表达具有免疫激活功能的发夹rna的dna疫苗载体及其用途的制作方法

专利名称：：表达具有免疫激活功能的发夹rna的dna疫苗载体及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因免疫领域。具体而言，本发明涉及用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体、具有增强的免疫原性的DNA疫苗及其制备方法。
背景技术：
：DNA疫苗又称基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA。该类疫苗通过把抗原基因导入体内表达来诱导抗原特异性免疫反应，从而达到预防或治疗疾病的目的，因此也被称为基因免疫。DNA疫苗既可以诱导抗原特异的细胞免疫反应，又可以诱导抗原特异的体液免疫反应，具有安全、模拟天然抗原呈递过程、构建周期短、生产简单、成本低、载体本身无免疫原性、储存简单、无需冷链等诸多优点。作为一种新的疫苗形式，DNA疫苗的前景已经逐步得到肯定，不但在动物模型中表现出非常好的潜力(HaigwoodNL，Immunollett，1999，66(1-3):183-188;ShiverJM，JPharmSci.1996，85(16):1317-1324)，而且在临床试验中表现出很好的安全性，受试者对DNA疫苗的耐受性也非常好。目前DNA疫苗面临的主要问题是免疫原性较弱。多年来，疫苗学家一直在尝试不同的策略，期望能够提高DNA疫苗的免疫效果，并为此进行了许多努力和尝试。DNA疫苗诱导免疫反应需要抗原呈递细胞获取足够的抗原并将其有效呈递，在这一过程中，协同刺激信号、炎症信号和细胞因子的产生是诱导特异性免疫反应所必需的。研究表明，来源于病毒的一些特征能够提供这类信号。很多病毒(尤其是RNA病毒)可以通过转录产生重叠的RNA或是在RNA复制过程中产生双链RNA中间体，而这些dsRNA分子可以作为一种病原相关分子特征(pathogen-associatedmolecularpatterns,PAMP)被免疫细胞内的Toll样受体(Toll-likeReceptor,TLR)3所识别(MatsumotoM，MicrobiolImmunol，2004，48(3):147-154)，通过胞内信号传导通路，促进细胞因子的合成与释放，引发炎症反应，并能促进DC的成熟从而激活获得性免疫应答。另外，dsRNA分子还可以在胞内激活依赖于双链RNA的蛋白激酶PKR途径和2'-5'-寡聚腺苷酸合成酶/RNaseL途径(BarberGN，CellDeathDiffer,2001，8(2):113-126)，通过诱导细胞凋亡以交叉提呈(Cross-presentation)的方式激活特异性细胞免疫应答。因此如何将这种来源于病毒的特征应用于DNA疫苗载体中以激活更广泛的免疫调节机制成为提高DNA疫苗免疫原性的关键之一。
发明内容在一个方面，本发明提供一种表达载体，该表达载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA(hairpinRNA)的DNA序列。在另一方面，本发明还提供一种重组质粒，该重组质粒包含一种表达载体和编码抗原的外源基因，其中所述载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA的DNA序列。在另一方面，本发明还提供一种宿主细胞，该宿主细胞包含如上所述的本发明的表达载体或者本发明的重组质粒。在另一方面，本发明提供一种具有增强的免疫原性的DNA疫苗，其包含如上所述的本发明的重组质粒。在另一方面，本发明提供一种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含将编码抗原的外源基因克隆到本发明的表达载体中以构建DNA疫苗。此外，本发明还涉及本发明的表达载体在制备具有增强的免疫原性的DNA疫苗中的应用。图1为载体pDRVI3.1(A)、pDS40(B)结构示意图。Pcmv表示巨细胞病毒(CMV)启动子，BGHpA表示牛生长激素(BGH)polyA信号，Amp表示氨苄青霉素抗性基因，Ori表示复制起始区，MCS表示供外源基因插入的多克隆位点，DS40表示一段具有反向互补重复的片段，可以通过转录形成发夹RNA分子。图2为pDRVI3.1-env，pDS40-env，pDRVI3.1-nef和pDS40隱nef结构示意图。载体元件说明同图1。图3为PCR扩增BGHpA片段及CMV启动子片段电泳图，1为PCR扩增产物BGHpA片段，2为PCR扩增产物CMV启动子片段，M为DNA分子量标准DL2000。图4为PCR扩增BGHpA-CMV启动子联合片段电泳图，1为PCR扩增产物BGHpA-CMV启动子联合片段，M为DNA分子量标准DL2000。图5为pDRVI3.1的酶切鉴定图，1为pDRVI3.0的尸vmII酶切产物。M为DNA分子量标准lkbDNA梯带(ladder);图6为PCR扩增荧光素酶(Luciferase)基因电泳图，1为PCR扩增产物荧光素酶基因，M为DNA分子量标准DL15000。图7为PCR扩增"e/基因电泳图，1为PCR扩增产物"e/基因，M为DNA分子量标准DL2000。