专利名称：一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法
技术领域：
一种基于以现代分子生物学和细胞学为基础而建立高通量技术方法，使用 一种或多种分离自人体或动植物或微生物的各种组织和器官的细胞，被巿售检 测仪器捕获的各种细胞学的动态信息集成，经各种统计学分析方法转换成数学 矩阵表示，也可以转换成数字或字母构成的条码表示，赋予一种或一类中药及 其代谢产物或其复方制品生物功能的象征标记。用于鉴别道地中药材和饮片及 它们所组方的中成药，区别同种物种不同产地及不同物种不同产地的中药材， 用于指导中药材的选种、选地、栽培或养殖或培养(克隆)、釆集或终止培养、
加工的控制指标；作为一种或一类中药及其代谢产物质量标准的鉴别项目，作 为分离中药或中成药的有效组分和有效成分的指标或模型。
(二)
背景技术：
目前，鉴别中药材的方法往往采用物理方法，化学方法，生物化学分析方 法，基因分析方法和动物实验方法。物理方法包括外观，气味，酸碱度，和使 用紫外光谱、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱、核磁共振、透射电镜、X射线、 薄层分析(TLC)、气相色谱(GC)、质谱(MC)、电子显微镜、电感耦合等离子 体原子发射光谱(ICP)等分析法；化学方法包括单体的元素分析、结构或基团 分析，氨基酸分析，糖组成分析等；生物化学分析方法包括酶分析，抗体分析 和活性分析等；以上方法用于化学单体是成功的，但用于中药分析潜在难以克 服的问题。因为一味药材本身就是一个大复方，由已知和未知的含量不等的化 学成分组成，其中某一种甚至几种成分或组分的多少或几个比例往往难以反映
道地药材和中草药的质量高低和好坏，对于由道地药材和中草药组成复方的质 量判断，往往束手无策。虽然，以上方法已列入中华人民共和囯药典，尤其是 高效液相色谱分析方法，各版药典不断增加，让它反映中医药理论和鉴别道地 药材是困难的。
基因分析方法是只测定中草药的几个比例不到1%碱基的特征位点的碱基 序列，因为绝大多数的中草药没有完成全基因序列的测定，特征位点的碱基序 列只能说明物种或个体的相似性，不能代表中药的功效，因为基因的表达与生 态环境有关，所以，基因分析方法用于中药材质量判断可以作为一个鉴别项目， 但需要有与功能相关的指标配合。
动物实验方法是目前常用的药物研究方法，中国为中药材的药理毒理研究 制订了一整套的规范，努力想通过动物实验直接反映中草药的功效。因为动物 与人类的天生差异，又因为动物实验的周期长，成本高，稳定性差， 一直没有 用于中药材的质量检测，也无法用于道地药材的鉴别。
中医药是中国的国宝，而道地药材则是宝中之宝。道地药材是指来自特定 产区、生产历史悠久、栽培和加工技术精细、质量优良、疗效显著的药材。道 地药材是优质药材的代名词。道地药材是一约定俗成的概念，是一个古代药物 标准化的概念。它的产生是以几百年甚至上千年的实践教训和经验为依据的、 经过临床的考验的、有着丰富的中医药内涵的科学。中药材的最大特点和精华 是它的道地性。
从生物学上说，道地药材的形成是基因型与生境之间相互作用的产物。道 地药材这一概念的形成和发展的全过程都离不开特定产地，其本质是同一药材 在不同产地中质量最佳者。因此，道地药材一般在药材前冠以地名，如阳春砂、 宣木瓜、茅苍术、岷当归、关黄柏及四大川药、四大怀药、辽五味、浙八味等等。古人早就有了概括"离其本土，则效异"。
今天，大量存在着离开道地产区种植道地药材，用有人称之为"唯有效成 分论"的化学药管理方法鉴定中药材品质优劣。收效甚微。导致道地药材不道 地，甚至濒临灭绝，导致中医处方不错而疗效不好的想象时常发生，导致国内 外中药材巿场信用危机。问题就出在没有一种鉴别道地药材的实用而有效的方 法。
