专利名称：人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法
技术领域：
本发明涉及一种选择人卵巢癌细胞株SKOV3作为亲代细胞，选用临床常用抗癌药物紫杉醇或拓扑替康作为诱导剂，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立了紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX或拓扑替康耐药细胞株SKOV3/TOP的人卵巢癌耐药细胞株及其培养方法。
背景技术：
卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤之一，目前以紫杉醇与铂类联合作为卵巢癌的一线化疗方案、拓扑替康与铂类联合作为二线化疗方案广泛用于临床。然而，常遇到对这些药物耐药的问题。目前有关耐药的研究多采用浓度梯度递增法在体外诱导耐药细胞株，但这种方法与临床化疗反复、间歇用药的特点相差甚远。
发明内容
本发明的目的是利用人卵巢癌细胞株SKOV3作为亲代细胞，选用临床常用抗癌药物紫杉醇或拓扑替康作为诱导剂，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX或拓扑替康耐药细胞株SKOV3/TOP。
本发明的细胞株是用如下方法培养的1、药物选择拓扑替康(TOP)或紫杉醇(TAX)；2、药剂量根据公式[(60×D)/(5000)]×2×103[5]，其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg-1.d-1)，5000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50％，103将mg换成ug，参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TOP 1.2mg/m2，TAX175/mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TAX的终浓度为300ug/ml、TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；3、亲代细胞培养人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养；
4、卵巢癌耐药细胞株诱导取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为300ug/ml的TAX或终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击。如此反复作用，TAX共加药冲击12次，或TOP共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX、或SKOV3/TOP，所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏。
细胞株SKOV3/TAX、SKOV3/TOP保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号分别为CGMCCNo.1216，CGMCCNo.1217。
耐药性的测定以MTT法测耐药指数，绘制细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞的凋亡率及细胞周期分布；透射电镜观察细胞的超微结构的改变。
1.细胞耐药指数(RI)SKOV3/TAX细胞为10.57，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TAX耐药外，对5-氟尿嘧啶有明显的交叉耐药，SKOV3/TOP耐药指数为10.67(P＜0.01)，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。见表1，2。
表1 SKOV3/TAX细胞耐药谱药物 IC50(μg/ml) RISKOV3 SKOV3/TAXTAX 0.152±0.002 1.607±0.002 10.57**5-FU1.110±0.002 3.499±0.003 3.15*CTX 3.770±0.005 10.665±0.0022.83DDP 0.015±0.004 0.016±0.004 0.94VCR 1.750±0.002 2.980±0.003 1.7VP160.060±0.007 0.122±0.004 2.03TOP 0.090±0.003 0.112±0.004 1.24
MTX1.072±0.008 1.173±0.012 0.91**P＜0.01，*P＜0.05表2 SKOV3/TOP细胞耐药谱药物 IC50(μg/ml)RISKOV3 SKOV3/TOPTOP0.545±0.069 5.816±1.047 10.67**CPT0.169±0.048 0.669±0.152 3.97*MX 0.130±0.024 0.603±0.291 4.37*VCR3.621±1.324 11.010±4.329 3.04*VP16 0.707±0.310 0.807±0.351 1.14TAX3.030±1.54 4.950±1.973 1.63DDP1.043±0.036 1.452±0.541 1.395-FU 12.647±4.387 10.037±3.876 0.794MTX1.869±0.784 0.657±0.329 0.352**P＜0.01，*P＜0.052细胞生长曲线和群体倍增时间细胞生长曲线及细胞周期显示，两种耐药细胞的生长增殖较亲本细胞明显减慢(P＜0.01)，见图1。
3.P-170糖蛋白功能检测结果耐药细胞株SKOV3/TAX及SKOV3/TOP中的P-170糖蛋白含量明显增高(P＜0.01)，与其耐药指数相符。见表3-5及图2-4。
表3.SKOV3细胞检测结果日期23-Nov-04标志 细胞数 ％比 均数 几何均数所有 18284 100.00 1396.78 1030.10M1期 2711 14.83 109.80 99.68M2期 15577 85.19 1620.48 1546.17表4.SKOV3/TAX细胞检测结果日期23-Nov-04标志 细胞数 ％比 均数 几何均数所有 13717 100.0011.65 7.98M1期 13708 99.9311.21 7.96M2期100.07 644.16468.07表5.SKOV3/TOP细胞检测结果日期23-Nov-04标志 细胞数 ％比 均数 几何均数所有 18440 100.00 1487.90 1046.54M1期 2565 13.9197.89 81.78M2期 15878 86.11 1712.22 1579.39
