专利名称：治疗、预防和诊断猪ttv感染的方法
技术领域：
本发明总体上涉及病毒病原体。具体说，本发明涉及猪托克特诺病毒 (Torque teno virus, TTV);治疗、预防和诊断猪感染TTV和猪TTV相关 疾病的方法，以及用于研究TTV和TTV相关疾病的动物模型。
背景技术：
托克特诺病毒OTV)也称为输血传播性病毒，属于艾内罗浮动病毒属 (Anellovirus floating genus)，以前曾称为环病毒科(Circoviridae)。 TTV最初 分离自输血后未知病因的肝炎病人的血液。Nishizawa等，Aoc/ em.6/o/ /y^， i "Cowmm(1997) 211:92-97。也已在除人类以外的一些动物包括猪中鉴定 到TTV。在几个国家已分离到猪TTV，序列分析显示TTV不同病毒株的核 苷酸序列相同性在71%-100%之间。Mckeown等，rw.M/craWo/ (2004) 104:113-117。
TTV是一种小的无包膜病毒，具有负极性单链环形DNA基因组。其 基因组包含一非翻译区和至少三个主要的重叠开放读框。Biagini.P., r"M/cro6/0/ (2004) ￡^:95-101。 ORF1编码DNA复制酶，ORF2编码核衣 壳蛋白，ORF3编码具有凋亡活性的蛋白。
TTV感染的人常常无症状，但TTV病毒血症发生率在各种不同临床疾 病，包括病毒性肝炎、HIV/AIDs、哮喘和儿童相关呼吸道疾病及肾病病人 中倾向于升高。然而，对照组人群无症状TTV病毒血症的高发生率，TTV病毒科内基因组的显著多样性，在体外此病毒不能增殖和缺乏TTV疾病的 动物模型使得将TTV感染与人类疾病相关联的尝试遇到困惑(Yzebe等， 尸fl麵鮮va 她d. (2002)44:167-177; Biagini,P., F^.m/cro編 (2004) ^:95-101)。虽然看来TTV是通过口鼻或粪-口传染而获得的，但也已证明 其可经母-婴和/或子宫内传染。(Geraer等，尸W./"/e"力&J. (2000) 1^:1074-1077)。感染者的特征是长期(数月至数年)TTV病毒血症。人类可 能感染一种以上基因型的TTV(Saback等，ScW.,/"/e".Z^. (2001) 11:121-125)。 一个提议是这些基因型可能是在受感染的人体内重组产生的 (Rey等，/w/e"(2003)li:226-233)。虽然此资料可能有片面性，但也有证据说 明在感染过程中可产生对TTV病毒衣壳蛋白的抗体应答，受感染个体可产 生循环性TTV-抗体免疫复合物((Yzebe等，尸awm/"en^ me《2002) 41:167-177; Biagini,P., m/croWo/(2004)^:95陽101)。虽有报导说病毒DNA 的水平每毫升可达到10"个拷贝(Rey等，/"/e"(2003)U:226-233)，但大多数 研究者采用灵敏度较高的套式聚合酶链反应(PCR)来监测血清和组织提取 物中的TTV DNA。靶序列可不同，但DNA基因组非翻译区(UTR)特异性 的引物对具有最广泛的活性，可用于筛选可能包含多种TTV基因型的疑似 样品。(Rey等，/"/e"(2003)li:226誦233 ; Leary等，J,Ge".^Vo/ (1999) M:2115-2120)。由于已在肝脏、外周血单个核细胞和骨髓中发现双链同种 型(复制性)中间体，推测这些是该病毒在体内复制的部位(Kikuchi等， ,A/ec/.K/ra/ (2000) ^i:165-170; Okamoto等，5/oc/zem.5/o; /z;^.7 e&Commw". (2002)，:657誦662; Rodriguez-Inigo等，v4/nJ.尸^/zo/.(2000)156:1227-1234)。 