所以，科学界、中医界和中药产业界希望有一个接近人体的、简易的、周 期短的、成本低的，稳定性好，与人体相关性强的鉴别道地药材的方法出现。 一种基于高通量的细胞学信息鉴别道地中药材的方法是一种可重复、稳定、有 对应相关和简易的新方法。
发明内容
1. 以现代分子生物学和细胞生物学为基础建立的快速、微量、体外筛选模 型和测试方法，结合自动化技术发展起来的已商品化的巿售技术平台或仪器的 一种高通量地从各种细胞捕获中药材细胞学动态信息技术。将从各种细胞捕获 中药材细胞学动态信息经组合构成的数值，经各种统计学分析方法转换成数学 矩阵表示，也可以转换成数字或字母构成的条码表示，赋予一种或一类中草药 及其代谢产物或其复方制品的特有信息，作为它们的各种生物功能的象征标记。
2. 使用象征标记区别相同物种不同生长地、不同物种不同生长地的道地药 材、中草药和天然药物。
3. 使用象征标记作为一种或一类中草药及其代谢产物和它们的中成药质量 标准的鉴别项目。
4. 使用象征标记指导中国道地药材、中药材和饮片及天然药物的选种、选 地、栽培或养殖或培养(克隆)、釆集或终止培养、加工的质量标准的控制指标。
5.使用象征标记作为指标或模型分离中国道地药材、中草药和天然药物中 的有效组分和有效成分分离模型。
为达到发明目的本发明釆用的技术方案是 1.常规细胞培养操作
l.l选合适的稳定的细胞株，于二氧化碳培养箱培养，细胞消化。
1. 2基线测量取16孔或96孔检测板，在每孔中加入50ul细胞培养基。
1. 3接种细胞每孔103~104个/100111。
1.4细胞生长检测正常。
1. 5换无血清培养基后2小时，加入被测试样品。
2. 中药材提取
取中药材烘干，打粉，称取中国药典中药材人用量的千分之15的量。加lmL 纯净水，浸泡，超声，沸水加热，离心，取上清液备用。
3. 微量中药材提取液介入细胞培养
取中药材提取液10uL，加入16孔或96孔板除对照组外的相对应孔内。使 用巿售仪器获取细胞学动态信息。细胞学动态信息用以下预先设定的公式和条 件(编制成软件)转换成中药材象征标记的数字或条码。
3. 1选取横坐标的8 ~ 10个时间区间(8 ~ 10个数位)的细胞学信息，用0 ~ 9数字和A Z或相应的条码表示。
3.2以无中药材为对照的细胞学动态信息为参照点。
4. 使用中药材细胞学象征标记的数字或条码标记相同物种不同生长地、不 同物种不同生长地的道地药材、中草药和天然药物。作为它们的鉴别，鉴定， 生产过程和有效成分分离过程的一种质量控制和指标。
图l、从A549细胞株(非小型肺癌细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图2、从RBL细胞株(大鼠嗜碱性白细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息 图3、从C0S7细胞株(非洲绿猴肾细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图4、从C0S1细胞株(非洲绿猴肾细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图5、从3T3细胞株(成纤维细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图6、从C2C12 (肌原细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图7、从HELA细胞株(人宫颈癌细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图8、从H印G2细胞株(人肝胚细胞瘤细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图9、从MCF7细胞株(人乳腺癌细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态信息
