专利名称：新的工程化大肠杆菌g830的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，更具体地涉及对大肠杆菌进行改造以适用于高密度发酵的方法，以及由此产生的新的整合型透明颤菌血红蛋白-(Pta-Ack)乙酸代谢途径缺陷的工程菌。
大肠杆菌基因工程菌的高密度发酵技术是获取大量基因工程重组目的产物，如基因工程疫苗、药物、动植物生长因子和工具酶等的基础，是基因工程产品走向工业化大规模生产所必需的，是生物工程领域研究的重点技术之一。
基因工程高密度发酵研究始于70年代，一般采用三种方式分批培养、连续培养以及分批补料培养，通过控制细胞培养基的组成和发酵条件如温度、pH和其它一些影响蛋白水解酶活力、蛋白分泌和蛋白产量的因素(Yee L，Blanch H W.Recombinant protein expression in high cell density fed-batchcultures of Escherichia coli.Biotechnology(N Y).1992；10(2)1550-1556；Lee SY..High cell-density culture of Escherichia coli.Trends Biotechnol.1996；14(3)98-105High cell density growth of micro-organisms；Bunch AW.High cell densitygrowth of micro-organisms.Biotechnol Genet Eng Rev.1994；12535-61；Park SJ，Georgiou G，Lee SY.Secretory production of recombinant protein by a high celldensity culture of a protease negative mutant Escherichia coli strain.BiotechnolProg 1999；15(2)164-167；Riesenberg D，Schulz V，Knorre WA，Pohl HD，Korz D，Sanders EA，Ross A，Deckwer WD.High cell density cultivation of Escherichia coliat controlled specific growth rate.J Biotechnol.1991；20(1)17-27)。
迄今报道的高密度发酵系统，随着菌体培养密度的不断提高，发酵罐中出现溶氧不足、二氧化碳含量提高、刺激醋酸盐的形成、发酵罐混合效率降低、产热等导致工程菌生长速率降低，其中溶氧和有害次级代谢产物乙酸对工程菌发酵影响最大(Lee S Y.High cell-density culture of Escherichia coli.TrendsBiotechnol.1996；14(3)98-105)。由此可见，如何在发酵过程中降低乙酸的产生与累积，提高工程菌在高密度条件下对氧的利用，对于提高基因工程菌的培养密度及产物表达具有重要意义。目前通常采用补料控制方式来调节诸如溶氧不足、pH值变化等因素(Markl H，Zenneck C，Dubach A，Ogbonna J C.Cultivation of Escherichia coli to high cell densities in a dialysis reactor.ApplMicrobiol Biotechnol.1993；39(1)48-52；Miroux B，Walker J E.Over-productionof proteins in Escherichia colimutant hosts that allow synthesis of some membraneproteins and globular proteins at high levels.J Mol Biol.1996；260(3)289-298)。但此类方法往往受到外界设备条件的限制，不能从根本上解决问题。利用分子生物学的方法对工程菌的代谢途径进行改造，可望从根本上改善工程菌的发酵水平。
大肠杆菌以不同的碳源为培养基时，其代谢途径是不同的(Fraenkel D G.Glycolysis，pentose phosphate pathway，and Emtner Doudoroff pathway inEscherichia coli and Salmonella typhimuriumCellcular and Molecular Biology.1987；pp 142-150.American Society for Microbiology，Washington DC；Knappe J.Anaerobic dissimilation of pyruvate in Escherichia coli and Salmonella tvpimuriumCellcular and Molecular Biology.1987；pp 151-155.American Society forMicrobiology，Washington DC；Nimmo H G.The tricarboxylic acid cycle andanaplerotic reactions in Escherichia coli and Salmonella typimuriumCellcular andMolecular Biology.1987；pp 156-169.American Society for Microbiology，Washington DC；Nunn W D.Two-carbon compounds and fatty acids as carbonsources in Escherichia coli and Salmonella typimuriumCellcular and MolecularBiology.1987；pp 285-301.American Society for Microbiology，WashingtonDC)。以葡萄糖为碳源时，大多数通过糖酵解途径进入三羧酸循环，还有一些代谢的中间产物如丙酮酸，通过磷酸乙酰转移酶(pta)和乙酸激酶(ack)即pta-ack途径，产物乙酸。当以丙酮酸为唯一碳源时，产生的第一代谢产物乙酰辅酶A，通过pta-ack途径产生大量的乙酸(Guest I R. Anaerobio growth of Escherichiacoli K12 with fumarate as terminal electron acceptorGenetic studies withmenaquinone and fluoroacetate-resistant mutants.J Gen Microbiol.1979；115259-271；Brown T D.et al.The enzymatic interconversion of acetate andacetylcoenzyme A in Escherichia coli.J Gen Microbiol.1979；102327-336)。当以乙酸为唯一碳源时，乙酸通过逆向的pta-ack途径代谢。