图8为pDRVI3.1-luc和pDS40-luc的iVcoI酶切鉴定图，1为pDRVI3.0-luc的A^I酶切产物，2为pDS40-luc的A^coI酶切产物，M泳道为DNA分子量标准lkbDNA梯带。图9为pDRVI3.1-env禾QpDS40-env的TVcoI酶切鉴定图，1为pDRVI3.0-env的TVcoI酶切产物，2为pDS40-env的TVcoI酶切产物，M泳道为DNA分子量标准lkbDNA梯带。图10为pDRVI3.1-nef和pDS40-nef的iVcoI酶切鉴定图，1为pDRVI3.0-nef的iVcoI酶切产物，2为pDS40-nef的iVcol酶切产物，M泳道为DNA分子量标准lkbDNA梯带。图11为PCR扩增DS40片段电泳图，l为PCR扩增产物DS40片段，M为DNA分子量标准DL2000。图12为DNA质粒体外瞬时转染Hela细胞48小时后，AnnexinV-FITC染色进行流式细胞仪分析(细胞凋亡)结果。A为未转染质粒的Hda细胞，B为pDRVI3.1-luc转染的Hela细胞，C为pDS40-luc转染的Hela细胞。图13为荧光素酶表达水平检测结果。A图为不同DNA质粒体外瞬时转染Hda细胞48小时后检测到的荧光素酶表达的情况。B图为不同DNA质粒肌肉注射于小鼠72小时后胫骨前肌中检测到的荧光素酶表达的情况。图14为ELISPOT法检测HIV-1CN54Env抗原或Nef抗原特异性细胞免疫的结果。图15为ELISA法检测HIV-1CN54Env抗原或Nef抗原特异性结合抗体滴度的结果。图16为DS40片段序列(SEQIDNO:ll)及转录后形成的发夹结构示意图。具体实施例方式本发明提供了一种表达载体，其包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA(hairpinRNA)的DNA序列。术语"可操纵地连接"在本发明中是指两种核苷酸序列是物理上或功能上相关联的，例如一个启动子区域与一个核苷酸序列以这种方式连接，由此核苷酸序列的转录由该启动子区域控制和调节。术语"具有免疫激活功能"在本发明中是指物质能够激活免疫系统或使免疫系统活性提高的功能，例如，与常规的DNA疫苗相比较，本发明的载体所表达的发夹RNA能够引发免疫系统对DNA疫苗所产生的抗原产生更强的免疫应答。本发明的发夹RNA可用作分子佐剂，用于DNA疫苗，以增强DNA疫苗的免疫原性。例如，可在现有的DNA疫苗载体上插入发夹RNA表达盒，经转染后可在抗原表达细胞中产生发夹RNA分子，由此诱导广泛的免疫激活机制。本发明还提供一种重组质粒，其包含本发明的表达载体和编码抗原的外源基因。本发明的重组质粒中的"外源基因"包括但不限于编码微生物例如病毒或者细菌的抗原性蛋白质或者多肽的基因、以及编码肿瘤抗原的基因。例如，所述外源基因是HIV-1CN54的e"v基因或"e/基因。优选地，本发明的重组质粒中的外源基因是来自保藏号为CGMCCNo.2113的HIV-1CN54"e/基因或来自于保藏号为CGMCCNo.2112的HIV-1CN54em;基因。在具体实施方式中，本发明的重组质粒是pDS40-env和pDS40-nef重组质粒。本发明还提供了一种宿主细胞，其包含本发明的表达载体或者重组质粒。优选地，所述宿主细胞是大肠杆菌，例如ToplO。本发明还提供了一种具有增强的免疫原性的DNA疫苗，其包含本发明的重组质粒，其中在现有的DNA疫苗载体上插入了发夹RNA表达盒。此类DNA疫苗经接种于动物后可在靶细胞中产生发夹RNA分子并表达DNA疫苗所编码的抗原，由此通过发夹RNA分子诱导广泛的免疫激活机制而增强动物体内针对所述抗原而产生的免疫应答。因此，本发明同时提供了一种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含将编码抗原的外源基因克隆到本发明的表达载体中以构建DNA疫苗。此外，本发明还涉及本发明的表达载体在制备具有增强的免疫原性的DNA疫苗中的应用。以下将结合实施例对本发明进行详细的描述，但本领域的技术人员应理解，下述实施例的意图是解释本发明，而不应以任何形式理解为意图限制本发明的范围。本发明所使用的实验材料质粒pcDNA3.1为Irwitrogen公司产品；携带荧光素酶荧光素酶基因的质粒pGL2-Promoter为Promega公司产品；携带遗传密码优化的"e/基因的大肠杆菌(Eyc/^n'c/z/aco//)ToplO/pDS-nef于2007年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2113;携带遗传密码优化的e"v基因的大肠杆菌(&c/2m'c/n'aco//)ToplO/pDRVI3.1-env于2007年7月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCCNo.2112;PyrobestDNAPolymerase高可信度扩增酶为Takara公司产品；碱性磷酸酶、T4DNA连接酶为NewEnglandBiolabs公司产品；各种限制性内切酶均为Takara公司或NewEnglandBiolabs公司产品。