图10、从MCF7/Adr细胞株(人乳腺癌耐药细胞)捕获的冬虫夏草细胞动态
<古自 i口 ,s、
图ll、从A549细胞株捕获的杭白菊与淮菊细胞动态信息 图12、从A549细胞株捕获的杭白菊与亳菊、贡菊细胞动态信息 图13、从A549细胞株捕获的杭白菊与苏菊细胞动态信息 图14、从A549细胞株捕获的浙贝母与平贝母、土贝母细胞动态信息 图15、从A549细胞株捕获的浙贝母与川贝母细胞动态信息 图16、从A549细胞株捕获的浙贝母的不同加工方法细胞动态信息 图17、从A549细胞株捕获的象山浙贝母与磐安浙贝母细胞动态信息 图18、从A549细胞株捕获的温郁金与广西郁金细胞动态信息 图19、从A549细胞株捕获的临安元胡与东阳元胡细胞动态信息 图20、从A549细胞株捕获的浙江磐安玄参与湖北玄参、河南玄参细胞动态 信息
图21、从A549细胞株捕获的临安杭白术与东阳杭白术细胞动态信息 图22、从A549细胞株捕获的福建白术与安徽白术、河南白术细胞动态信息 图23、从A549细胞株捕获的临安、东阳与磐安杭白芍细胞动态信息
图24、从A549细胞株捕获的杭白芍与安徽白芍、河南白芍细胞动态信息
图25、从A549细胞株捕获的浙麦冬与湖北麦冬、四川麦冬细胞动态信息
图26、从A549细胞株捕获的麻黄与禹白芷细胞动态信息
图27、从A549细胞株捕获的关大力细胞动态信息
图28、从A549细胞株捕获的知母细胞动态信息
图29、从A549细胞株捕获的川黄连细胞动态信息
图30、从A549细胞株捕获的金银花与板蓝根细胞动态信息
图31、从A549细胞株捕获的青蒿细胞动态信息
图32、从A549细胞株捕获的大黄细胞动态信息
图33、从A549细胞株捕获的火麻仁细胞动态信息
图34、从A549细胞株捕获的独活细胞动态信息
图35、从A549细胞株捕获的秦艽细胞动态信息
图36、从A549细胞株捕获的五加皮细胞动态信息
图37、从A549细胞株捕获的广藿香与苍术细胞动态信息
图38、从A549细胞株捕获的茯苓细胞动态信息
图39、从A549细胞株捕获的车前子细胞动态信息
图40、从A549细胞株捕获的茵陈细胞动态信息
图41、从A549细胞株捕获的附子与丁香细胞动态信息
图42、从A549细胞株捕获的陈皮与香附细胞动态信息
图43、从A549细胞株捕获的山楂细胞动态信息
图44、从A549细胞株捕获的槟榔细胞动态信息
图45、从A549细胞株捕获的大蓟细胞动态信息
图46、从A549细胞株捕获的茜草细胞动态信息
图47、从A549细胞株捕获的白芨细胞动态信息
图48、从A549细胞株捕获的艾叶细胞动态信息
图49、从A549细胞株捕获的姜黄细胞动态信息
图50、从A549细胞株捕获的丹参细胞动态信息 图51、从A549细胞株捕获的刘寄奴与马鞭草细胞动态信息 图52、从A549细胞株捕获的三棱细胞动态信息 图53、从A549细胞株捕获的半夏细胞动态信息 图54、从A549细胞株捕获的苦杏仁与紫菀细胞动态信息 图55、从A549细胞株捕获的紫菀与远志细胞动态信息 图56、从A549细胞株捕获的远志细胞动态信息 图57、从A549细胞株捕获的钩藤与天麻细胞动态信息 图58、从A549细胞株捕获的石菖蒲细胞动态信息 图59、从A549细胞株捕获的党参与黄芪细胞动态信息 图60、从A549细胞株捕获的巴戟天与淫羊藿细胞动态信息 图61、从A549细胞株捕获的当归细胞动态信息 图62、从A549细胞株捕获的北沙参与黄精细胞动态信息 图63、从A549细胞株捕获的浮小麦细胞动态信息 图64、从A549细胞株捕获的五味子与乌梅细胞动态信息 图65、从A549细胞株捕获的山茱萸细胞动态信息 图66、从A549细胞株捕获的蛇床子细胞动态信息 图67、从A549细胞株捕获的六味地黄丸细胞动态信息 图68、从RBL细胞株捕获的六味地黄丸细胞动态信息 图69、从C0S7细胞株捕获的六味地黄丸细胞动态信息 图70、从3T3细胞株捕获的六味地黄丸细胞动态信息