pta-ack途径催化如下代谢途径乙酰-CoA+Pi<＝>乙酰-Pi+CoA乙酰-Pi+ADP<＝>乙酸+ATPpta-ack途径除了是一种重要的代谢途径外，还决定着乙酰磷酸基在胞内的浓度，这是磷酸转移酶系统的磷酸基供体(Fox D K，et al.Phosphate transferbetween acetate kinase and enzyme I of the bacterial phosphotransferase system.JBiol Chem.1977；26113498-13503)。从大肠杆菌的生理代谢途径分析，在基因工程菌高密度发酵过程中，菌体主要通过Pta-Ack途径产生乙酸，Pta-Ack代谢途径缺陷的工程菌其乙酸累积大幅度降低，菌密度及重组蛋白表达量均有较大幅度的提高。由于通过pta-ack途径产生的乙酸对菌体的生长不利，因此，一些pta或ack缺陷以及双缺陷的菌株已经获得并且研究了其酸性产物的积累程度，大多数菌株发酵密度和产物的表达均有所提高(Regan L，et al.Fluxanalysis of microbial metabolic pathways using a wisual programming environment.J Biotechnol.1995；151-16l；Rhee J S，et al.Characterization and evaluation fa pta(phosphotransacetylase)negative mutant of Escherichia coli HB 101 as productionhost of foreign lipase.Appl Microbiol Biotechnol.1994；42(1)100-107；San K Y，et al.Acetic acid reduction using phosphate-acetyltransferase-deficient and acetate-kinase-deficient E.coli，and metabolic engineering for high cell densityfermentation.Ann NY Acad Sci.1994；721257-267；Neway J O，et al.Improvedexpression of human interleulin-2 in high-cell-density fermentor cultures ofEscherichia coli K-12 by a phosphotransacetylase mutant.Appl Environ Microbiol.1990；56(5)1296-1302；Rhie H G，et al.The function of ackA and pta genes isnecessary for phoy(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)synthesis inrecombinant pha+Escherichia coli.Can J Microbiol.1995；200-206；蒋岚.博士论文.1997；pp58-71)，但这类工程菌在高密度发酵过程中当菌体密度较高、培养基愈来愈粘稠时，氧的传递也愈加困难，仍然面临对环境中的氧利用问题。
鉴于供氧不足是大肠杆菌高密度发酵中所普遍存在的问题，通过调节营养物质的添加和直接在发酵罐中通入纯氧或富含氧气的空气，使得溶氧水平维持在一定的水平，改善了工程菌的高密度发酵条件(Bauer S，Shiloach J.Maximal exponential growth rate and yield of E.coli obtainable in a bench-scalefermentor.Biotechnol Bioeng.1974；169(7)939-941；Fass R，Clem T R，Shiloch J.Use of a novel air separation system in a fed-batch fermentative culture ofEscherichia coli.Appl Environ Microbiol.1989；55(5)1305-1307；Qoronfleh MW.Dissolved oxygen concentration affects the accumulation of HIV-1 recombinantproteins in Escherichia coli.Appl Biochem Biotechnol.1999；80(2)107-20.)。但是，这些措施在工业化大生产中对于较为大型的发酵罐、培养时间又比较长的情况下，造成生产成本相对就更高。因此，利用分子生物学方法，通过改善细胞在贫氧条件下呼吸代谢在实际应用中更加有效。
