专利名称：一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及环境内分泌干扰物检测领域，具体涉及一种基于ERoc激活效应的环 境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒。
背景技术：
随着工业污染加剧，环境内分泌干扰物(EDCs，又称环境雌激素)对人类健康 的影响，日益引起各国政府的关注。EDCs是指干扰生物体内维持自稳及调节发育过 程中激素的产生、释放、代谢、结合、排泄、交互作用的外源性物质，对人类内分 泌、免疫系统等有干扰作用，主要有多氯联苯类、二恶英类、烷基酚类、邻苯二甲 酸酯类、农用化学品类、天然或合成的激素药物等。由于EDCs通常以痕量混合物的 形式存在，且化学性质差异很大，采用传统的萃取富集、高效液相色谱-质谱/气相 色谱(HPLC-MS/GS)方法分离出单一成分并测定含量，其分析手段复杂、操作繁琐、 设备昂贵、需要专门高级训练，并且很难达到所有痕量成分的完全解析。另一方面， 每一类EDCs中.，不是所有的化合物都具有内分泌干扰作用。例如，二恶英类化合物 有上百种，仅有一部分有内分泌干扰作用，典型的是PCDD二恶英。目前世界上仅有 20家实验室肯^寸生物来源的二恶英进行监测。此外，全世界每天都在产生4000多种 新的化合物，传统的免疫学检测或生物学标志物检测方法显得力不从心。虽然免疫 学技术检测灵敏度和通量较高，但仅能检测具备特异抗体的部分EDCs 。
实际上，评估痕量混合物的内分泌干扰生物学效应/累加毒性当量(TEQ)更有 意义。目前常用报告基因实验、细胞增殖实验等评价痕量混合物的内分泌千扰综合 效应，或用DNA阵列检测痕量EDCs的生物标记。但是，由于这些方法本身的局限， 如细胞培养的不稳定性、细胞不能精确定量等，使得这些方法通量低、周期长、系 统误差很大，准确性和灵敏度差，只能半定量，而且样品中的EDCs也可能被细胞 降解。
目前已知，雌激素受体a (ERct)是一种重要的细胞核受体与其配体雌激素 的结合具有高度专一性和亲和力，并在pmol级实现。ERa分为A/B, C， D， E/F 4个区域，见附图l，其中C区为DNA结合区(DBD)，能与雌激素受体反应元件 (estrogen response element ， ERE)特异结合；E/F区为激素结合区(HBD)， 结合激素并能使ER a发生变构及二聚化。ER a —旦与雌激素结合，就会激活变构形 成二聚体，然后与ERE结合，刺激耙基因转氣从而表现出各种生理效应。ERE的核心 序列为5' -GGTCAnnnTGACC-3' (n为任意核苷酸)。
环境雌激素(即EDCs)是以与内源雌湊戈素类似的形式与雌激素受体结合，并和 内源雌激素一样通过雌激素受体介导而产生相应的生理效应。目前基于受体配体结 合的筛选方法，既可以反映EDCs的结合量，又能反映EDCs的综合雌激素样TEQ活性， 且易于实现高通量，是最近几年EDCs高通量筛选和监测的新方向。Kim等制备了荧 光-ER的EDCs阵列玻片筛选技术，用酶标仪测定结合的荧光强度而对EDCs定量，但 因其采用波片固相，使其结合受到限制，此方法检出在nM nM水平，灵敏度和准确 性尚不理想。
综上所述，对于环境中为数众多、增长迅速的化合物中的EDCs来说，目前的 环境污染物分析技术的进展还远远不能满足监测要求，发展快速、高通量、灵敏度 高且重复性好的廉价筛选技术是一个亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目之一的是提供一种廉价、快速、高通量的基于ERa激活效应的环境 内分泌干扰物的PCR定量检测方法，本发明的另一目的是提供用于所述检测方法的 高效、灵敏、快速的检测试剂盒。
本发明利用配体-受体生物学激活效应的高效、特异性和实时荧光定量PCR扩 增的高灵敏性和定量的准输性，建立痕量环境内分泌干扰物(EDCs)累加毒性当量 (TEQ)的快速定量检测技术(即配体-ER-DNA探针复合体PCR检测，ERC--PCR)，实现 痕量EDCs TEQ的廉^N快速、高通量监测。
本发明的第一目的是通过以下的技术方案实现的即痕量环境内分泌千扰物配 体(EDCs)与雌激素受体(ERci)结合后，受体变构二聚化，识别并结合含有雌激 素反应元件(ERE)核心序列5' ~GGTCAnnnTGACC -3' (n为任意核苷酸)的DNA 双链探针，形成配体-ER-DNA探针复合物(ER-DNA probe complex, ERC)，采用 ER特异的单克隆抗体(ERMcAb)吸附并分离ERC，洗去未结合的DNA探针，然后