图71、从A549细胞株(非小型肺癌细胞)捕获的不同产地冬虫夏草综合细 胞动态信息
图72、冬虫夏草从A549细胞株捕获的细胞动态信息转换成数字和条码
具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不 仅限于此。
实例一从不同细胞株捕获的道地药材(冬虫夏草)细胞动态信息
1. 取96孔检测板，在每孔中分别加入50ulA549、 RBL、 C0S7、 C0S1、 3T3、 C2C12、 HELA、 HepG2、 MCF7、 MCF7/Adr细胞株培养基，检测基线，接入A549、 RBL、 C0S7、 C0S1、 3T3、 C2C12、 HELA、 HepG2、 MCF7、 MCF7/Adr细胞，使每孔 细胞浓度为1000 ~ 10000个/100ul，置于测试台放入二氧化碳培养箱开始检测。 细胞生长18~24小时后，将细胞置于无血清培养基中2小时后加入加入被测试样品。
2. 中药材提取
取冬虫夏草原药材烘干，打粉，称取O. 09g。加lmL纯净水，浸泡30分钟， 超声10分钟，沸水加热20分钟，3500转/分离心15分钟，取上清液备用。
3. 微量中药材提取液介入细胞培养
取中药材提取液10uL，加入96孔板除对照组外的相对应孔内。使 用巿售仪器获取细胞学动态信息。见图1~10,所获信息提示同一中药从不同 来源的细胞株捕获到的动态信息不同；
实例二~九从A549细胞株捕获的道地药材"浙八味"(杭白菊、浙贝 母、温郁金、元胡、杭白术、玄参、杭白芍、浙麦冬)与对应的相同中药名不 同产地药材的细胞动态信息
1. 取96孔检测板，在每孔中加入50ulA549细胞株培养基，检测基线，接 入A549细胞，使每孔细胞浓度为1000 10000个/100ul，置于测试台放入二氧 化碳培养箱开始检测。细胞生长18~24小时后，将细胞置于无血清培养基中2 小时后加入被测试样品。
2. 中药材提取
取中药材(不同产地菊花、贝母、郁金、元胡、白术、玄参、白芍、麦冬) 烘干，打粉，分别称取中国药典中药材人用量的千分之15的量。加lmL纯净水,
浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，3500转/分离心15分钟，取上 清液备用。
3.微量中药材提取液介入细胞培养
取中药材提取液10uL，加入96孔板除对照组外的相对应孔内。使用巿售仪 器获取细胞学动态信息。见图11~25,所获信息提示同种物种不同产地及不 同物种不同产地的中药材，存在明显差异；
实例十从A549细胞株捕获的41类别的54种中药材，包括相同中药名不 同产地的中药材细胞动态信息
1. 取96孔检测板，在每孔中加入50ulA549细胞株培养基，检测基线，接 入A549细胞，使每孔细胞浓度为1000 ~ 10000个/100ul，置于测试台放入二氧 化碳培养箱开始检测。细胞生长18~24小时后，将细胞置于无血清培养基中2 小时后加入被测试样品。
2. 中药材提取
取54种中药材(麻黄、禹白芷、关大力、知母、川黄连、金银花、板蓝根、
青蒿、大黄、火麻仁、独活、秦艽、五加皮、广藿香、苍术、茯苓、车前子、
茵陈、附子、丁香、山楂、槟榔、大蓟、茜草、白芨、艾叶、姜黄、丹参、刘 寄奴、马鞭草、三棱、半夏、苦杏仁、紫菀、紫菀、远志、钩藤、天麻、石菖