透明颤菌血红蛋白(简称为“VHb”)是原核生物中发现的一种氧结合蛋白，它的作用机制可能在于在低氧条件下VHb可以结合环境之中的氧气，起到富积氧气以供宿主细胞利用的作用(Wakabayashi S，Matsubara H，Webster D A.Primary sequence of a dimeric bacterial haemogloin from Vitreoscilla.Nature.1986；322481-483)。在高密度发酵条件下，从菌体生长的微环境来分析，氧气供应不足的现象更为严重。从这个角度来，透明颤菌血红蛋白的利用是一种十分有意义的具有广泛应用潜力的提高发酵密度及产物表达的方法。VHb在大肠杆菌中的表达促进了宿主生长及重组蛋白的表达，Vitreoscilla血红蛋白基因被插入各种抗性和复制类型的质粒中进行表达，在贫氧条件下提高发酵密度和目的产物蛋白的表达量(Demodena S J，et al.The production of Cephaloporin Cby acremonium chrysogenum in improved by the intraacellular expression of abacteria hemoglobin.Bio/Technology.1993；11926-929Dikshit K L，et al.Cloning，characterization and expression of bacterial globin gene from Vitreoscillain E.coli.Gene.1988；70377-386；Fieschko J，et al.Production of human alphaconsensus interferon in recombinant E.coli.Chem Eng Commun.1986；45229-231；Khosla C，et al.Expression of intracellular hemoglobin improves proteinsynthesis in oxygen-limited E.coli.Bio/Technology.1990；8849-853)。然而由于宿主细胞携带有含靶蛋白基因和VHb基因的两种质粒及由于VHb蛋白的过量表达，给细胞带来严重的生理负担，从而削弱透明颤菌血红蛋白基因(简称为“vgb基因”)的功能，如过量表达的VHb蛋白在胞内形成包涵体。把vgb基因插入宿主细胞的染色体DNA中构建成整合型工程菌(吴奕.博士论文Vitreoscilla血红蛋白基因的功能，应用及其机理研究。1990；pp21-34.)，避免这种负作用。
因此，本领域迫切需要开发新的对大肠杆菌进行改造以适用于高密度发酵的方法，以及由此产生的新的适用于高密度发酵的工程菌。
本发明的一个目的就是提供一种对大肠杆菌进行改造，从而使大肠杆菌更适合高密度发酵的方法。
本发明的另一目的是提供新的适合高密度发酵的大肠杆菌工程菌。
在本发明的第一方面，提供了一种产生基因组整合有外源基因的微生物方法，它包括步骤(a)提供一整合型重组质粒，该质粒含(i)温度敏感型复制子，该复制子在复制温度下复制而在抑制温度下复制受抑制；(ii)所述微生物的染色体基因同源片段A和同源片段B；(iii)待整合的外源基因；以及(iv)2种或多种(较佳地为2-5种，更佳地为2-3种)抗性筛选标记基因(如氯霉素(cam)和卡那霉素(kan)抗性基因)；(b)用所述的整合型质粒转化宿主细胞，在抑制温度下筛选出共整合体；例如当抗性筛选标记基因是氯霉素(cam)和卡那霉素(kan)抗性基因时，共整合体的表型为在抑制温度下camR，kanR；在复制温度下camR，kanR。
(c)在复制温度下培养步骤(b)中筛选出的共整合体，使共整合体解离；产生拆分体，(d)筛选出拆分体；例如当抗性筛选标记基因是氯霉素(cam)和卡那霉素(kan)抗性基因时，拆分体体的表型为在抑制温度下camS，kanR；在复制温度下camR，kanR。
(e)在抑制温度下连续培养拆分体，使重组质粒丢失，从而产生染色体整合有外源基因的微生物。例如当抗性筛选标记基因是氯霉素(cam)和卡那霉素(kan)抗性基因时，表型为在抑制温度下camS，kanR；在复制温度下camS，kanR。
较佳地，在步骤(e)后还包括对微生物进行鉴定的步骤。
在本发明中，所述的微生物染色体基因同源片段A和同源片段B选自下组同一基因的两个片段、不同的相邻基因或操纵子结构基因的两个片段。
在本发明的第二方面，提供了一种微生物，在该微生物的基因组整合有外源的透明颤菌血红蛋白基因，而且该微生物是乙酸代谢途径缺陷型。
在本发明的一个优选例中，所述微生物的基因型为F-dcm ompT hsdS(rB-，mB-)Δ(pta-ack)∷rrnBT1T2Δ(thrAB)∷vhb-kanR。
在说明书附图中，
图1是本发明中进行基因替换的通用策略的示意图。
图2A-2I分别显示了质粒pMAK705、pthrA、pthrB、pthrA-thrB、pBR322-VHb、pACYC-VHb、pET-VHb、pVHb、和pVHb-Kan的结构。
图3显示了对pVHb-Kan质粒中插入的卡那霉素(Kan)抗性基因的插入方向进行PCR鉴定的2％琼脂糖凝胶电泳图。从左至右，各泳道分别为分子量标记物、引物对ThrB3-KMRM的扩增产物和ThrB3-KMRP的扩增产物。
图4是对大肠杆菌G830进行PCR鉴定的电泳图。
图5显示了对大肠杆菌G830进行Western印迹分析的结果。图5A是对PA1和G830的全细胞提取物的12％SDS-PAGE电泳图，其中M泳道为分子量标记物。图5B为对PA1和G830进行Western印迹分析照片。
图6为G830或PA1细胞提取物的一氧化碳(CO)差光谱分析图。CO+表示有一氧化碳；CO-表示无一氧化碳。
图7为大肠杆菌G830的thr操纵子及Pta-Ack操纵子的结构图谱。
图8VHb整合及Pta-Ack缺陷对工程菌生长的影响，其中，·，G830；o，PA1；Δ，BL21。图8A为高溶解氧条件。在摇瓶中，于37℃，300转/分钟下培养；图8B为低溶解氧条件。在摇瓶中，于37℃，100转/分钟下培养。
图9显示了在大肠杆菌BL21，PA1和G830中脯氨酰内肽酶(PEP)表达情况的SDS-PAGE分析和Western印迹分析结果。图9A为在大肠杆菌BL21(pPEP)中表达的脯氨酰内肽酶(PEP)的SDS-PAGE电泳图，其中泳道M为分子量标记物；图9B为在大肠杆菌BL21(pPEP)中表达的脯氨酰内肽酶(PEP)的WES印迹分析；图9C为在大肠杆菌PA1(pPEP)中表达的脯氨酰内肽酶(PEP)的SDS-PAGE电泳图；图9D为在大肠杆菌G830(pPEP)中表达的脯氨酰内肽酶(PEP)的SDS-PAGE电泳图；图9E为在各种工程菌中脯氨酰内肽酶(PEP)占总蛋白的百分比，其中△，BL21；○，PA1；●，G830。
图10显示了在高密度发酵条件下，VHb整合及Pta-Ack缺陷对工程菌生长的影响。
图10A为BL21，PA1和G830的DO2曲线图。
图10B为BL21，PA1和G830的生长曲线图。
图11在高密度发酵条件下，重组蛋白脯氨酰内肽酶(PEP)的表达情况。
图11A为PA1(pPEP)和G830(pPEP)的DO21曲线；
图11B为G830(pPEP)(●)和PA1(pPEP)(O)的生长曲线；