DNA分子量Marker为Takara公司或北京鼎国生物技术公司产品；琼脂糖(Agarose)为GIBCOBRL公司产品。酵母粉、胰蛋白胨为Oxoid公司产品；Tris碱、X-gal、高分子量标准蛋白为Promega公司产品；其余生化试剂均为国产分析纯试剂；质粒小量提取试剂盒E.Z.N.A.PlasmidMiniprepKitI质粒、凝胶回收试剂盒E.Z.N.A.GelExtractionKit、纯化试剂盒E.Z.N.ACycle-PureKit为Omega公司产品，制备无内毒素的质粒DNA的EndofreePlasmidGigaKit为Qiagen公司产品；Lipofectamine2000质粒转染试剂盒为Invitrogen公司产品；MouseIFN-YELISPOT检测试剂盒为U-CyTech公司产品。大肠杆菌Topl0贝勾自Invitrogen公司；pGEM-T-easyVectorSystemI购自Invitrogen公司；HeLa细胞株(ATCCCat.No.CCL-2)由中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室保存，细胞培养于含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺、ly。青霉素/链霉素的DMEM培养液中37i:、5%(]02培养，培养液均由中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所配液室提供。培养胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。辣根过氧化物酶HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中山公司；来源于BVC重组亚型HIV-1CN54毒株的erw和nrf的合成肽库分别用于Env和Nef抗原特异的IFN-y分析，由美国国立卫生研究院艾滋病研究参比试剂项目(NIHAIDSResearch&ReferenceReagentProgram)馈赠；ELISA检测所用HIV-1env抗原和ne纤亢原由性病艾滋病预防控制中心病毒免疫室在大肠杆菌中表达并纯化；凋亡检测试剂AnnexinV-FITC为Pharmingen公司产品；Laborzentriftigen台式冷冻离心机为Sigma公司产品，BeckmanJ2-MC高速冷冻离心机为BeckmanCoulter公司产品；GeneAmpPCRSystem9700PCR仪为PE公司产品；9052型电热恒温培养箱为上海医用恒温设备厂产品；HPS280恒温生化培养箱HZQX100振荡培养箱为哈尔滨东联电子技术有限公司产品；JY92II型超声波破碎仪为宁波新技术公司产品；二氧化碳培养箱为SANYO公司产品；ReporterTM微孔板荧光发光计为TurnerDesigns公司产品；ELISA读板机为DENLEY公司产品；ELISPOT读板仪为BIOSIS公司产品，实验动物为6-8周龄BALB/cH-2d雌性小鼠体重18-25克购自中国医学科学院动物繁殖中心，清洁级饲养。实施例l:DNA疫苗载体pDRVI3.1的构建为了使DNA疫苗质粒能够在细胞内产生发夹RNA分子以起到增强免疫原性的效果，我们首先构建了一携带有两套启动子和polyA信号等基因表达调控元件的DNA疫苗载体pDRVI3.1，在该载体中，一套调控元件用于表达外源目的蛋白，另一套调控元件用于转录产生具有免疫佐剂效应的发夹RNA分子。(1)PCR扩增获得BGHpA片段及CMV启动子片段引物设计引物名称_引物序列_BGHpA陽up5'-gCTCTAgATgCTgTgCCTTCTAgTTgCCAg-3'(SEQIDNO:1)BGHpA-dn5'-CTATgAACTAATgACCCCgTAATTAggTTTggTTTggTgggCTgATg-3'(SEQIDNO:2)Pcmv-up5'-ATTACggggTCATTAgTTCATAg-3'(SEQIDNO:3)Pcmv-dn5'陽CgggATCCTCgggCCCTCTgACggTTCACTAAACgAg-3'(SEQIDNO:4)反应体系无菌ddH2037.5jil，10xPCR缓冲液(含MgCl2)5|il，2.5mMdNTP4pl，引物BGHpA-up、BGHpA-dn(50iiM)各lpl(或引物Pcmv-up、Pcmv-dn各lpl)，质粒pcDNA3.1模板(50ng/nl)l|il，PyrobestDNA聚合酶0.5^1，混匀后95'C变性3min，按下列循环条件进行基因扩增95°C变性30sec，55。C退火30sec，72。C延伸lmin，共30个循环；72°。延伸8min。结果获得了特异的扩增产物BGHpA片段及CMV启动子片段(图3)。(2)PCR扩增获得BGHpA-CMV启动子联合片段借助BGHpA片段下游引物BGHpA-dn中的CTATgAACTAATgACCCCgTAAT序列与CMV启动子片段上游引物Pcmv-up中的ATTACggggTCATTAgTTCATAg序列为反向互补序列，再通过PCR的方法将CMV启动子片段置于BGHpA序列的下游。