因为疾病过程和症状与TTV不直接相关，大多数学者认为TTV是人类和 动物的"孤儿(orphan)"或无毒病毒，即一种仍然有待弄清楚与给定疾病相 联系的病毒(Biagini,P., P^.w/cro6/o/.(2004) 丝:95墨101 ; Irshad., 『orWJ.Gw^oe"/ero/. (2006) U:5122-5134; Simmonds等，(1999) 巡:1748-1750; Zein，N,， /尸eW^ (2000) ^:379-383; Beninelli等，C//". M/cro嵐i^ (2001)11:98-113)。
猪TTV是一种普遍存在的病毒，收集自不同地理区域的血清样品用 PCR检测到此病毒表明其在猪中的流行率为33%-100%。 Mckeown等，W.M/cro6/0/.(2004) 104:113 -117。已在猪中鉴定到二种基因(l和2)型(Neil 等，/Ge".P7ro/.(2005)M: 1343-1347);大约一半受检的猪血清含有此二种 TTV基因型(Kekarainen等，^>o/,(2006)^2:833-837)。已报导患断奶后 多系统衰竭综合征(PMWS)的猪血清TTV感染患病率较高(Kekarainen等, /Ge".Wra/.(2006)^2:833-837)。然而，未能证明PMWS临床症状与TTV之 间的相关性。还有，患PWMS的猪中对PWMS疾病状态没有影响的其它病 毒感染的发生较高。Segales和Domingo.,g.(2002)2i:109-124。因此，猪 TTV与任何特定病理学之间的关系迄今仍不清楚。而且TTV与其它病原体 在共同感染中的作用仍待阐明。
猪环病毒-相关疾病(PCVAD)，也称为猪环病毒疾病(OCVD)，指猪的 一种复杂疾病，包括猪环病毒2型(PCV2)，其原发疾病表现为在伴有PCV2 肺部病损的正成长和养肥猪中的断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)、肠炎、 呼吸道疾病以及猪皮炎和肾病综合征(PDNS)。看来PCVAD需要多种病原 因子才能发生。例如，PCV-2是其中的一种因子，但罕见它本身就足以引 起临床疾病症状。其它感染因子似乎是必须的，如猪生殖和呼吸道综合征 病毒(PRRSV)、猪流感病毒和支原体肺炎。环境应激因子也是发生PCVAD 的因素。
所有这些协同因子的共同潜在特征是上调康复期的免疫应答，其表现 为全身淋巴组织的反应性肥大和增生。用强佐剂(不完全弗氏佐剂)乳化免疫 原进行的免疫接种模拟了这种淋巴增殖反应，已被用于在缺乏其它猪感染 疾病因子的PCV2-感染悉生(gnotobiotic)小猪中诱导PWMS (Krakowka 等，F&P"/;w/(2001)M:31-42)。在现场用某些猪肺炎支原体菌苗免疫接种的 小猪中(Kyriakis等，,Com/ .尸^/K /. (2002) 126:38-46)和实验(Krakowka等, Caw.(2007) ^:716-724)条件下也观察到此作用。
然而，许多PMWS的流行与已知的猪传染病、处理或接种疫苗的改变 无关，观察提示此复杂疾病还有未鉴定出来的因素在起作用。
这些相关疾病已迅速成为对美国和其他国家猪健康的主要威胁。如今 全球面临着PCVAD的严重流行，包括加拿大、美国、远东、新西兰和欧 洲，这严重影响到猪的供应。患病率18-50%，可能升高到70%;死亡率约4-30%，发作时超过50%。Miller,M.，猪肉杂志fPoAMagaz/"e),"PCVAD:什 么是已知的和未知的(PCVAD: What's Known and Unknown)"(2006年7月1曰)。
由于PCVAD对经济的巨大冲击，需要治疗、预防和诊断其感染的方法。
发明概述