针对ERC中的DNA探针进行实时荧光定量PCR (FQ-PCR)定量扩增，从而评估样本 中EDCs的生物学效应。只要有100个左右的DNA分子结合二聚化ER，即可检测得 到，从而达到pmol检测水平。
因此，本发明涉及的一种基于ERct激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量 检测方法，包括以下步骤
(参见附图2)(1) 表达并纯化具有生物活性的重组人雌激素受体a (hERa):采用pSG5 载体与人ER a cDNA构建质粒pSG5-hER a ，酶切后导入杆状病毒真核表达系统(Bac—to—Bac baculovirus expression system) ， f寻至U木干状病毒表达质茅:《 hER-Bacmid，转染Sf 9细胞高效表达hER a ，分离并纯化hERa;(2) 设计DNA双链探针，其全序列中含有雌激素反应元件(ERE)核心序列 5' -GGTCAnnnTGACC-3'，其中n为任意核苷酸；(3) 制备雌激素受体a (hERct)特异的单克隆抗体(ERaMcAb):肽合成仪 合成hERa A/B区一段18个氨基酸的多肽，将其共价连接于载体钥孔戚血蓝素(keyhole limpethemocyanin， KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取脾细 胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选hER a抗原特异性杂交瘤 株，再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获 得能特异结合hERa的McAb;(4) 针对步骤(2)所述DNA双链探针，设计荧光定量PCR检测探针M(;B TaqMan 和相应引物，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，其序列为MGB-TaqMan : FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB 上游引物FP: 5， -TGGCCTGGCGTGGMGT-3， 下游引物RP: 5' -ACAMCCATCCCTTTTAGACMGTG-3，(5) 将步骤(1)所得hERa与待检样品在结合缓冲液中4r振摇孵育4h，使EDCs 与hERa结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成配体-ERa复合物；(6) 向步骤(5)复合物中加入步骤(2)所述双链DNA探针，4。C过夜，形成 配体-ERa-DNA探针复合物(ERC);(7) 向步骤(6)所得ERC溶液中加入歩骤(3)所制备的ERaMcAb，形成 ERC-McAb，用磁珠包被的二抗羊抗鼠IgG结合McAb，形成ERC-McAb-磁珠IgG复合物， 用磁力架吸附分离此复合物，洗去未结合的探针；(8) 加热步骤(7)所分离复合物，使DNA双链探针游离出来；(9) 对游离出来的DNA双链探针，用步骤(4)所MGB-TaqMan探针和引物， 进行实时荧光定量PCR定量扩增，25tU反应体系2X T叫man探针主要反应混合液12. 5 lU， MGB-Taqman探针O. 3 y 1 、弓l物FP和RP各O. 5 u 1 、 HotSter DNA聚合酶O. 4 ul、 DNA模板2iU、加去离子水至总量25ul，扩增条件95。C预变性15min， 95°C 5s、 59.5。C25s， 40个循环，与以雌二醇(E2)为标准品所作的标准曲线比对，确 定待测样品中具有类雌激素作用物质的累计当量。为实现本发明的第二目的采用的技术方案是这样的即一种环境内分泌干扰物 的PCR定量检测试剂盒，其特征在于其组成包括重组人雌激素受体a (hERa )及其特异的单克隆抗体(hERaMcAb)、双链1〕NA 探针、检测探针和引物、二抗、结合缓冲液、荧光定量PCR反应混合液、标准品； 其中 '重组人雌激素受体a (hERa)为杆状病毒表达系统所表达；特异的单克隆抗体(hERaMcAb)为鼠抗人ERa A/B区的单克隆抗体；双链DNA探针为80 110bp的能特异识另脂己体-ERci 二聚体的序歹lj，该序列含有 雌激素反应元件(ERE)核心序列5， -GGTCAnnnTGACC-3， ， n为任意核苷酸；检测探针为MGB-TaqMan探针，包括报告基团FAM、淬灭基团MGB，弓嫩为针对 此检测探针所设计弓1物，其序列为MGB-T叫Man : FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB上游引物FP: 5， -TGGCCTGGCGTGGMGT-3，下游引物RP: 5' -ACMACCATCCCTTTTAGACMGTG-3'。