图11C是PEP在G830和PA1中的表达电泳图。
如本文所用，“微生物”包括细菌、酵母、真核细胞，它们都可用于本发明方法。较佳地，所述的微生物是细菌或酵母，更佳地是大肠杆菌。
如本文所用，“外源基因”指所述宿主细胞原本不含有的基因。在本发明方法中，对外源基因没有任何特别限制。较佳的外源基因是对提高微生物发酵能力有帮助的基因，例如透明颤菌血红蛋白基因等。
如本文所用，“抗性筛选标记基因”指用于筛选目的抗性基因，例如氯霉素(cam)、卡那霉素(kan)抗性基因、氨苄青霉素抗性基因等各种本领域已知的抗性筛选标记基因。
如本文所用，“温度敏感型复制子”指在某一温度下可复制，而在另一温度复制受抑制的复制子。可进行复制的温度为“复制温度”；复制受抑制的温度为“抑制温度”。本领域已知或将来发现的温度敏感型复制子都可用于本发明。在本发明的一个优选例中，所述的温度敏感型复制子包括pSC101rep(ts)复制子，复制温度为30℃，而抑制温度为44℃。
如本文所用，“共整合体”指质粒和染色体发生同源重组，形成质粒-染色体复合物的一类微生物。
如本文所用，“拆分体”指质粒和染色体发生同源交换后，产生经变异的染色体和质粒的一类微生物。
本发明人研究发现，通过构建pta-ack代谢途径缺损及导入透明颤菌血红蛋白基因可克服各自的缺陷，一方面解除对工程菌生长不利的乙酸的累积，另一方面提高工程菌在微环境中对氧的利用能力。本发明综合利用分子生物学方法，通过质粒与染色体的同源片段之间的同源重组，将透明颤菌血红蛋白基因导入pta-ack代谢途径缺损的工程菌PA1的苏氨酸操纵子基因位置上，构建了适用于高密度发酵的，整合透明颤菌血红蛋白vgb基因并阻断乙酸代谢途径Pta-Ack基因的工程菌G830。
本发明的方法原理大肠杆菌染色体DNA的整合方法通常是先把外源基因DNA片断插入转座基因或噬菌体DNA中，再由转座子或噬菌体携带此外源随机整合到宿主染色体DNA中。这种方法筛选工作量大，整合位置不稳定，也可能造成某些基因的缺失而影响细胞正常的生理功能。这里我们构建了一种简单，快捷的染色体-质粒同源重组方法将vgb基因整合到宿主染色体上。
首先利用携带温度敏感的pSC101 rep(ts)复制子(该复制子在30℃复制，而在44℃被抑制)，抗性标记为氯霉素(cam)的质粒(cam44℃S30℃R)构建一个含细菌染色体基因a，b(a，b可以为同一基因的两个片段，也可为两相邻基因或操纵子的结构基因)以及整合的靶序列或目的基因(ε)整合型重组质粒。
重组质粒转化到适当的宿主菌，一旦质粒所携带的细菌染色体同源片段与宿主染色体上同源基因发生重组，由于质粒所携带pSC101 rep(ts)复制子在44℃被抑制，所以很容易在44℃培养条件下，筛选到质粒与染色体之间形成的共整合体(cointegrates)(camR)，共整合体表现出的氯霉素抗性是由染色体复制子发动的。
将44℃筛选到的共整合体继续在30℃下培养，使共整合体解离(resolve)；然后筛选出30℃培养条件下在氯霉素平板上生长，而在44℃条件下生长被抑制的，即为共整合体完全拆分的拆分体(resolution products)。因为质粒与染色体解体后，氯霉素的复制则由pSC101 rep(ts)启动。重组后的质粒可以通过在44℃下连续培养而被丢掉。通过在同源片段与靶序列之间插入其它合适的抗性基因如kanR，作为阳性标记，只需要筛选出在30℃和44℃条件下表型均为camSkanR的菌株，对其进一步经鉴定PCR、氨基酸营养缺陷、代谢途径缺陷、Western印迹、整合型靶序列活性分析等方法分析鉴定，可以大大减少筛选整合子的工作量。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1材料与方法1.1材料1.1.1 菌种和质粒菌种与质粒参见表1表1 细菌和质粒
*各重组质粒的构建见下文1.1.2兔抗VHb抗体由E.Bailey(Switzerland)赠送，效价1∶400；鼠抗脯氨酰内肽酶抗体由陈常庆研究员(中国科学院上海生物工程研究中心)赠送；酶联二抗山羊抗鼠IgG-AP和山羊抗兔IgG-AP均购自华美生物工程公司。
1.1.3培养基在质粒转化，重组子筛选以及VHb整合等过程中，氯霉素，氨苄霉素和四环素在LB培养基中的浓度分别为20mg/L、100mg/L、34mg/L。
1.1.4试剂盒上海华顺生物工程公司PCR产物回收Kit、质粒抽提试剂盒、基因组DNA抽提试剂盒和胶回收试剂盒分别用于PCR产物回收、质粒提取及纯化、及DNA限制性酶切样品的回收。
1.1.5主要试剂限制性内切酶、Taq酶、T4 DNA连接酶等购自Promega公司。
1.2方法1.2.1 VHb整合菌株的筛选(A)转化用整合型重组质粒pVHb-Kan转化宿主菌PA1；转化产物直接接入100ml含20mg/L氯霉素和50mg/L卡那霉素的液体LB培养基，旋转式摇床200r/min，30℃培养48h。
(B)整合体(plasmid-chromosome cointegrates)的筛选由于卡那霉素抗性基因的插入，大大减轻了筛选正确整合体的工作量，通过直接筛选出在30℃和44℃两种培养条件下表型均为camSkanR的重组菌株，该表型的菌株则为所需的整合子，且交换后的重组质粒由于44℃下的生长被抑制而丢掉。将48h培养物稀释至10-4、10-6；各级稀释液分别吸100μl涂LB平板(50mg/L Kan)，每个稀释度涂20块平板，其中5块置于30℃培养箱中培养，其余15块置于44℃培养。36h后，纪录各平板上出现的单菌落数，并计算30℃和44℃培养温度下平均单菌落数。共整合效率按如下公式计算共整合效率＝44℃平均单菌落数/30℃平均单菌落数×100％(C)折分体(resolution products)的鉴定从44℃平板上挑取10个单菌落到100ml LB液体培养基(20mg/L kan)，在旋转式摇床上200r/min，30℃培养过夜；取0.1ml过夜菌至100ml新鲜LB培养基，在30℃旋转式摇床上继续培养1h，取0.1ml培养物涂布，置于30℃恒温箱培养；或30℃培养48h后，取适量培养物涂板，置于30℃恒温箱培养。将44℃出现的单菌落分别点接到30℃和44℃含20mg/L氯霉素LB平板，从中筛选出30℃和44℃ kanRcamS的菌株，该表型菌株为所需的整合体。纪录各平板上出现的单菌落数，并计算30℃和44℃培养温度下kanRcamS表型菌株平均单菌落数，按如下公式计算整合效率＝kanRcamS平均单菌落数/kanR平均单菌落数×100％
