一种用于胃组织的微小rna探针及其检测方法

专利名称：：一种用于胃组织的微小rna探针及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及微小RNA，具体涉及一种用于检测胃组织的微小RNA探针及其检测方法。
背景技术：
：微小RNA是一类长度为1924nt，在进化上比较保守的不编码蛋白质的单链小分子RNA，是近年来新发现的基因调节因子；在动物和植物细胞中，微小RNA通过对目标mRNA的切割或翻译的抑制而发挥重要的调节作用。微小RNA在生物体的正常发育中起着举足轻重的作用，人体基因组中已发现有250个左右的微小RNA，在不同组织细胞的生理异常变异中某些微小RNA具有明显的异常表达，具体说在不同组织的肿瘤发生与某些微小RNA的表达和功能异常有密切的关系，大约有50%的得到注解的微小RNA在基因组上被定位为与肿瘤相关的脆性位点，因此对不同类型肿瘤组织中具体微小RNA的表达和功能异常的研究受到人们的重视。如Calin等于2002年首次报道了慢性B淋巴细胞白血病中常见的13ql4的缺失可导致2种微小RNA基因(miR-15a和miR-16a)的不表达，提示微小RNA具有抑制白血病发生的作用(ProcNatlAcadSciUSA2002;99:15524)。随后，通过对结肠癌中28种微小RNA表达谱的分析，Michael等发现miR-143和miR-145的表达下调有可能促进了肿瘤的发生(MolCancerRes2003;1:882)。进一步扩大观察的病种数，通过研究肿瘤细胞与正常细胞的微小RNA表达谱的差异，人们发现了至少21种在多种肿瘤中异常表达的微小RNA(ProcNatlAcadSciUSA2006;103:2257)。我国是胃癌高发区，现有的技术中均没有涉及到胃组织的癌变与哪些高表达的微小RNA有关。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测胃组织异常时微小RNA高表达的微小RNA探针，还提供了利用该探针检测胃组织的微小RNA表达异常的方法。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为一种用于胃组织的微小RNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，所述的寡聚核苷酸编码片段包括下述微小RNA:hsa-miR-186*、hsa-miR-20b、hsa-miR-18a、hsa-miR-181d、hsa-miR-424、hsa-miR-18b、hsa-miR-17、hsa-miR-20a、hsa-miR-106a、hsa國miR-374a、hsa-miR-224、hsa-miR-181b、hsa-miR-25、hsa-miR-99a、hsa-miR-148b、hsa-miR-421、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-214、hsa-miR-92a和hsa-miR-574-5p。所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-93、hsa-miR-92b、hsa國miR-100、hsa-miR-638、hsa-miR-106b、hsa-miR-923、hsa-miR-125a-5p、hsa隱miR-23a、hsa隱miR-199a陽5p、hsa-miR-663、hsa隱miR-99b、hsa-miR-125b、hsa-miR-23b、hsa-miR-181a和hsa-miR-10b。所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR國183、hsa-miR-483-5p、hsa-miR陽361-5p、hsa-miR-19b、hsa隱let-7i、hsa-miR-149*、hsa-miR-191、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-27b、hsa陽miR-451、hsa-miR-24、hsa-miR-151-5p禾口hsa-miR-26a。一种检测胃组织的微小RNA的方法，依次包括总RNA提取、总RNA质量分析、微离心过滤得到小RNA样品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特异性荧光标记小RNA样品，用上述的探针对荧光标记的小RNA样品杂交检测。化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段能与靶微小RNA互补杂交；延伸臂片段能使与它连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍；探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的。探针是由光敏试剂原位合成为微流体芯片。上述微小RNA在RNA基因数据库中都能找到，延伸臂片段可以用分子生物学上能减少杂交空间阻碍的任何延伸臂片段。