本技术的优点在于(1)和HPLC-MS/GS分析法相比，本技术没有鉴定复杂混 合物的困难，由于模拟类雌激素生物学过程，既可以反映EDCs的结合量，又能反 映EDCs的综合雌激素样TEQ活性；HPLC-MS/GS分析操作繁琐、技术要求高、成本 昂贵，目前世界上仅20多家实验室旨^寸生物来源的类雌激素物质二恶英进行监测， 且单样本检测费用在1000-2000美元左右，本技术费用低，单样本检测费用在 200-300人民币左右。(2)和报告基因、细胞增殖实验相比，前者需要约2 3周 时间且只能半定量，本技术2-3天内能出具结果、定量误差较小；(3)和现有受 体配体结合检测技术相比，本技术通过配体受体激活效应以及PCR将循环放大，灵 敏度高，达到甚至超过HPLC-MS/GS分析化学方法，检测达到pM级。(4)本发明 试剂盒操作简便、快捷，技术平台要求不高，普通实验室即可开展，司广泛用于食 品、环境检测等领域。
附图l为雌激素受体a (ERcO结构示意图； 附图2为本发明检测原理示意图；附图3为本发明中重组hERci质粒构建及蛋白表达示意图；附图4 为重组hER a与野生型hER a Western blotting图; 附图5显示了各种类雌激素与重组hER a结合能力。
具体实施方式
实施l重组人ERa (hERa)活性蛋白的获取，示意图见附图3:1. 杆状病毒转移载体的构建用^2/zH I和fcdU酶切pSG5、 hERacDNA，将 统性化载体大片段和1875bp的hER a DNA片段连接，获得保存hER a DNA的pSG5-hER a 质粒。泡/tH I和fcoR I酶切pSG5-hER a质粒、pFastBacl质粒，并将hER a与载体 大片段连接，获得hER a杆状病毒转移载体pFast-hER a 。酶切反应在37。C进行，连 接所用酶为T4 DNA连接酶。2. 杆状病毒表达载体的构建及hERa的表达将pFast-hERa转化含有杆状 病毒穿梭载体(杆粒，Bacmid)的大肠杆飾H10BAC感受态细胞，使pFast hERa白勺 hERaDNA与Bacmid发生位点特异性转座，构建重组hER a -Bacmid。转化Sf 9细胞， 经蓝白斑筛选,挑选白色菌落，碱法提取Bacmid DNA。经l %琼脂糖凝胶电泳鉴定， 将构建成功的hERa-Bacmid，转染Sf 9细胞高效表达重组hER a ，分离纯化此hERa 。步骤l、 2中涉及的质粒及感受态细胞等均购自美国Irwitrogen公司的杆状病毒 真核表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)。3. 重组hERa的分离、纯化2 mLNi-NTA琼脂糖相用洗涤缓冲液(2(Mf Tris HCL，pH7. 5， 300mMNaCl，2(F。甘油，0, lmg/mL木炭处理的BSA，和10mM咪唑)洗涤， 再在含100mL的重组受体溶液的柱子内孵育，16小时后，琼脂糖相用洗涤缓冲液洗 涤，然后受体用5mL抽提缓冲液(20mM Tris HCL,pH7. 5， 300mM NaCl， 2C)o/。甘油，0. lmg/mL木炭处理的BSA，和lOOmM咪唑)洗提。通过SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色 后Western Blotting鉴定重组hER a ，结果见附图4。富含重组hER a溶液组分的 洗提液冰冻干燥得hER a冻干粉。实施2设计能与hER a特异性结合的双链DNA探针根据雌激素反应元件(ERE)，设计89bp的短片断DNA探针，其全序列为5，- AMGGGATGGTTTGTGTG-3'，含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5' -GGTCAnnnTGACC-3' (n为任意核苷酸)，核心序列周围的核苷酸可作调整。