1.2.2 苏氨酸营养缺陷型的鉴定(A)完全培养基(每升)2g葡萄糖，10g蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl；(B)基本培养基(每升)2g葡萄糖，0.5g柠檬酸钠，7g K2HPO4，2gKH2PO4，10g(NH4)2SO4，1g MgSO4.7H2O，各种氨基酸(赖氨酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸)均为20mg，5mg维生素B1，0.5mg生物素；(C)基本培养基+苏氨酸(每升)在基本培养基中加入20mg苏氨酸。
把液体培养物稀释至10-6，涂布在完全培养基平板上，16小时后，分别点接100个单菌落至基本培养基平板及基本培养基+苏氨酸平板。仅在含苏氨酸的基本培养基上才能生长，而在不含苏氨酸的基本培养基上则不生长的菌株，为苏氨酸营养缺陷型菌株。
1.2.3 VHb活性分析方法基本上按Sharon K.M，et al.Biotechcology.1991；9473-476所述的方法进行。各工程菌在37℃低氧条件下过夜培养，离心收集菌体，用适量PBS缓冲液重悬，超声波破碎菌体后，离心收集上清，加入适量保险粉，对上清提取物进行CO差光谱分析，将样品分为等体积的两份，其中一份通入CO鼓泡反应5min，CO结合反应后用扫描分光光度计测定两份样品在380-450nm的差光谱，根据420nm处光谱峰值确定VHb浓度，计算公式为CVHb(mg/ml)＝A420/E420其中，E420为1cm比色杯1mg/ml VHb差光谱吸收峰值，取E420＝3.6。
1.2.4 Western印迹分析样品的分离1ml低氧条件下的培养物重悬于100微升1×SDS上样缓冲液((200μL50％(W/V)甘油，100μL 10％SDS，10μLβ-巯基乙醇，100μL 0.1％溴酚蓝，250μL 0.5M Tris(pH 6.8)，340μL无菌H2O)，经15％SDS-PAGE电泳分离。
检测透明颤菌血红蛋白用兔抗VHb抗体及酶联二抗山羊抗兔IgG-AP进行检测；脯氨酰内肽酶用鼠抗脯氨酰内肽酶抗体及酶联二抗山羊抗鼠IgG-AP进行检测。
1.2.5乙酸含量测定按Boechringer TC Acetate Kit说明进行测定。
1.2.6高密度发酵条件1.2.6.1培养基组份A LB培养基(LB) 10g/L 蛋白胨；5g/L酵母膏；10g/L NaCl；B基本培养基(BM) 5g/L 蛋白胨；2.5g/L 酵母膏；10g/L NaCl；
C补料培养基(AM) 300g/L 蛋白胨；150g/L 酵母膏；10g/L NaCl；40％葡萄糖1.2.6.2培养条件A摇瓶发酵种子在37℃培养过夜，接种1％过夜菌到100ml LB/250ml摇瓶，100或250rpm旋转式摇床，细胞密度由培养物在600nm的光密度A600确定。
B发酵罐发酵种子在37℃培养过夜，接种1％过夜菌到1 L BM/2.5L发酵罐，细胞密度由培养物在600nm的光密度A600确定。
1.2.7重组蛋白的含量测定超声波处理破碎菌体，样品经12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，考马斯亮蓝染脱色后，用四星胶成像分析系统定量检测各表达产物的含量。
实施例1VHb整合型重组质粒的构建(1)thrA和thrB基因的克隆选取苏氨酸操纵子的thrA，B基因部分序列作为同源片段，根据Katinka(Katinka M，Cossart P，Sibilli L，et al.，Nucleotide sequence of the thrA gene ofEscherichia coli.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1980；77(10)5730-5733)和Cossart(Cossart P.，Katinka M.，Yaniv M.，Nucleotide sequence of the thrB gene of E.coli，and its two adjacent regions；the thrAB and thrBC jurnctions.Nucleic AcidsRes.1981；9(2)339-47)报道的thrA与thrB的序列，设计如下PCR引物(表2)表2扩增thrA和thrB基因片段的引物
thrA，thrB的克隆用PA1染色体作为模板，引物对ThrA5-ThrA3扩增出866bp的thrA PCR产物，引物对ThrB5-ThrB3扩增出760bp的thrB PCR产物；PCR产物用KIT回收后，thrA，thrB分别经KpnI+BamHI和PstI+HindIII双酶切，分别克隆到经相应限制性内切酶处理的pMAK705温敏载体(pSC101温度敏感复制子，cam30℃R44℃S)(图2A)，连接产物转化DH5α，在IPTG-X-gal平板上筛选出白色菌落，限制性内切酶鉴定后，分别得到重组质粒pthrA(图2B)和pthrB(图2C)，并对两个重组子进行测序，测序结果与报道一致。thrB从质粒pthrB的PstI-HindIII位点亚克隆至pthrA的相应酶切位点，构建pthrAB(图2D)。
(2)VHb基因的亚克隆为了方便以后鉴定整合型VHb基因，在VHb基因两侧保留了适当的限制性内酶位点。
pACYC-VHb的构建用HindIII+SaII双酶切pBR322-VHb(图2E)，回收约1.4 kbVHb片段，并将其和经同样双酶切处理的pACYC184连接，转化DH5α，从50mg/L氯霉素抗性平板上挑取单菌落，分别点接到氯霉素平板和四环素(34mg/L)平板上，筛选出camRtetS重组子，再经酶切鉴定，该重组质粒命名为pACYC-VHb(图2F)。
pET-VHb的构建用XbaI+SalI双切pACYC-VHb，回收约1.5kbVHb片段，并将其和经同样双酶切处理的pET5α连接，转化DH5α，从100mg/L氨苄抗性平板上挑取单菌落，再经酶切鉴定，该重组质粒命名为pET-VHb(图2G)。
2.1.3重组质粒pVHb的构建用BamHI+SalI双切pET-VHb，回收约1.57kbVHb片段，并将其和经同样双酶切处理的pthrA-thrB连接，转化DH5α，30℃20mg/L氯霉素抗性平板上挑取单菌落，再经酶切鉴定，该重组质粒命名为pVHb(图2H)。
2.1.4整合型重组质粒pVHb-Kan的构建为了有效筛选出所需的正确克隆，在VHb和thrB之间的SalI位点插入1.2kb kanR基因片段作为阳性标记，该抗性基因通过用SalI酶切pUC4K获得，重组质粒为pVHb-Kan(图2I)。