反应体系无菌ddH2075nl，10xPCR缓冲液(含MgCl2)lOpl，2.5mMdNTP8|il，引物BGHpA-up、Pcmv-dn(50nM)各2|il，将扩增出的BGHpA片段和CMV启动子片段混合作为模板共2pl，PyrobestDNA聚合酶1^1，混匀后95。C变性3min，按下列循环条件进行基因扩增95。C变性30sec，68。C退火及延伸2min，共35个循环;72。C延伸10min。结果获得了特异的扩增产物BGHpA-CMV启动子联合片段(图4)。(3)DNA疫苗载体pDRVI3.1的构建将PCR扩增出来的BGHpA-CMV启动子联合片段切胶回收，^kzl和双酶切后与相同酶切的DNA质粒载体pcDNA3.1进行连接，转化ToplO感受态，以J^"I和^al双酶切筛选出阳性克隆，重组质粒命名为pDouble。以尸wII酶切载体pDouble，胶回收大片段的载体，直接自身连接后转化ToplO感受态，以酶切后筛选阳性克隆，重组质粒命名为pDRVI3.1。酶切反应体系(制备)10x缓冲液5|il内切酶各1^1质粒或片段15)^1ddH20补足至50)il。酶切反应体系(鉴定)10x缓冲液2|il内切酶各IN质粒5^1ddH20补足至20pl。结果DNA疫苗载体pDRVI3.1构建正确(图5)。实施例2:重组质粒pDRVI3.1-luc、pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef的构建G)PCR扩增获得荧光素酶基因引物设计引物名称_引物序列_Luc-F5，-Cggg^rCCATggAAgACgCCAAAAACAT隱3，(SEQIDNO:5)Luc-R5，-Cggg^rCCTCACACggCgATCTTTCCgC-3，(SEQIDNO:6)反应体系无菌ddH2037.5|il，10xPCR缓冲液(含MgCl2)5nl，2.5mMdNTP4^1，引物Luc-F、Luc-R(50pM)各lpl，质粒pGL2-Promoter模板(50ng/nl)lnl，PyrobestDNA聚合酶0.5pl，混匀后在GeneAmp2400PCR扩增仪中95i:变性5min，按下列循环条件进行基因合成95°C变性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸2min，共30个循环；72。C延伸10min。结果获得了特异的扩增产物荧光素酶基因片段(图6)。(2)PCR扩增获得w/基因引物设计引物名称引物序列Nef-up5，-CAg"K4rCACCATeATCgAggAgCTgATCTACAgC-3，(SEOIDNO:7、Nef-dn5，-CA一7^rcrCZ4a4TCAgCCgCCCTTCTCCTTCAsgAAg-3，(SEOIDNO:8)反应体系无菌ddH2075|il，10xPCR缓冲液(含MgCl2)10pl，2.5mMdNTP8pl，引物Nef-up、Nef-dn(50pM)各2pl，质粒pCRScript-gpnef模板(50ng/^1)2^1，PyrobestDNA聚合酶1^1，混匀后95°。变性5min，按下列循环条件进行基因扩增95"C变性30sec，60°C退火30sec，72。C延伸2min，共30个循环；72。C延伸10min。结果获得了特异的扩增产物^/基因片段(图7)。(3)重组质粒pDRVI3.1-luc，pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef的构建将PCR扩增出来的荧光素酶基因片段以S"mHI单酶切，同样用B"mHI单酶切DNA质粒载体pDRVI3.1后用碱性磷酸酶CIP进行去磷酸化，将荧光素酶基因片段与去磷酸化后的线性化载体pDRVI3.1进行连接，连接产物转化T叩10感受态，以A^I单酶切筛选出正向的重组子，重组质粒命名为pDRVI3.1-luc。e"v基因片段来源于HIV-1DNA疫苗质粒pCRScript-GP140，以和￡coRV双酶切载体pGP140，切胶回收ew基因片段并用T4DNA聚合酶进行补平，以EcoRV单酶切载体pDRVI3.1并去磷酸化，将两者连接后转化ToplO感受态，以A^I单酶切筛选出正向的重组子，重组质粒命名为pDRVI3.1-env。将PCR扩增出来的we/基因片段以EcoRV和A^al双酶切，并与相同酶切的DNA质粒载体pDRVI3.1进行连接，连接产物转化ToplO感受态，以A^oI单酶切筛选出正向的重组子，重组质粒命名为pDRVI3.1-nef。酶切反应体系(制备)10x缓冲液5pl内切酶各1^1质粒或片段15plddH20补足至50pl。酶切反应体系(鉴定)10x缓冲液2^1内切酶各lpl质粒5^1ddH20补足至20pl。去磷酸化反应体系10x缓冲液5^1碱性磷酸酶CIP1^1线性化的质粒3(^1ddH20补足至50pl。DNA末端平端化反应体系10x缓冲液T4DNA聚合酶5(^13(^1dNTP酶切后带粘性末端的质粒ddH20补足至50[xl。结果重组质粒pDRVI3.1-luc，pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef的构建正确。