实施3 hERa单克隆抗体的制备 肽合成仪合成hER a A/B区一段18个氨基酸的多肽:Ala-Phe-Tyr- Arg-Pro-Asn-Ser-Asp-Asn-Arg-Arg-Gln-Gly-Gly-Arg-Glu-Arg-Leu，将其共价连接于载体钥孔戚血 蓝素(keyhole limpet hemocyanin， KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取 脾细胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选抗原特异性杂交瘤株， 再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获得能 特异结合hERa的McAb。实施4荧光定量PCR检测探针MGB-TaqMan和相应弓|物。FAM为报告基团，MGB 为淬灭基团，其序列为MGB-TaqMan : FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB 上游引物FP: 5， -TGGCCTGGCGTGGMGT-3， 下游引物RP: 5， -ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3，实施5 痕量EDCs与hER a的结合重组hER a与样品中EDCs的结合在下列体系和条件进行结合缓冲液为 l%Tween-20， 20 mM Tris HCl， 5 mM 二硫赤藓糖醇，2 mg/mL BSA ， 10pM ATP， pH 7.5。 50(^L体系，4'C孵育数小时。实施6痕量EDCs与hER a的亲和力结合试验将雌激素及具有类雌激素功能的物质如E1、 E2、 E3、双酚A (BPA)等代表性 参考分子作为竞争剂与卩H] -E2进行竞争结合实验:0. 75pmol重组hER a 、 2nM[:iH] -E2 ， 与系列浓度的不同竞争剂(El、 E2、 E3、 BPA)在实施5的条件下分别反应，结合 和游离的配体用分离液(结合缓冲液中加2%木炭和0.2%右旋糖苷)分离，混合物 4'C离心。用液体闪烁器计数上清[3H]方妇t活性。竞争剂抑制[3H]-E2达50°/。时的浓度 为IC， E2IC5。值大约是5.9 nM，与野生型hERa值接近。结合能力顺序为E》E:,y E,〉 BPA〉。见附图5 。实施7 PCR扩增配体-ERa-DNA探针复合物(ERC)经加热,使得双链DNA探针解离，进行实时荧 光定量多聚S敏连反应(PCR)定量扩增。MGB-Taqman探针和引物由上海基康生物技 术有限公司合成，荧光素设定报告基团FAM，淬灭基团MGB。 25 反应体系2X Taqman探针主要反应混合液12. 5 y 1， MGB-Taq腿n探针O. 3 tx 1 、弓l物FP和RP各O. 5 u 1、 HotStarDNA聚合酶0.4ul、 DNA模板2yl、加去离子水至总量25u 1 。扩增条件 95'C预变性15min， 95。C变性5s、 59.5"C退火延伸25s， 40个循环，荧光检测，与雌 二醇(E2)系列标准品比较观啶样品模板数。系列标准品的浓度可分为1X10'"、 1X10—9、 1X10—8、 1X10—7、 1X101。实施8观察检测体系对痕量EDCs的检测能力(准确性、灵敏度) 配制不同浓度的EDC标准品，领!l定检测体系的灵敏度(检测下限)和准确性 (回收率)。以传统报告基因实验和GC/HPLC/MS分析结果为对照方法，进行比较。本技术可在3天内出具定量结果，灵敏度可达pM级，以传统方法相比，本方法具有快速、高效、高通量以及准确性、灵敏度高的优点。实施9检测体系的试剂盒化-一种快速检测环境内分泌干扰物(EDCs)的试剂盒，它包括重组人雌激素受体 a (hERa )及其特异的单克隆抗体(ERaMcAb)、双链DNA探针、检测探针湘引物。 还包括二抗、结合缓冲液、荧光定量PCR反应混合液、标准品。其中重组人雌激素受体a (hERa)为冻干粉末。双链DNA探针为80 110bp 的短片断序列，实施例中的序列全长89bp为5， - GTCTGGCCTGGCGTGGAAGTTTGG TCTGGCTCACTGCAGA GGTCAaggTGACCCACGTA GTCACTTGTCTAAMGGGATGGTTTGTGTG-3，， 含有雌激素反应元件(ERE)，其核心序列为5， -GGTCAnnnTGACC-3， (n为任意核 苷酸)。检测探针为MGB-TaqMan探针，包括报告基团FAM、淬灭基团MGB，弓嫩为 针对此检测探针所设计引物，其序列为MGB-TaqMan : FAM-TGGTCTGGCTCA CTGC -MGB， 上游引物FP: 5， -TGGCCTGGCGTGGMGT-3，， 下游引物RP: 5' ACMACCA TCCC TTTTAGACMGTG -3， 。 