Kan基因片段插入方向的鉴定设计Kan正向引物KMRP(与Kan转录方向一致)及反向引物KMRM(与Kan转录方向相反)，分别和ThrB3引物构成PCR引物对，以pVHb-Kan为模板，PCR结果表明，引物对KMRP-ThrB3扩增出一条约900bp的PCR产物，与预计大小一致，而KMRM-ThrB3没有扩增产物(图3)。因此，Kan为正向插入。
KMRP5′-CGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATG-3′KMRM5′-CTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGA-3′实施例2G830菌株的筛选及鉴定
(1)整合型重组菌株的表型筛选(phenotype)整合型重组质粒携带温度敏感的低拷贝复制子在30℃能够复制，而在44℃培养条件下不能复制，因此携带此质粒或该复制子衍生质粒的宿主菌在30℃条件下具有氯霉素抗性，而在44℃培养条件下对氯霉素敏感，即cam(30℃R，44℃S)。利用此特性，筛选出在30℃和44℃培养条件下表型均为kanRcamS的菌株，该表型与经正确整合、解离及质粒消除的重组工程菌是一致的。在稀释度为10-4下，共整合的频率为
正确折分及质粒消除的频率为2.4％
(表3)，共筛选出三株符合该表型的菌株，命名为G830(序号No.1-3)。表4整合型VHb菌株的筛选结果
其中No.1的大肠杆菌G830于1999年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国，武汉)，保藏号为CCTCC NOM99012。
(2)鉴定选取No.1菌株进一步经鉴定PCR、苏氨酸营养缺陷、乙酸代谢途径(Pta-Ack)缺陷、Western印迹分析、CO差光谱分析鉴定。
(A)鉴定PCR设计了VHb及Kan的正向引物，在紧接ThrB的3′-端即染色体上的ThrC5′-端巧妙设计反向引物ThrC3，只有正确的整合型菌株，才可能扩增出PCR产物；反向引物ThrB3作为对照，引物序列及其预计结合位点如表4所示。
鉴定PCR结果表明，G830 No.1菌株扩增出了2223 bp(引物对VHb5-ThrC3)及1039 bp(引物对KMRP-ThrC3)的PCR扩增产物(图4，泳道3-5)，大小均与预计一致；在同样条件下，PA1(pVHb-Kan)没有扩增出这两条特异性PCR产物(图4，泳道6)。以上结果证明，VHb-Kan整合到了ThrA-ThrB位点。
表4用于鉴定PCR的引物
(B)苏氨酸营养缺陷的鉴定把G830和PA1的培养液分别稀释至10-6，涂布在完全培养基上，16h后，分别点接100个单菌落至基本培养基及基本培养基+苏氨酸。PA1在两种培养基中均生长良好，而G830仅在含苏氨酸的基本培养基上才能生长，而在不含苏氨酸的基本培养基上则不生长(表5)，这说明由于VHb-Kan基因的定点整合到出发菌株PA1的苏氨酸操纵子ThrA-ThrB之间，从而使其成为苏氨酸营养缺陷菌株。
表5苏氨酸营养缺陷的鉴定
(C)乙酸代谢Pta-Ack途径缺失的鉴定按Boehringer TC乙酸试剂盒的方法分别测定BL21，PA1及G830发酵液中乙酸的含量。此方法利用试剂盒中组份与发酵液中乙酸的特异反应的最终产物NADH在340nm波长处的吸收值的提高来测定乙酸的含量。结果表明(表6)，PA1和G830发酵液中乙酸含量只有BL2所产生的乙酸的9-12％，说明由于转录终止信号rrnBT1T2插入至BL21的Pta-AcK之间，导致了原始出发菌株主要的乙酸代谢途径Pta-AcK的缺陷，明显减少了有毒次级代谢产物乙酸的累积。
表6用UV法测定BL21、PA1和G830的乙酸产生情况
(D)Western印迹分析G830和PA1在37℃，100r/min低氧条件下过夜培养，样品经12％SDS-PAGE电泳分离后(图5A)，电转移至杂交尼龙膜，按试剂盒说明进行Western印迹分析。经兔抗VHb抗体，山羊抗兔IgG-AP杂交，NBT-BCIP化学显色，图5B结果表明，G830样品在15 kD处有特异条带，大小与VHb一致，证明整合型VHb在G830染色体上获得表达。
(E)CO差光谱分析G830和PA1在37℃低氧条件下过夜培养，离心收集菌体，用适量PBS缓冲液重悬，超声波破碎菌体后，离心收集上清，加入适量保险粉，分别对G830和PA1上清提取物进行CO差光谱分析。如图6所示，结果表明G830提取物中表达产物VHb蛋白与CO结合后的差光谱在420nm处出现峰值，而出发菌株PA1没有这样的差光谱特性。因此，整合型VHb在G830中获得表达，且具有生物活性。
(F)G830基因型根据(A)-(E)鉴定的结果，绘制出G830的thr操纵子及Pta-Ack操纵子的结构图谱(图7)及其基因型F-dcm ompT hsdS(rB-，mB-)Δ(pta-ack)∷rrnBT1T2Δ(thrAB)∷vhb-kanR。
实施例3VHb整合及Pta-Ack缺陷对G830的生长及重组蛋白表达的影响(A)摇瓶发酵(1)VHb整合及Pta-Ack缺陷对G830的生长影响摇瓶发酵分别在高氧及低氧条件下培养E.coli BL21、PA1、G830，间隔适当时间取样，测定A600。结果如图8A和8B所示。
结果表明，在高氧培养条件下，PA1，G830的生长优势体现在对数后期，而BL21更早进入了稳定期(图8A)，这说明由于BL21所产生的乙酸的积累抑制了工程菌的生长，而前两种重组工程菌由于乙酸代谢途径的缺陷，明显减少了乙酸的积累，从而在一定程度上解除了乙酸对工程菌的生长抑制。而在低氧培养条件下，在对数期及对数后期，G830均体现了明显的生长优势(图8B)，这说明VHb的整合及Pta-Ack乙酸代谢途径的缺陷所表达的VHb蛋白及乙酸积累的减少促进了工程菌的生长。
(2)整合型VHb促进重组蛋白表达将一种异源周质分泌蛋白即点状产气单胞菌脯氨酰内肽酶(PEP)的基因表达质粒分别转化E.coli BL21、PA1、G830，按低氧培养条件在摇瓶中进行发酵，分别测定3、6、9、12、24h脯氨酰内肽酶在工程菌中的表达。SDS-PAGE电泳分析和Western印迹分析显示，脯氨酰内肽酶在三种工程菌中获得表达(图9A-D)；在3-24h诱导时间内，工程菌G830和PA1均能促进脯氨酰内肽酶的表达，且G830能维持脯氨酰内肽酶的稳定高表达；G830、PA1和BL21表达的脯氨酰内肽酶分别平均约占总蛋白的54.1％、52.3％和16.6％(图9E)。