pDRVI3.1-luc酶切鉴定结果见图8，pDRVI3.1-erw酶切鉴定结果见图9，pDRVI3.1-nef酶切鉴定结果见图10。携带基因的质粒Top10/pDRVI3.1-env保藏号为CGMCCNo.2112。实施例3:重组质粒pDS40-luc，pDS40-env及pDS40-nef的构建(1)PCR扩增获得含40bp回文结构的序列(DS40序列)引物设计引物名称_引物序列_Ds40-up5，-TTgggCCCgCCgggAgATAgTgATgAAgTACATCCATTATAAgCTgTCgTTCAAgAgACgACAg-3，(SEQIDNO:9)Ds40-dn5,-TTggg￡￡￡CCgggAgATAgTgATgAAgTACATCCATTATAAgCTgTCgTCT反应体系无菌ddH2038.5^1，10xPCR缓冲液(含MgCl2)5pl，2.5mMdNTP4(il，引物Ds40-up、Ds40-dn(50nM)互为模板各l|il，PyrobestDNA聚合酶0.5^1，混匀后95'C变性3min，按下列循环条件进行基因扩增95。C变性30sec，60。C退火30sec，72。C延伸15sec，共5个循环；72°C延伸5min。结果获得了特异的扩增产物DS40片段(图11)。CTTgAACgACAg-3，(SEQIDNO:10)(2)重组质粒pDS40-luc，pDS40-env及pDS40-nef的构建将PCR扩增出来的DS40片段以单酶切，同样用j;^1分别单酶切DNA质粒pDRVI3.1-luc，pDRVI3.1-env及pDRVI3.1-nef，用碱性磷酸酶CIP进行去磷酸化，将DS40片段与去磷酸化后的线性化载体进行连接，连接产物转化ToplO感受态，以A^oI单酶切筛选出正确的重组子，重组质粒分别命名为pDS40-luc，pDS40-env及pDS40-nef。结果重组质粒pDS40画luc，pDS40-env及pDS40隱nef构建正确。pDS40-luc酶切鉴定结果见图8，pDS40-env酶切鉴定结果见图9，pDS40-nef酶切鉴定结果见图10。携带"e/基因的质粒ToplO/pDS40-nef保藏号为CGMCCNo.2113。实施例4.细胞凋亡检测质粒pDRVI3.1-luc、pDS40-luc转染Hela细胞培养48小时，A皿exinV-FITC染色后流式细胞仪分析凋亡细胞比例。步骤l:质粒pDRVI3.1-luc、pDS40-luc用Lipofectamine2000分别转染24孔板中的Hela细胞，质粒用量2(ag/L，以DMEM维持液(2%FBS、1%PS、l%Gln)在5%0)2、37X:条件下培养48小时，并用不含质粒的PBS作为阴性对照。步骤2:清洗并收集细胞，以结合缓冲液洗涤细胞(结合缓冲液10mMHepes、140mMNaCl、2.5mMCaCl2，PH7.4)，1000rpm离心5min收集细胞。步骤3:用100pl结合缓冲液重悬细胞，加入5plAnnexinV-FITC(25pg/ml)(BDPharmingen公司)，37。C避光放置20min。步骤4:以结合缓冲液洗涤细胞，1000rpm离心5min收集细胞。结合缓冲液重悬后流式细胞仪检测，计数10000点，分析凋亡细胞比例(％)。结果(图12):质粒pDRVI3.1-luc、pDS40-luc诱导细胞凋亡的比例分别为23.89%和30.48%;阴性对照的细胞凋亡比例为5.65%。结果表明，与不携带发夹RNA表达盒的质粒pDRVI3.1-luc相比，携带发夹RNA表达盒的质粒pDS40-luc未诱导更高水平的细胞凋亡。实施例5.荧光素酶表达水平检测(1)体外细胞表达水平分析质粒pDRVI3.1-luc及pDS40-luc转染Hela细胞后，培养48小时，LucifemseAssaySystem分析荧光素酶的表达水平。步骤l:质粒pDRVI3.1-luc及pDS40-luc用Lipofectamine2000分别转染24孔板中的Hela细胞，质粒用量2jig/L，以DMEM维持液(2%FBS、1%PS、l%Gln)在5%(302、37""C条件下培养48小时，并用不含质粒的PBS作为空白对照。步骤2:转染48小时后倒去细胞培养液，用lxPBS洗两遍细胞，加入500pl的lxLuciferaseCellCultureLysis溶液(Promega公司)于室温培养30min。步骤3:混匀，吸取5^的细胞裂解液加入95pl的lxPBS中。按LuciferaseAssaySystem(Promega公司)说明书进行的操作，将样品加入检测专用96孔板，100pl/孔，迅速于每孔中加入100nl的LuciferaseAssayReagent,一次可以检测16个样品，马上在ReporterTM微孔板荧光发光计上读数。荧光素酶体外细胞表达水平检测结果显示(图13A):与对照的DNA质粒pDRVI3.1-luc(荧光素酶活性平均为502862RLU)相比较，pDS40-luc(荧光素酶活性平均为414510RLU)在表达水平上并无显著差异(PX).05)。(2)小鼠体内表达水平分析将大量制备的无内毒素的质粒pDRVI3.1-luc及pDS40-luc(浓度均为1)ig/Vl)分别注射小鼠，每个实验组设2只小鼠，左右后肢各注射l次，注射量为50jal。