本文中发明人令人惊讶地将TTV与PWMS相联系，提出TTV是另一 种能促进PCV2-诱导PWMS的感染性病毒。此发现的证据是TTV促进了 猪的其它一种感染因子导致的相关临床症状，因此可用于开发抗PCVAD 的疫苗。以下显示gl-TTV感染对PCV2-诱导的PCVAD的表现的可能影响。 另外，业已发现在双重感染小猪中，感染顺序决定了疾病的临床表现。
本发明人也制备了 TTV感染的动物模型。具体说，在PCV2阴性的健 康猪血清中，nPCR检测显示存在猪基因型1 TTV(gl-TTV) DNA，以及用 感染了病毒的悉生猪TTV-阳性血浆几次传代可检测gl-TTV的感染性。在 TTV-感染的悉生猪中观察到可重复的病损谱，但在无感染的对照悉生小猪 中不存在这种病损。TTV能在猪中复制的证据是，用常规PCR方法不难检 测出血清TTV DNA。因此，本发明人第一次证明在TTV是病原体的任何 物种中，如果可以适当操纵宿主状态的话，其即为(感染的)起源宿主动物。 然而，如以下进一步描述的那样，悉生猪和TTV感染猪可提供猪和人类TTV 感染的动物模型。悉生生物学提供了研究TTV的新方法。使用悉生动物可 排除环境影响，包括实验对象在居住环境中不慎感染了 TTV。在病原体感 染的悉生动物中观察到肉眼可见的组织学改变，这直接反映了致病因子与 宿主之间的相互作用，这是明确的，不会因外部变化如共生和并存的感染、 饮食差异和环境压力而造成混乱。
因此，本发明涉及用TTV制品来治疗、预防和/或诊断TTV-相关疾病， 如治疗、预防和/或诊断PCVAD-相关疾病，包括成长和育肥猪的PMWS、 PCV2、 PDNS、生殖疾病、肠炎和呼吸道疾病。可用减毒、灭活或亚单位 疫苗，包括猪TTV分离物来源的免疫原或免疫原混合物来提供抵抗今后TTV感染的保护力，从而可用于保护抵抗与TTV感染有关的疾病。因而本 发明提供了治疗、预防和/或诊断猪TTV感染的商业化有效方法。
因此，在一实施方式中，本发明涉及包含药学上可接受的运载体和至 少一种猪TTV免疫原的组合物，所述TTV免疫原选自灭活的免疫原性 猪TTV，减毒的免疫原性猪TTV和分离的免疫原性猪TTV多肽。在某些 实施方式中，此组合物还包含佐剂。
在其它实施方式中，本发明涉及治疗或预防猪对象TTV感染的方法， 该方法包括给予猪治疗有效量的上述组合物。在某些实施方式中，PCVAD 是断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)和/或猪皮炎和肾病综合征(PDNS)。
在还有的其它实施方式中，本发明涉及生产组合物的方法，该方法包 括(a)提供选自灭活的免疫原性猪TTV，减毒的免疫原性猪TTV和分离的 免疫原性猪TTV多肽的至少一种猪TTV免疫原，和(b)将此TTV免疫原与 药学上可接受的运载体组合。在某些实施方式中，此方法还包括提供佐剂。
在某些实施方式中，上述方法中所用的组合物包含引起猪疾病的其它 病原体的免疫原，例如但不限于猪细小病毒、猪环病毒(circovirus)、猪生 殖和呼吸道综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒、引起猪发热的猪瘟病 毒、猪嗜淋巴疱疹病毒(PLHV1和PLHV2)、支原体、缠绕杆菌、弯曲杆菌 (cam; y/o6a"e/" sp; )、 胞内劳森菌(/awyo"/a 、 胸膜月巿炎放线菌 (ac""o6acz'〃1^ / /ewropwewmom.ae)、畐l)猪嗜血杆菌(/ aewop/n7^/7araw/力、链 球菌、巴斯德菌(p(xste群〃a卿)、沙门菌、大肠杆菌、梭菌(c/o血Wwm鄉)、 红斑丹毒杆菌(er_y，/o,/zr/x r/m"opfl^z/ae)的免疫原。