实施例4G830高密度发酵研究(1)VHb整合及Pta-Ack缺陷对G830的生长影响在高密度发酵条件下培养E.coli BL21、PA1、G830，间隔适当时间取样。在高密度发酵的后期，G830的呼吸强度(培养液的溶氧饱和度)与BL21和PA1不同，前者的DO2降低至零，而后两者对氧的代谢能力明显减弱(
图10A)；BL21和PA1只有一个对数期，随后进入了稳定期，而G830在溶氧极限条件下出现了第二个对数生长期(
图10B)。
在高密度发酵过程中当菌体密度较高，培养基愈来愈粘稠时，菌体内氧的传递也愈加困难，在贫氧条件下动力学性质的差异再次证明VHb对细胞代谢具有明显的影响，在低溶氧水平没有表达VHb表达的细胞呼吸减慢，整个能量代谢水平降低，而VHb的表达使细胞仍保持原有的呼吸强度，这说明VHb可能参与微氧条件下细菌呼吸链的某些步骤，使细胞处于生物氧化效率较高的状态，从而显示了生长优势。G830的菌密度和细胞干重分别比BL21提高了55.5％和47.2％(表7)。因此，VHb的整合及Pta-Ack乙酸代谢途径的缺陷工程菌G830在高密度发酵中具有明显的优势。表7 VHb整合及Pta-Ack缺陷对各工程菌最大细菌密度和细胞干重的影响
实施例5整合型VHb促进重组蛋白表达(1)G830携带表达质粒的呼吸状况将重组蛋白表达质粒pPEP分别转化到G830和PA1，按实施例4中同样发酵参数在2.5L发酵罐中进行高密度发酵，记录发酵过程的溶氧饱和度DO21曲线，结果与空宿主菌基本一致。携带质粒的G830(pPEP)和G830的氧代谢曲线基本一致，均出现充分利用培养液中的氧的状况，即氧饱和度达至临界点零值；而PA1(pPEP)和PA1的氧代谢曲线也基本一致，对培养液中的氧利用达到某一个临界点即已达饱和状态，不能充分利用培养液中的游离氧，菌种对氧的利用下降(
图11A)。但G830(pPEP)对氧的代谢速度明显快于G830，可能是由于表达质粒的介入，加速了宿主菌在起始阶段的能量代谢。从对氧的代谢情况来，限制工程菌高密度发酵参数除溶氧水平(取决于设备的供氧能力)外，很重要的一个参数就是工程菌本身的特性，即不同菌株对于氧或其它因子代谢能力的强弱，如本发明的G830与PA1的发酵结果迥异就在于VHb是否导入。
(2)G830携带表达质粒的生长状况在高密度发酵过程中，按时间取样测定菌体的浊度(A600)。结果表明，G830(pPEP)和G830的生长曲线特征基本一致，均出现两个对数生长期，最高菌密度达到84.7(A600)，菌体干重为43.8(g/L)；而对照组PA1(pPEP)和PA1的的生长曲线特征也基本一致，最高菌密度达到66.3(A600)，菌体干重为33.1(g/L)(
图11B，表8)。
表8工程菌G830(pPEP)和PA1(pPEP)的最大细胞密度和细胞干重
(3)重组质粒在G830中稳定性良好的基因工程菌应该具备能使重组蛋白表达质粒在代谢过程中保持一定稳定性。将最高菌密度时的培养物分别稀释至10-9，10-12和10-15，分别将每个稀释度样品吸取100μl涂布至3块kanR，3块kanR+ampRLB平板，37℃培养过夜，纪录出现的单菌落数目，PA1(pPEP)培养物则涂布至LB平板和ampRLB平板。
结果表明，在高密度发酵的后期，G830中质粒pPEP的维持率平均在67.3％，而PA1中质粒pPEP的维持率平均在73.2％(表9)。本发明人推测在高密度后期，由于菌密度稠密，抗生素对于工程菌中质粒的选择性压力影响很小，很大程度上由菌种本身的遗传机制进行质粒的复制和分配。
表9在高密度发酵条件下，重组质粒pPEP在G830和PA1中的稳定性
*注在10-9和10-12稀释度下出现的菌落过多，无法计数。
(4)重组蛋白的表达高密度发酵的核心问题之一就是重组蛋白的表达。将最高菌密度时的G830(pPEP)和PA1(pPEP)样品处理后，用12％SDS-PAGE胶电泳分析重组蛋白的表达(
图11C)，并经四星胶成像分析系统定量分析，PEP在G830和PA1中均获得较好的表达，分别占菌体总蛋白的43.3％和39.5％。
讨论实验结果表明，温度敏感的整合型重组系统作为一种质粒-染色体之间同源基因交换的行之有效的方法，不但可以应用于染色体基因的缺失(Knockout)，还可把特定的DNA片段整合到染色体的确定位置上，这一方法的正筛选特性大大简化了筛选工作量。由于苏氨酸操纵子基因在细菌染色体上广泛存在，这里构建的质粒pVHb-kan也可用于把vgb基因整合到别的细菌染色体上。
细胞在贫氧条件下呼吸动力学性质的差异再次证明VHb对细胞代谢具有明显的影响。在低溶氧水平没有表达VHb表达的细胞呼吸减慢，整个能量代谢水平降低，VHb的表达使细胞在很低的溶氧水平下仍保持原有的呼吸强度，这说明VHb可能参与微氧条件下细菌呼吸链的某些步骤，使细胞处于生物氧化效率较高的状态，从而显示了生长优势。Kallio和Bailey的研究(Kallio P T，etal.Intracellular expression of Vitreoscilla hemoglobin alters E.coli energymetabolism under oxygen-limited conditions.Eur J Biochem.1994；219201-208)也持有相同的观点，在氧限条件下大肠杆菌中几种能量参数与VHb密切相关，表达VHb的细胞，其H+/O、跨膜ΔpH和ATP浓度是原大肠杆菌的1.5-2倍，这一结果与我们对呼吸强度的估算相当一致。进一步弄清楚VHb介入细胞代谢的具体方式和作用机理对研究VHb生理功能将会是十分有益的。