用不含质粒的PBS作为空白对照，设2只小鼠。步骤l:在注射小鼠72小时后，处死小鼠，取双后肢注射部位肌肉，分别剪碎后置于含有250^1无菌ddH20的细胞冻存管内，放入液氮中迅速冷冻30min，然后室温缓慢融化，反复两次。步骤2:加入250^1的2xLuciferaseCellCultureLysis混匀，室温1小时，冻融物转移至EP管中3000rpm离心5min，移出细胞裂解上清，进行检测或-8(TC保存。荧光素酶活性检测同上。小鼠肌肉中荧光素酶的检测结果显示(图13B):与对照的DNA质粒pDRVI3.1-luc(荧光素酶活性平均为5630RLU)相比较，pDS40-luc(荧光素酶活性平均为5462RLU)在表达水平上并无显著差异(PX).05)。实施例6.DNA疫苗免疫小鼠Env组Balb/c雌性小鼠分为6个免疫组和1个空白对照组。6个免疫组又分为高剂量3针组、高剂量2针组及低剂量3针组。其中高剂量3针组以40吗的质粒免疫小鼠3次；高剂量2针组以40pg的质粒免疫小鼠2次；低剂量3针组以4吗的质粒免疫小鼠3次。将大量制备的无内毒素的质粒pDRVI3.1-env及pDS40-env稀释为400ng4il(适用于高剂量组的注射)与40ngl(适用于低剂量组的注射)，空白对照组3只小鼠，不注射质粒。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>Nef组Balb/c雌性小鼠分为2个免疫组和1个空白对照组。免疫组分别用大量制备的无内毒素的质粒pDRVI3.1-nef及pDS40-nef以40pg的剂量免疫3次。空白对照组不注射质粒。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>免疫方式与程序采用双侧后肢胫骨前肌注射方法。3针免疫组的免疫程序为第0、2、4周各免疫一次，2针免疫组的免疫程序为第2、4周各进行一次免疫，所有的小鼠均在第6周眼眶采血分离血清，处死小鼠后分离脾淋巴细胞。实施例7.细胞免疫检测(1)脾淋巴细胞的制备1)小鼠眼眶采血，血样标记后4。C过夜，第二天收集血清-2(TC保存。2)处死小鼠后取脾，在5mlHanks洗液中以纱布研磨分散细胞，转移至15ml离心管，1000rpm离心5min。3)弃上清，利用约100nl残留液体重悬细胞后，加入2ml红细胞裂解液，从第一管开始计时，作用4min后，每管加入5mlRPMI-1640洗液终止裂解，1000rpm离心5min。4)弃上清，重悬细胞后，每管加入5mlRPMI-1640洗液洗细胞，1000rpm离心5min。5)弃上清，重悬细胞后，每管加入2mlRPMI-1640完全培养液，混匀后取5(^1细胞悬液以PBS稀释10倍后进行细胞计数，调整淋巴细胞浓度到lxi()7/ml。(2)ELISPOT检测脾淋巴细胞反应水平1)包被:在ELISPOT板中每孔加入包被抗体50pl，用PBS补充体积至每孔100^1，37。C2h。2)ELISPOT板的封闭3)取出已包被过的ELISPOT板，吸弃每孔中的包被抗体溶液。4)用300plPBST洗涤6次。5)在ELISPOT板中，每孔加入200^1含1%BSA的PBS，37°Clh。6)取出37。C下封闭lh的ELISPOT板，吸弃每孔中的封闭液。(不要洗板。)7)在ELISPOT板中，加入lOOpl多肽(先加肽再加细胞)，最后加入lOOpl淋巴细胞(细胞总数为lx106)，总体积到20(^1(每条多肽的终浓度为5|ag/ml，细胞的终浓度为lxl07/ml，即每孔细胞总数为lx106)。阴性对照不加多肽，力[U0(^1RPMI-1640完全培养基。阳性对照不加多肽，加入PMA2.5(il(25ng/ml)，Innomycin1^1(l吗/ml)。免疫组各设2个复孔。8)盖好ELISPOT板，于5%0)2、37'C条件下培养30小时。9)培养30h后，取出ELISPOT板。甩去细胞后，每孔加入200^冰冷的去离子水。把ELISPOT板放置在冰浴中10分钟。10)用PBST洗板8次。11)每孔加入100pl生物素化的检测抗体(detectorAb)。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37°C孵箱中孵育lh。12)取出ELISPOT板，倒去检测抗体溶液，用PBST洗涤8次。13)每孔加入50plGABA溶液。用膜封住ELISPOT板后，把ELISPOT板放置在37。C孵箱中孵育lh。14)取出ELISPOT板，倒去GABA溶液。用PBST洗涤8次。洗涤完毕后，在吸水纸上轻轻拍干ELISPOT板。15)每孔加入30pl显色溶液。在暗处、室温下孵育(1540分钟)。16)出现斑点后，用蒸馏水冲洗，终止反应。17)室温下避光干燥，读板仪检测。小鼠的细胞免疫检测结果(见图14)用Eiw抗原或Nef抗原特异肽库剌激小鼠脾细胞后分泌IFN-Y的细胞数量表示。