图1细胞生长曲线图2SKOV3细胞P-170糖蛋白流式细胞测定图3SKOV3/TAX细胞P-170糖蛋白流式细胞测定图4SKOV3/TOP细胞P-170糖蛋白流式细胞测定具体实施方式
实施例1以紫杉醇(TAX)药物诱导SKOV3细胞，建立SKOV3/TAX耐药细胞株。药物紫杉醇(TAX)为北京四环医药科技有限公司产品。
1、用药剂量根据公式[(60×D)/(5000)]×2×103，其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg-1.d-1)，5000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50％，103将mg换成ug。参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TAX175/mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TAX的终浓度为300ug/ml、作为大剂量冲击用量；2、代细胞培养人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养；3、卵巢癌耐药细胞株诱导取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为300ug/ml的TAX作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，TAX共加药冲击12次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX，所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏，其耐药性仍然稳定。
细胞耐药指数(RI)SKOV3/TAX细胞为10.57，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TAX耐药外，对5-氟尿嘧啶有明显的交叉耐药。
实施例2以拓扑替康(TOP)药物诱导SKOV3细胞，建立SKOV3/TOP耐药细胞株。
药物拓扑替康(TOP)为贵州汉方制药有限公司产品。
1.用药剂量根据公式[(60×D)/(5000)]×2×103，其中60为平均成人体重(kg)，D临床用药剂量(mg.kg-1.d-1)，5000为平均成人血容量(ml)，2为除以血细胞比积50％，103将mg换成ug，参照卵巢癌病人临床化疗剂量，TOP 1.2mg/m2，以临床大剂量冲击疗法的用药剂量为常用剂量的3倍为标准，采用TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；2、代细胞培养人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养。
3、巢癌耐药细胞株诱导取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，TOP共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TOP。所有耐药性实验均在细胞稳定生长后2个月后进行，细胞冻存3个月后复苏，其耐药性仍然稳定。
SKOV3/TOP耐药指数为10.67(P＜0.01)，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。
权利要求
1.一种人卵巢癌耐药细胞株培养方法，其特征在于(1)药物拓扑替康(TOP)或紫杉醇(TAX)；(2)用药剂量采用TAX的终浓度为300ug/ml或TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量；(3)亲代细胞培养人卵巢上皮癌细胞株SKOV3细胞生长于含15％小牛血清的RPMI1640培养基中，置入5％CO2、37℃培养箱中培养；(4)卵巢癌耐药细胞株诱导取对数生长期细胞，0.25％的胰酶消化后计数，以5×105/ml细胞接种于培养瓶(以每瓶5ml接种)，24小时后细胞贴壁，再加入终浓度为300ug/ml的TAX或终浓度为2160ng/ml的TOP作用2小时，弃去培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗3遍，更换新鲜培养液，待细胞恢复生长再进行第二次冲击，如此反复作用，TAX共加药冲击12次或TOP共加药冲击13次，历时10个月建成人卵巢癌耐药细胞株SKOV3/TAX、或SKOV3/TOP。
2.一种人卵巢癌耐药细胞株，其特征在于它是由权利要求1所述的方法培养的SKOV3/TAX细胞株，SKOV3/TAX细胞耐药指数(RI)为10.57，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TAX耐药外，对5-氟尿嘧啶有明显的交叉耐药。
3.一种人卵巢癌耐药细胞株，其特征在于它是由权利要求1所述的方法培养的SKOV3/TO P细胞株，SKOV3/TO P细胞耐药指数(RI)为10.67，与敏感细胞相比P＜0.01，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药。
全文摘要
本发明涉及一种人卵巢癌紫杉醇耐药细胞株SKOV3/TAX或拓扑替康耐药细胞株SKOV3/TOP及其培养方法，其特征是选择人卵巢癌细胞株SKOV3作为亲代细胞，选用TAX的终浓度为300ug/ml或TOP的终浓度为2160ng/ml作为大剂量冲击用量，以反复大剂量冲击方式间歇用药，建立SKOV3/TAX细胞耐药指数(RI)为10.57，除对TAX耐药外，对5－氟尿嘧啶有明显的交叉耐药，SKOV3/TO P细胞耐药指数(RI)为10.67，除对TOP耐药外，对米托蒽醌(MX)、喜树碱(CPT)、长春新碱(VCR)有明显的交叉耐药，与敏感细胞相比P＜0.01。
文档编号C12N5/10GK1687405SQ200510064798
公开日2005年10月26日 申请日期2005年4月22日 优先权日2005年4月22日
发明者李红霞, 周友珍, 张素梅, 魏丽惠 申请人:李红霞