蒲、党参、巴戟天、淫羊藿、当归、北沙参、黄精、浮小麦、黄芪、五味子、 乌梅、山茱萸、蛇床子)烘干，打粉，分别称取中囯药典中药材人用量的千分 之15的量。加lmL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟， 3500转/分离心15分钟，取上清液备用。
3. 微量中药材提取液介入细胞培养
取中药材提取液10uL，加入96孔板除对照组外的相对应孔内。使用市售仪
器获取细胞学动态信息。见图26~66,所获信息提示按传统中医分类的中药 材，各类甚至同类中药材无一相同；
实例十一从4种细胞株捕获的一种中成药"六味地黄丸"的、由3个厂 家生产产品的细胞动态信息
1. 取96孔检测板，在每孔中加入50ulA549、 RBL、 C0S7、 3T3细胞株培养 基，检测基线，接入A549、 RBL、 C0S7、 3T3细胞，使每孔细胞浓度为1000 ~ 10000 个/100ul，置于测试台放入二氧化碳培养箱开始检测。细胞生长18~24小时后， 将细胞置于无血清培养基中2小时后加入被测试样品。
2. 中成药提取
取不同产家六味地黄丸(仲景牌六味地黄丸、清大牌六味地黄丸、同仁堂 牌六味地黄丸)烘干，打粉，分别称取中国药典中药材人用量的千分之15的量。 加lmL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸水加热20分钟，3500转/分离 心15分钟，取上清液备用。
3. 微量中成药提取液介入细胞培养
取中药材提取液10uL，加入96孔板除对照组外的相对应孔内。使 用巿售仪器获取细胞学动态信息。见图67~70,所获信息提示同一处方的中 药复方不同生产厂家的制品，也存在明显差异。
实例十二冬虫夏草A549细胞株动态信息的数字和条码获得
1. 取96孔检测板，在每孔中加入50ulA549细胞株培养基，检测基线，接 入A549细胞，使每孔细胞浓度为1000 ~ 10000个/100ul，置于测试台放入二氧 化碳培养箱开始检测。细胞生长18~24小时后，将细胞置于无血清培养基中2 小时后加入被测试样品。
2. 中药材提取
取不同产地冬虫夏草(青海果洛州、西藏那曲地区各县5处、青海海南州 同德县、青海海南州、青海海南州祈连县、青海玉树地区各县3处、云南玉龙)
烘干，打粉，分别称取O. 09g。力口lmL纯净水，浸泡30分钟，超声10分钟，沸 水加热20分钟，3500转/分离心15分钟，取上清液备用。
3.微量中药材提取液介入细胞培养
取冬虫夏草提取液10uL，加入96孔板除对照组外的相对应孔内。使用巿售 仪器获取细胞学动态信息(见图71)。冬虫夏草A549细胞株细胞学动态信息用 以下预先设定的公式和条件(编制成软件)转换成中药材象征标记的数字或条 码。
1. 选取横坐标的8 10个时间区间(8~10个数位)的细胞学信息，用0~ 9数字和A Z或相应的条码表示。
2, 以无中药材为对照的细胞学动态信息为参照点。
经统计方法处理，道地药材冬虫夏草的A549细胞株动态信息用数字 CHC765467和条码(见图72 )表示。
权利要求
1、一种基于细胞学动态信息集成鉴别道地中药材的方法是指利用高通量技术手段获取的一种或多种细胞学动态信息集成鉴别各种道地中药材。
2、 权利要求1所指的高通量技术手段是以现代分子生物学和细胞生物学为基础建立的快速、微量、体外筛选模型和测试方法，并结合自动化技术发展起 来的已商品化的巿售技术平台或仪器。
3、 权利要求l所指的一种或多种细胞是分离自人体或动植物或微生物的各 种组织和器官的细胞，包括原代培养细胞，也可以是巿售的永生化细胞和基因 改造过的细胞。
