, 王兴智, 麻鹏达 申请人:东北师范大学遗传与细胞研究所