二抗为羊抗兔IgG。结合缓冲液为l%Tween_20， 20itM Tris HC1， 5mM二硫赤藓糖醇，2mg/mLBSA， 10nM ATP (pH7.5)混合液。荧光定量PCR 反应混合液主要成分为HotStar DNA聚合酶，clNTPs以及Mg2—。标准品为系列浓度 (10 pM 1 nM)的雌二醇(E2)。实施IO检测流程环境样品加入含游离hER a 、 DNA探针的结合缓冲体系，ERC复合物与ER a McAb 结合，用二抗包被的免疫磁珠吸附并分离，加热变性使探针游离，用特异性 MGB-TaqMan探针和实时荧光定量PCR法进行检测。根据标准曲线得到环境样品中 EDCs的相对雌激素效应TEQ (相对于E2)量。如果结合时加入固定量的E2，进行 竞争结合抑制实验，则可反映EDCs的抗雌激素效应。
与本发明有关的核苷酸序列〈110〉中国人民解放军第三军医大学第一附属医院〈120〉 一种基于ER a激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒 〈160〉 4〈170〉 ABI PRIMER EXPRESS 2. 0 〈210〉 1 〈211〉 13 〈212〉腿〈213〉人禾中(Homo sapiens) 〈220〉<221〉 misc—feature 〈222〉 (6， 7， 8) <223> n 二a或g或c或t 棚〉1ggtca皿ntg acc〈210〉 2 〈211〉 16 〈212> DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈221〉 MGB-TaqMan〈223〉根据被检测序列而设计，两端分别结合有报告基团FM、淬灭基团MGB，作 糊〉2tggtctggct cactgc〈210〉 3 〈211〉 17 〈212〉腿 〈213>人工序列 <220>
〈221〉 FP〈223〉根据检测探针而设计，作为上游引物FP〈400〉 3tggcctggcg tggaagt〈210〉 4〈211〉 25〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220〉〈223〉根据检测探针而设计，作为下游引物RP< 4cacttgtcta aaagggatgg tttgt
权利要求
1一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法，其特征在于包括以下步骤(1)表达并纯化具有生物活性的重组人雌激素受体α(hERα)采用pSG5载体与人ERαcDNA构建质粒pSG5-hERα，酶切后导入杆状病毒真核表达系统(Bac-to-Bac baculovirus expression system)，得到杆状病毒表达质粒hER-Bacmid，转染Sf 9细胞高效表达hERα，分离并纯化hERα；(2)设计DNA双链探针，其全序列中含有雌激素反应元件(ERE)核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’，其中n为任意核苷酸；(3)制备雌激素受体α(hERα)特异的单克隆抗体(ERαMcAb)肽合成仪合成hERαA/B区一段18个氨基酸的多肽，将其共价连接于载体钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin，KLH)上，与弗氏佐剂一起免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与小鼠B细胞瘤株Sp2/0杂交融合形成杂交瘤株，筛选hERα抗原特异性杂交瘤株，再克隆，挑取单克隆培养，取培养液采用饱和硫酸氨分级沉淀法分离纯化，获得能特异结合hERα的McAb；(4)针对步骤(2)所述DNA双链探针，设计荧光定量PCR检测探针MGB-TaqMan和相应引物，FAM为报告基团，MGB为淬灭基团，其序列为MGB-TaqManFAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB上游引物FP5’-TGGCCTGGCGTGGAAGT-3’下游引物RP5’-ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3’(5)将步骤(1)所得hERα与待检样品在结合缓冲液中4℃振摇孵育4h，使EDCs与hERα结合，受体发生变构，暴露受体DNA结合结构域，形成配体-ERα复合物；(6)向步骤(5)复合物中加入步骤(2)所述双链DNA探针，4℃过夜，形成配体-ERα-DNA探针复合物(ERC)；(7)向步骤(6)所得ERC溶液中加入步骤(3)所制备的ERαMcAb，形成ERC-McAb，用磁珠包被的二抗羊抗鼠IgG结合McAb，形成ERC-McAb-磁珠IgG复合物，用磁力架吸附分离此复合物，洗去未结合的探针；(8)加热步骤(7)所分离复合物，使DNA双链探针游离出来；(9)对游离出来的DNA双链探针，用步骤(4)所述MGB-TaqMan探针和引物，进行实时荧光定量PCR定量扩增，25μl反应体系2X