4、 权利要求1所指的细胞学动态信息集成是指可以被各种巿售高通量检 测仪器捕获的各种细胞学的动态信息，包括细胞增殖、细胞运动、细胞粘附、 细胞分化、细胞凋亡、细胞衰老、细胞变异、细胞存活、细胞毒性、细胞形态 等细胞学指标的动态变化。
5、 权利要求1所指的细胞学动态信息集成是指经由各种巿售高通量检测仪 器捕获的单一或各种细胞学所组合构成的数值。
6、 权利要求1所指的鉴别道地中药材是指用细胞学不同的动态信息集成用符。
7、 权利要求l所指的道地中药材，是指古代近代(1949年前)和现代中医 药书籍记载的中国单味中药材的物种和生长地，或它们的复方制品，可以是它 们的替代物。
8、 权利要求2所指的高通量是指一次(批)实验量可以是16个或16个以 上的样品。
9、 权利要求2所指的快速、微量是指在120小时内， 一次细胞学测试所用 的样品在100亳克以内。
10、权利要求5所指的细胞学所组合构成的数值是指单独或组合构成一系 列生物功能标记符(functional signature ),可以经各种统计学分析方法转 换成数学矩阵表示，也可以转换成3个以上数字或字母构成的条码表示，赋予 一种或一类中草药及其代谢产物或其复方制品的特有信息，作为它们的各种生 物功能或药效的象征标记或识别标志。
11、 权利要求6所指的区别道地中药材的同种物种不同产地及不同物种不同 产地的生物功能标记符可作为一种或一类中药材及其代谢产物质量标准的鉴别 项目。
12、 权利要求7所指的各种道地中药材和饮片是指野生或饲养的动物，野生 或栽培的植物，野生或培养的真菌和微生物，以及它们的代谢产物，也可以指 它们的单味的药材和饮片或多味的复方制品，包括它们组成的中成药。
13、 权利要求7所指的各种道地中药材是指使用一种或多种不同溶媒的提取物和不同含量能改变或不改变一种或多种细胞信息的物质。
14、 权利要求10所指的经各种统计学分析方法转换成数学矩阵表示，是指 经捕获的各种细胞和各种中草药的集成信息，将空白对照组的加样前细胞信息 集成数值设为1.0，再按取3个以上的培养时间点所对应的对照组数值(C。)和 加样后的数值(CJ，计算A《i/C。，A值取两个有效数字，小于1.0的，用小数 点后第一位数字表示，A值等于l.O，用字母A, A值等于l.l的，用B表示，A 值等于1.2的，用C表示，依此类推用D， E， F， G……表示。
15、 权利要求10所指的使用一种或多种细胞学动态信息的象征标记用于指 导中国道地药材、中药材和天然药物的选种、选地、栽培或养殖或培养(克隆)、 采集或终止培养、加工的质量标准的控制指标。
16、 权利要求IO所指的一种或多种具有细胞学动态信息的象征标记可以作 为指标或模型分离中药的有效组分和有效成分。
全文摘要
一种基于现代分子生物学和细胞学而建立的快速、微量、体外筛选模型的高通量技术方法，使用一种或多种分离自人体或动植物或微生物的各种组织和器官细胞，被市售检测仪器捕获的各种细胞学的动态信息，经统计学分析方法转换成数学矩阵或数字或字母构成的条码表示，作为一种或一类中草药及其代谢产物或其复方制品的各种生物功能或药效的象征标记或识别标志；用于鉴别道地中药材及其所组方的中成药，区别同种物种不同产地、不同物种不同产地的中药材；用于指导中药材选种、选地、栽培或养殖或培养(克隆)、采集、加工的控制指标；作为一种或一类中药及其代谢产物质量标准的鉴别项目；作为分离中药或中成药的有效组分或有效成分的指标或模型。
文档编号C12Q1/04GK101182567SQ200710156900
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月23日 优先权日2007年11月23日
发明者傅惠英, 寿旗扬, 杨国良, 柯传奎, 柯越海 申请人:柯传奎