在其它实施方式中，本发明涉及检测脊椎动物对象TTV感染的方法， 包括(a)提供对象的生物学样品，和(b)在生物学样品中存在的TTV抗体能与 分离的猪免疫原性TTV多肽结合的反应条件下，使生物学样品与至少一种 TTV多肽反应，从而检测该对象是否有TTV感染。在某些实施方式中，该 方法还包括(c)除去未结合的抗体；(d)提供一种或多种能与所述结合抗体缔 合的分子；和(e)检测该一种或多种分子是否存在，从而检测是否存在TTV 感染。
在某些实施方式中，可检测标记是荧光素(fluorescer)或酶。在其它实施方式中，所述生物学样品是猪血清样品。
在还有其它实施方式中，本发明涉及用分离的猪TTV感染TTV-阴性
的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体的小猪、或剖腹产小猪的方法。该
方法包括(a)分离对象猪的TTV;和(b)给予小猪足以引起TTV感染的剂量 的此TTV分离物。
在其它实施方式中，本发明涉及评价疫苗预防TTV感染的能力的方法， 该方法包括(a)给予对象猪一种候选疫苗；(b)使步骤(a)的对象猪接触剂量足 以引起未接种疫苗猪感染的猪TTV分离物；和(c)观察该对象猪中TTV的 感染发生率，从而评价该候选疫苗预防TTV感染的能力。在某些实施方式 中，所述对象猪是TTV-阴性的幼猪、隔离屏障词养的无特定病原体小猪、 或剖腹产小猪。
在另一实施方式中，本发明涉及评价疫苗预防PCVAD的方法，该方 法包括(a)给予对象猪一种候选疫苗；(b)使步骤(a)的对象猪接触剂量足以引 起未接种疫苗猪感染的猪TTV分离物；和(c)观察该对象猪中PCVAD的发 生率，从而评价该候选疫苗预防PCVAD的能力。
在某些实施方式中，所述对象猪是TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的 无特定病原体小猪、或剖腹产小猪。在其它实施方式中，所述PCVAD是 PMWS、 PCV2禾口/或PDNS。
在另一实施方式中，本发明涉及鉴定能治疗猪TTV感染的化合物的方 法。该方法包括(a)使TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小 猪、或剖腹产小猪接触足以引起小猪感染剂量的猪TTV分离物；(b)向感染 小猪递送某化合物或一系列化合物；(c)检测与未治疗的TTV-感染小猪相 比，步骤(b)的小猪是否存在TTV，和/或是否发生、抑制或改善了PCVAD 症状。
本文所涉及领域的技术人员不难理解本发明的这些和其它实施方式。 发明详述
除非另有说明，可采用分子生物学、微生物学、细菌学、病毒学、重 组DNA技术和免疫学的常规技术实施本发明，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中有这些技术的全面解释。参见例如Sambrook，Fritsch 和Maniatis的"分f实毅室手iT最新版；"基鄉谅毒学(Fw^ame"M/ K>o/ogy/，最新版第I和II巻(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；"DA^4克廣"第 I和II巻(D.N. Glover编，最新版)；"寡核苷酸合成"(M丄Gait编,1984); "孩糜染文"(B.D.Hames & S丄Higgins编，1984);动笏^應潜^ (R.K.Freshney编，1986); " y^定游^^應^7Jff7mmoW"zed ￡"z_yme""
IRL出版社,1986); Perbal，B.的"分f克廣实嫂^廢^尸rac"ca/ G^We M mo/ecw/ar C/o"/"g」"(1984)系列丛书；"艨学方法"(S.Colowick and N.Kaplan编，学术出版公司；和"实验i资学手iT第I-IV巻(D.M.Weir C.C.Blackwell编"1986，布莱威尔科学出版社(Blaekwell Scientific Publications))。