与现有技术相比，本发明的优点在于用于胃组织的微小RNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段包括上述微小RNA，探针能对胃组织的微小RNA进行杂交检测，能检测出胃组织发生癌变时高表达的微小RNA，在癌变的胃组织中探针组成的每种微小RNA的量就比正常的胃组织的每种微小RNA的量高出许多，微小RNA探针能检测出胃组织发生癌变时微小RNA的异常表达，从而可作为胃组织发生癌变的一种诊断标志，微小RNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提供了有利的依据。图1为胃癌组织微小RNA的探针检测照片；图2为胃癌旁组织微小RNA探针检测照片；图3为胃癌组织与胃癌旁组织的微小RNA探针检测差异比较照片。具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1一种用于胃组织的微小RNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段包括下述微小RNA:hsa-miR-186*、hsa-miR陽20b、hsa-miR-18a、hsa-miR-181d、hsa-miR-424、hsa-miR-18b、hsa-miR-17、hsa-miR-20a、hsa-miR-106a、hsa-miR-374a、hsa-miR-224、hsa-miR-181b、hsa-miR-25、hsa-miR-99a、hsa-miR-148b、hsa-miR-421、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-214和hsa-miR-92a、hsa-miR-574-5p，寡聚核苷酸编码片段能与靶微小RNA互补，延伸臂片段能使与它连接的编码片段离片基有一定的距离，减少杂交空间阻碍，探针杂交的Tm值是通过化学修饰来平衡的，探针是由光敏试剂原位合成为微流体芯片。实施例2一种用于胃组织的微小RNA探针，与实施例l基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-93、hsa-miR-92b、hsa-miR-lOO、hsa-miR-638、hsa-miR-106b、hsa-miR-923、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-23a、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR陽125b、hsa-miR-23b、hsa-miR-181a和hsa-miR-10b。实施例3一种用于胃组织的微小RNA探针，与实施例l基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-183、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-19b、hsa-let-7i、hsa-miR-149*、hsa-miR-191、hsa陽miR-146b-5p、hsa-miR-27b、hsa隱miR-451、hsa-miR陽24、hsa隱miR-151-5p禾Qhsa隱miR-26a。实施例4一种用于胃组织的微小RNA探针，与实施例2基本相同，所不同的只是寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-183、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-19b、hsa-let-7i、hsa-miR-149*、hsa-miR-191、hsa-miR-146b-5p、hsa陽miR-27b、hsa隱miR-451、hsa-miR-24、hsa陽miR-151-5p禾卩hsa-miR-26a。实施例5一种检测胃组织的微小RNA的方法，依次包括总RNA提取各自称取100mg胃癌组织和胃癌旁组织，分别加入到液氮中研磨至干粉状—加lmlTrizo1—继续研磨至匀浆一转入1.5ml离心管中一12000Xg离心10min—收集上清至新离心管中一室温放置5min—加入0.2ml氯仿一涡旋15-30s—室温放置3min—12000Xg离心15min—收集上清一加两倍上清体积的异丙醇一-201:沉淀过夜一12000Xg离心15min，去上清一加lmL含有DEPC水75%乙醇(预冷)一7500Xg离心5min—倒尽液体，轻微离心，除去管底残液—自然干燥3min—沉淀重溶于50plDEPCH20，得到各自的总RNA;总RNA质量分析通过A230、A260、A280检测，以及对各自的总RNA采用琼脂糖凝胶电泳，根据18SrRNA和28SrRNA的比值分析总RNA质量；微离心过滤得到小RNA样品对各自的总RNA用微离心过滤柱过滤，分别得到片段小于300nt的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品；在胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品中分别添加Poly(A)聚合酶使小RNA3'端加上poly(A)尾巴；用Cy3和Cy5特异性荧光标记分别标记胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品先用一个寡聚核苷酸与这个poly(A)尾巴连接，然后加入Cy3和Cy5特异性荧光标记；用实施例4的探针分别对荧光标记的胃癌组织小RNA样品和胃癌旁组织小RNA样品进行杂交检测把各自的小RNA样品加入至含有25%的甲酰胺的100yl6xSSPE缓冲液中(0.90MNaCl,60mMNa2HP04,6mMEDTA,pH6.8)，然后置于用实施例4的探针合成的微流体芯片上进行杂交检测，杂交反应仪器为微循环泵杂交仪器，杂交温度为34°C，杂交时间为过一夜后釆集杂交图像；杂交图象用激光扫描仪(GenePix4000B,MolecularDevice)采集，分别得到如附图1和附图2的照片，对两种样品杂交图象组合差异比较得到如附图3的照片，杂交图像数据处理和分析用Array-Pro(MediaCybemetics)软件，数据处理和分析首先是扣除背景，计算重复点平均值和标准偏差，然后通过LOWESS(Locally-WeightedRegression)过滤进《亍t示准《七，数据处理结果采用Hierarchicalclustering、K-means/mediansclustering或者ANOVA(analysisofvariance)等方法，得到如表1的结果；从附图1、附图2和附图3的比较可以看出胃癌组织的有些微小RNA的量比胃癌旁组织的微小RNA的量要高，从表1数据处理结果进一步说明了胃癌组织的微小RNA的量比胃癌旁组织的微小RNA的量要高许多，因此从胃组织的有些微小RNA的量的异常提高就可以得出胃组织发生癌变的结果，本发明就为胃癌的诊断提供了依据，进一步可以选用这些微小RNA作为对胃癌进行定向耙点治疗。表1:胃癌组织和胃癌旁组织的微小RNA的量及其相互比较对数值<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种用于胃组织的微小RNA探针，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，其特征在于所述的寡聚核苷酸编码片段包括下述微小RNAhsa-miR-186*、hsa-miR-20b、hsa-miR-18a、hsa-miR-181d、hsa-miR-424、hsa-miR-18b、hsa-miR-17、hsa-miR-20a、hsa-miR-106a、hsa-miR-374a、hsa-miR-224、hsa-miR-181b、hsa-miR-25、hsa-miR-99a、hsa-miR-148b、hsa-miR-421、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-214、hsa-miR-92a和hsa-miR-574-5p。2、如权利要求1所述的一种用于胃组织的微小RNA探针，其特征在于所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-93、hsa-miR-92b、hsa-miR-lOO、hsa-miR-638、hsa-miR-106b、hsa-miR-923、hsa-miR-125a-5p、hsa隱miR-23a、hsa隱miR-199a-5p、hsa-miR-663、hsa-miR-99b、hsa-miR-125b、hsa-miR-23b、hsa-miR-181a和hsa-miR隱10b。3、如权利要求1或2所述的一种用于胃组织的微小RNA探针，其特征在于所述的寡聚核苷酸编码片段还包括下述微小RNA:hsa-miR-21、hsa-miR-27a、hsa-miR-183、hsa-miR-483-5p、hsa-miR-361國5p、hsa陽miR-19b、hsa-let-7i、hsa-miR-149*、hsa-miR國191、hsa隱miR-146b-5p、hsa-miR-27b、hsa-miR隱451、hsa-miR-24、hsa-miR-151-5p禾卩hsa-miR-26a。4、一种利用权利要求1或2或3所述的探针检测胃组织的微小RNA的方法，依次包括总RNA提取、总RNA质量分析、微离心过滤得到小RNA样品、添加Poly(A)聚合酶和用Cy3和Cy5特异性荧光标记小RNA样品步骤，其特征在于用所述的探针对荧光标记的小RNA样品杂交检测。全文摘要本发明公开了一种用于胃组织的微小RNA探针及其检测方法，探针的序列由化学修饰过的寡聚核苷酸编码片段和延伸臂片段组成，寡聚核苷酸编码片段包括下述微小RNAhsa-miR-186^*、hsa-miR-20b、hsa-miR-18a、hsa-miR-181d、hsa-miR-424、hsa-miR-18b、hsa-miR-17、hsa-miR-20a、hsa-miR-106a、hsa-miR-374a、hsa-miR-224、hsa-miR-181b、hsa-miR-25、hsa-miR-99a、hsa-miR-148b、hsa-miR-421、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-214、hsa-miR-92a和hsa-miR-574-5p；对胃组织的微小RNA进行杂交检测，能检测出胃组织发生癌变时高表达的微小RNA，从而作为胃组织发生癌变的一种诊断标志，这些微小RNA进一步可作为设计定向胃癌药物的靶点，因此本发明为胃癌的诊断和定向治疗提供了有利的依据。文档编号C12Q1/68GK101182576SQ20071015690公开日2008年5月21日申请日期2007年11月19日优先权日2007年11月19日发明者肖丙秀,英苗,郭俊明申请人:宁波大学