A图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在40jig剂量免疫小鼠3针后的结果，与质粒pDRVI3.1-env所诱导的Env蛋白特异的分泌IFN-y的脾淋巴细胞数(102SFU/百万细胞)相比，携带发夹RNA的质粒pDS40-env可以显著地提高Env蛋白特异的分泌IFN-Y的脾淋巴细胞数(243SFU/百万细胞)(P<0.05)。B图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在40|ig剂量免疫小鼠2针后的结果，相比较于质粒pDRVI3.1-env(61SFU/百万细胞)，DNA疫苗质粒pDS40-env可以显著地提高Env蛋白特异的分泌IFN-y的脾淋巴细胞数(150SFU/百万细胞)(PO.05)。C图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在4吗剂量免疫小鼠3针后的结果，相比较于质粒pDRVI3.1-env(43SFU/百万细胞)，DNA疫苗质粒pDS40-env可以显著地提高Env蛋白特异的分泌IFN-y的脾淋巴细胞数(103SFU/百万细胞)(PO.05)。D图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-nef和pDS40-nef在40(ig剂量免疫小鼠3针后的结果，与质粒pDRVI3.1-nef所诱导的Nef蛋白特异的分泌IFN-y的脾淋巴细胞数(71SFU/百万细胞)相比，携带发夹RNA的质粒pDS40-env可以显著地提高Nef蛋白特异的分泌IFN-y的脾淋巴细胞数(263SFU/百万细胞)(P<0.05)。实施例8.体液免疫检测ELISA方法检测Env与Nef特异性IgG结合抗体滴度。步骤l:用纯度大于90。/。的重组Erw抗原蛋白包被酶标板(lpg/ml)，用纯度大于85。/。的重组Ne航原蛋白包被酶标板(3pg/ml)，每孔加0.1ml，4°C过夜。次日洗涤缓冲液(PBST)洗涤3次，甩尽残余液体。以抗体稀释液封闭60min，洗涤缓冲液洗涤3次，甩干后作检测，或晾干后4t:保存。步骤2:加抗体稀释液系列稀释的待检样品(从1:50或1:100开始，倍比稀释)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37"C孵育60min，洗涤8次(同时做空白、阴性及阳性孔对照)。步骤3:于反应孔中，加入新鲜h5000抗体稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗O.lml,37t:孵育60min，洗涤8次，最后一遍用双蒸水洗涤。步骤4:加底物液显色于各反应孔中加入TMB底物溶液O.lml，37°C避光反应10min。终止反应于各反应孔中加入50pl2M的硫酸。步骤5:结果判定在ELISA检测仪上，于450nm处(630nm为参考波长)，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。小鼠体液免疫反应的结果见图15。A图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-erw和pDS40-env在40pg剂量免疫小鼠3针后的结果，与质粒pDRVI3.1-env所诱导结合抗体滴度水平(l:7184)相比，携带发夹RNA的质粒pDS40-eiw不能显著地提高抗体滴度水平(h6400)(P>0.05)。B图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-env禾卩pDS40-env在40吗剂量免疫小鼠2针后的结果，相比较于质粒pDRVD.l-env(l:1008)，DNA疫苗质粒pDS40-env不能显著地提高结合抗体滴度水平(l:1131)(P>0.05)。C图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-env和pDS40-env在4吗剂量免疫小鼠3针后的结果，相比较于质粒pDRVI3.1-env(l:898)，DNA疫苗质粒pDS40-env不能显著地提高结合抗体滴度水平(l:800)(P>0.05)。D图为DNA疫苗质粒pDRVI3.1-nef和pDS40-ne赃40昭剂量免疫小鼠3针后的结果，与质粒pDRVI3.1-ne0f诱导结合抗体滴度水平(l:5701)相比，携带发夹RNA的质粒pDS40-nef显著地降低了抗体滴度水平(l:1008)(P<0.05)。综合动物实验结果(图14、图15)，发夹RNA表达盒元件对于体液免疫应答水平的提高没有显著的效果，但其可以显著增强DNA疫苗诱导的细胞免疫应答水平，可以作为优化DNA疫苗的元件。