本文引用的所有出版物、专利、专利申请的内容作为参考纳入本文。 l.定义
在本文的描述中采用的以下术语具有如下定义。
必须注意，在本说明书和附件权利要求书中所用的单数形式"一种" 和"该种"包括其复数形式，除非其内容另有清楚说明。因此，例如"一 种TTV免疫原"包括二个或多个这种免疫原的混合物等等。
"TTV感染"指由托克特诺病毒直接或间接引起的疾病，包括但不限 于任何已知的TTV病毒株和任何TTV基因型分离物所引起的感染。近年 来已将此病毒细分为大约40个基因型，属于5个明显不同的种系发生簇中 的群，称为l-5群(Biagini等，"艾内罗病毒(Anellovirus)"，刊登在Fauquet 主编的"嫁毒分类学，第S眉疯毒分类学像y^会议叛告"335-341页， Elsevier/Academic出版社，纽约(2004); Devalle和Niel.， J.M^/. J^o/. (2004) 21: 166-173; Hino，S.， i ev.Me《^>o/.(2002) U:151-158; Nishizawa等， 5/oc/zem.5/o/ /y^./ e&Comwim.(1997) 241:92-97 ; Okamoto 禾口 Mayumi.， G。^"oe"^n9/.(2001巡:519-529; Peng等，Ac/;, 02) 147:21-41)。具体 的猪分离物包括但不限于Sd-TTV31、 Sd-TTVlp、 Sd-TV2p、 TTV分离物 3h和2h(例如，参见Niel等，乂Ge". J^>o/.(2005) M:1343-1347; Okamoto等,/Ge".^>o/. (2002)^1:1291-1297)。这类疾病包括但不限于猪环病毒相关 疾病(PCVAD)，如猪环病毒2型(PCV-2)，成长和育肥猪的断奶后多系统衰 竭综合征(PMWS)、肠炎和呼吸道疾病，生殖疾病，以及猪皮炎和肾病综合 征(PDNS)。
该术语也指亚临床(sub-clinical)疾病，如存在TTV感染，但本身不表 现出疾病的临床症状。亚临床疾病的对象可以无症状，但处在发生以上任 何疾病的危险中。
"幼猪"指出生至6周龄，优选出生至3周龄的小猪。
术语"多肽"用于指TTV免疫原时，指由任何TTV病毒株衍生的天 然、重组或合成的免疫原。所述多肽不需要包含参考分子的全长氨基酸序 列，但如以下所述，可只包含保留了该多肽分子的免疫原性和/或治疗、预 防或诊断TTV感染能力所必须的序列。因此只存在参考分子的一个或几个 表位。另外，该多肽可包含全长参考分子或参考分子某片段与不会破坏该 TTV多肽反应活性的另一种蛋白之间的融合蛋白。不难明白，该多肽可包 含全长的序列、片段、截短的和部分序列，以及所述参考分子的同类物和 前体形式。该术语也包括所述参考分子中的缺失、添加和取代，只要该多 肽保留了免疫原性。
因此，本文可以采用所述天然序列的全长蛋白和其片段，以及含修饰 的蛋白，如缺失、添加和取代(保守或非保守性质)，只要所述蛋白维持了所 需活性。这些修饰可以是仔细考虑过的，如通过定点诱变；或可以是偶然 的，如通过宿主的突变产生的蛋白，或由于PCR扩增错误产生的蛋白。因 此，本文考虑采用基本上与亲代序列同源的这种活性蛋白，如具有70%、 80%、 85%、 90%、 95%、 98%、 99%等相同性的保留了生物学活性的蛋白。
术语"同类物"指保留了以上所述参考分子的生物学活性的衍生物， 或这类衍生物的片段。术语"同类物"通常指具有天然多肽序列和结构但 相对于天然分子含有一个或多个氨基酸添加、取代和/或缺失的化合物。特 别优选的同类物包含性质保守的取代，即发生在同家族氨基酸中相对于其 侧链的那些取代。具体说，氨基酸通常分成4个家族(l)酸性一天冬氨酸 和谷氨酸；(2)碱性一赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(3)非极性一丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；和(4)无