Taqman探针主要反应混合液12.5μl，MGB-Taqman探针0.3μl、引物FP和RP各0.5μl、HotStar DNA聚合酶0.4μl、DNA模板2μl、加去离子水至总量25μl，扩增条件95℃预变性15min，95℃5s、59.5℃25s，40个循环，与以雌二醇(E2)为标准品所作的标准曲线比对，确定待测样品中具有类雌激素作用物质的累计当量。
2、根据权利要求l所述的一种基于ERoc激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定 量检测方法，其特征在于步骤(5)中的结合缓沖液为l订ween-20、 20mMTrisHCl, 5 mM 二硫赤藓糖醇、2mg/mL胎牛血清(BSA) , 10nM ATP构成的混合液。
3 —种环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征在于其组成包括 重組人雌激素受体oc (hERa )及其特异的单克隆抗体(hERaMcAb)、双《卽NA探针、检测探针和引物、二抗、结合緩沖液、荧光定量PCR反应混合液、标准品；其中重纟且人辨i激素受体cc (hERa )为杆状病毒表达系统所表达；特异的单克隆抗体(hERaMcAb)为鼠抗^AERa A/B区的单克隆抗体；双《幼NA探针为80 ~ 11 Obp的能特异识别配体-ER a 二聚体的序列，该序列含有 雌激素^^应元件(ERE)核心序列5， -GGTCAnnnTGACC-3， ， n为任意核苷酸；检测探针为MGB-TaqMan4笨针，包括报告基团FAM、淬M团MGB，引物为针对 ith^测探针所设计引物，其序列为MGB-TaqMan : FAM-TGGTCTGGCTCACTGC-MGB上游引物FP: 5' -TGGCCTGGCGTGGAAGT-3，下游引物RP: 5' -ACAAACCATCCCTTTTAGACAAGTG-3，。
4、 根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征是: 重纽^v对彰敫素受体a (hERa)为冻干4分末。
5、 根据权利要求3所述的环境内分泌干护b4勿的PCR定量检测试剂盒，其特征是: 所述结合緩冲液为l"/。Tween-20， 20mM Tris HC1， 5mMJ^危赤藓糖醇，2mg/mLBSA， 華ATP (pH 7. 5)混合液。
6、 根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征是: 所述焚光定量PCR^I混合^i要成分为HotStar DNA聚合酶，dNTPs和Mg"。
7、 根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征 是所述标准品为系列浓度的#^醇(E2)。
8、 根据权利要求3所述的环境内分泌干扰物的PCR定量检测试剂盒，其特征 在于所述二抗为石溆朱包被的羊抗鼠IgG。
全文摘要
本发明涉及一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法。方法包括将痕量环境内分泌干扰物与雌激素受体结合后，受体变构二聚化，识别并结合含有雌激素反应元件核心序列5’-GGTCAnnnTGACC-3’的DNA双链探针，形成配体-ER-DNA探针复合物，并采用单克隆抗体对其吸附并分离，然后进行实时荧光定量PCR定量扩增，从而评估样本中EDCs的生物学效应。本发明方法操作简便、快捷，灵敏度高，达到甚至超过HPLC-MS/GS分析化学方法。可广泛用于食品、环境检测等领域。本发明还涉及所述方法所采用的试剂盒，使用操作简便、快捷、灵敏，检测范围100pM～1nM。
文档编号C12Q1/68GK101126706SQ20071009277
公开日2008年2月20日 申请日期2007年9月27日 优先权日2007年9月27日
发明者王宇明, 容 章, 谭文婷, 邓国宏, 健 陈 申请人:中国人民解放军第三军医大学第一附属医院