<110>中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心〈120〉表达具有免疫激活功能的发夹RNA的DNA疫苗载体及其用途〈130〉1200701717c〈160〉11〈170>Patentlnversion3.3<210>1<211>30〈212〉隨<213>Artificial<220〉〈223〉primer<、1gctctagatgctgtgccttctagttgccag30<210〉2<211〉47〈212〉腿〈213〉Artificial〈220〉〈223〉primer〈400〉2ctatgaactaatgaccccgtaattaggtttgg"tggtgggctgatg47<210>3〈211〉23<212>DNA<213〉Artificial<220><223〉primer<400>3attacggggtcattagttcatag23〈210〉4〈211〉37〈212〉瞧〈213>Artificial<220>〈223〉primer〈400〉4cgggatcctcgggccctctgacggttcactaaacgag37〈210〉5<211〉28〈212〉腿〈213〉Artificial<220〉<223〉primer<400〉5cgggatccatggaagacgccaaaaacat28〈210〉6〈211>28<212〉腿〈213〉Artificial<220〉<223〉primer<400〉6cgggatcctcacacggcgatctttccgc28<210〉了<211〉36〈212〉鹏〈213〉Artificial〈220〉<223〉primer<400〉7caggatatcaccatgatcgaggagctgatctacagc36〈210〉8〈211〉40<212〉DMA<213>Artificial<220〉〈223〉primer<柳>8caggatatctctagatcagccgcccttctccttcaggaag40〈210〉9<211〉64〈212〉丽〈213〉Artificial<220><223>primer<400〉9ttgggcccgccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgttca卿gacg60acag64〈210〉10<211>63〈212〉鹏〈213〉Artificial〈220〉〈223〉primer〈400>10ttgggcccccgggagatagtgatgaagtacatccattataagctgtcgtctcttgaacga60cag63<210〉11〈211〉90〈212〉DNA〈213〉Artificial<220〉<223〉hairpinRNAcodingsequence<400>11gccgggagatagtgatgaagtacatccattat貼gctgtcgttcaagagacgacagctta60taatggatgtacttcatcactatctcccgg90权利要求1.一种表达载体，其包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA的DNA序列。2.权利要求1的表达载体，其中所述启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。3.权利要求1的表达载体，其中编码所述发夹RNA的DNA序列具有SEQIDNO:13所示的序列。4.权利要求3的表达载体，其是图1B所示的pDS40。5.—种重组质粒，其包含权利要求1至4中任一项的表达载体和编码抗原的外源基因。6.权利要求5的重组质粒，其中所述外源基因选自HIV-1CN54的，基因禾口"e/基因。7.权利要求6的重组质粒，其中HIV-1CN54e"v基因来自保藏号为CGMCCNo.2112的ToplO/pDRVI3.1-env，HIV-1CN54"e/基因来自保藏号为CGMCCNo.2113的Top10/pDS40-nef。8.权利要求7的重组质粒，其选自图2所示的pDS40-env和pDS40-nef。9.一种宿主细胞，其包含权利要求1至4中任一项的表达载体或者权利要求5至8中任一项的重组质粒。10.权利要求9的宿主细胞，其是大肠杆菌。11.一种具有增强的免疫原性的DNA疫苗，其包含权利要求5至8中任一项的重组质粒。12.—种提高DNA疫苗免疫原性的方法，其包含将编码抗原的外源基因克隆到权利要求1至4中任一项的表达载体中以构建DNA疫苗。13.权利要求12的方法，其中所述编码抗原的外源基因选自HIV-1CN54的ewv基因和"e/基因。14.权利要求13的方法，其中HIV-lCN54e"v基因来自保藏号为CGMCCNo.2112的Top10/pDRVB.1-env，HIV-1CN54"e/基因来自保藏号为CGMCCNo.2113的ToplO/pDS40誦nef。15.权利要求1至4中任一项的表达载体在制备具有增强的免疫原性的DNA疫苗中的应用。全文摘要本发明公开了一种用于提高DNA疫苗免疫原性的表达载体，该载体包含可操纵地连接于启动子的编码具有免疫激活功能的发夹RNA(hairpinRNA)的DNA序列。本发明还公开了一种重组质粒，其包含上述表达载体和编码抗原的外源基因。本发明同时公开了具有增强的免疫原性的DNA疫苗及其制备方法。文档编号C12N15/63GK101353665SQ20071012978公开日2009年1月28日申请日期2007年7月26日优先权日2007年7月26日发明者勇刘,张玉伟,李鼎锋,邵一鸣申请人:中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心