发酵过程是基因工程产品产业化的重要环节之一，也是一个影响因素最多，过程最为复杂的环节，其根本目标就是要降低能源和原料消耗，提高产品产率，实现过程的产业化。高密度发酵成为近十年来基因工程发酵的研究热点之一。发酵过程中有害产物的积累和溶氧的限制是高密度培养的主要障碍。流加模式(Fed-batch fermentation)是高密度发酵的常用模式，要以通过调节补料培养基的流加来控制细胞的生长，有害副产物的产出，延长细胞的指数生长期，提高细胞密度，经分批发酵(Batch fermentation)具有优势(Xu B，JahicM，Blomsten G，Enfors SO.Glucose overflow metabolism and mixed-acidfermentation in aerobic large-scale fed-batch processes with Escherichia coli.ApplMicrobiol Biotechnol 1999；51(5)564-571；33 Panda AK，Khan RH，Rao KB，Totey SM.Kinetics of inclusion body production in batch and high cell density fed-batch culture of Escherichia coli expressing ovine growth hormone.J Biotechno1.1999；75(2-3)161-72)。补料培养基的流加有许多模式由经验数据或预先制定补料、由过程参数pH、溶氧(DO)、呼吸商(RQ)等控制补料，由物料平衡计算决定、在线检测限制性基质或有害副产物浓度控制补料等(34 Riesenberg D.High-cell-density cultivation of Escherichia coli.Curr Opion Biotechnol.1991；2(3)380-384；Knorre WA，Deckwer WD，Korz D，Pohl HD，Riesenberg D，Ross A，Sanders E.Schulz V.High cell density fermentation of recombinant Escherichiacoli with computer-controlled optimal growth rate.Ann N Y Acad Sci.1991；646300-6；Macdonald H L，Neway J O.Effects of medium quality on the expression ofhuman interleukin-2 at high cell density in fermentor cultures of Escherichia coliK-12.Appl Environ Microbiol.1990；56(3)640-645；DeLisa MP，Li J，Rao G，Weigand WA，Bentley WE.Monitoring GFP-operon fusion protein expressionduring high cell density cultivation of Escherichia coli using an on-line opticalsensor.Biotechnol Bioeng.1999；65(1)54-64；Hewitt CJ，Nebe-Von Caron G，Nienow AW，McFarlane CM.Use of multi-staining flow cytometry to characterisethe physiological state of Escherichia coli W3110 in high cell density fed-batchcultures.Biotechnol Bioeng 1999；63(6)705-711)。
本发明中的补料控制采用过程参数反馈控制的模式，根据pH和溶氧来控制碳源葡萄糖和其它原料(主要为氮源)的流加，流加速率均由计算机自动控制。方程是根据经验和参考其它模型相结合的模式来设计的。由于高密度发酵控制的复杂性，过程的优化需要实践经验的不断总结和研究。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种产生基因组整合有外源基因的微生物方法，其特征在于，它包括步骤(a)提供一整合型重组质粒，该质粒含(i)温度敏感型复制子，该复制子在复制温度下复制而在抑制温度下复制受抑制；(ii)所述微生物的染色体基因同源片段A和同源片段B；(iii)待整合的外源基因；以及(iv)2种或多种抗性筛选标记基因；(b)用所述的整合型质粒转化宿主细胞，在抑制温度下筛选出能生长的共整合体；(c)在复制温度下培养步骤(b)中筛选出的共整合体，使共整合体解离；(d)筛选出在复制温度下生长且在抑制温度下生长被抑制的拆分体；(e)在抑制温度下连续培养拆分体，使重组质粒丢失，从而产生基因组整合有外源基因的微生物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(e)后还包括对微生物进行鉴定的步骤。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物是大肠杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的温度敏感型复制子包括pSC101 rep(ts)复制子，复制温度为30℃，而抑制温度为44℃。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因包括透明颤菌血红蛋白基因。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微生物染色体基因同源片段A和同源片段B选自下组同一基因的两个片段、不同的相邻基因或操纵子结构基因的两个片段。
7.一种微生物，其特征在于，在所述微生物的染色体上整合有外源的透明颤菌血红蛋白基因，而且该微生物是乙酸代谢Pta-Ack途径缺陷型。
8.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述的微生物包括大肠杆菌。
9.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，所述微生物的基因型为F-dcmompT hsdS(rB-，mB-)Δ(pta-ack)∷rrnBT1T2Δ(thrAB)∷vhb-kanR。
10.如权利要求7所述的微生物，其特征在于，它是大肠杆菌大肠杆菌G830，保藏号为CCTCC NOM99012。
全文摘要
本发明公开了一种适用于高密度发酵的微生物,在所述微生物的染色体上整合有外源的透明颤菌血红蛋白基因,而且该微生物乙酸代谢的主要途径被阻断。新的工程菌G830不仅可消除乙酸的不利积累,而且对氧的利用能力大为提高,因而更适合在高密度发酵条件下表达外源蛋白。本发明还公开了产生在基因组中整合外源基因(如透明颤菌血红蛋白基因)的新方法。
文档编号C12N1/21GK1345929SQ0012541
公开日2002年4月24日 申请日期2000年9月26日 优先权日2000年9月26日
发明者龚毅, 杨运桂, 杨胜利 申请人:中国科学院上海生物工程研究中心