电荷极性一甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、 酪氨酸。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时分类为芳族氨基酸。例如，可合 理地预计，分别用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸，用谷氨酰胺取代天冬酰 胺，用丝氨酸取代苏氨酸，或用结构相关的氨基酸类似地保守性取代某氨 基酸对其生物学活性不会有显著影响。例如，所述感兴趣多肽可包含最高
约5-10个保守性或非保守性氨基酸取代，或甚至最高达约15-25或50个保 守或非保守性氨基酸取代，或5-50个之间的任何数目的取代，只要保留了 该分子的所需功能。
"纯化的"蛋白或多肽是重组或合成产生的，或分离自天然宿主的蛋 白，因此，组合物中存在的蛋白质的量显著高于粗制品中存在的量。通常 纯化的蛋白至少约50%均质，更优选至少约80%-90%均质。
"生物学活性"指TTV蛋白能诱以下所述的免疫应答反应。
"亚单位疫苗组合物"指含TTV衍生的免疫原或与其同源的至少一种 免疫原，但不是所有免疫原的组合物。这种组合物基本上不含完整的病毒。 因此，可用至少部分纯化的(优选基本纯化的)TTV免疫原，或其重组同类 物来制备"亚单位疫苗组合物"。亚单位疫苗组合物可包含基本上没有其 它病原体的抗原或多肽的感兴趣亚单位抗原。代表性的免疫原包括TTV基 因组任意0RF1、 2或3产生的免疫原，如0RF2产生的免疫原，即核衣壳 蛋白，包括其全长蛋白或片段。而且，此亚单位组合物中也可存在多种基 因型TTV病毒或病毒分离物产生的免疫原，例如猪基因型1和2的ORF2 表达的蛋白(Neil等,《/r/ro/.(2005)M:1343-1347)以及TTV或其它病毒的 其它免疫原。还考虑可采用基于TTV多种基因型，例如但不限于TTV基 因型1和2的任意ORF的共有序列。
"表位"指抗原中能引起特异性B细胞和T细胞应答的位点。此术语 也可与"抗原决定簇"或"抗原决定位点"互换使用。 一个表位可以包含 该表位空间构象所独有的3个或多个氨基酸。通常一个表位包含至少5个 氨基酸，更常包含至少8-10个氨基酸。测定氨基酸空间构象的方法是该领 域已知的，包括例如，X-光晶体学和2-维核磁共振。另外，采用该领域熟知的技术，例如采用疏水性研究和定点血清学不难鉴定给定蛋白质中的表
位。也参见Geysen等，尸rocA^/Jcad.Sc/.t7&4(1984)81:3998-4002(快速合成
肽来测定给定抗原中免疫原性表位的位置的一般方法)；美国专利 No.4,708,871(鉴定和化学合成抗原表位的方法)；和Geysen等，Mo/ecw/ar /mmmo/ogy(1986)23:709-715(鉴定对给定抗体具有高亲和力的肽的技术)。 可在单一种免疫试验中鉴定能识别相同表位的抗体，显示一种抗体能否阻
断另一种抗体结合靶抗原。
对某组合物或疫苗的"免疫应答"是宿主产生了对感兴趣的该组合物 或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常"免疫应答反应"包括但不 限于以下一种或多种作用产生对感兴趣的该组合物或疫苗所包含抗原的 特异性抗体、B细胞、T辅助细胞、T抑制细胞和/或细胞毒T细胞，和/或 TyS细胞。优选该宿主将显示对所述TTV免疫原产生保护性的免疫应答反 应，例如该宿主受到保护避免了随后该病原体的感染，证明这种保护表现 为受感染的宿主通常症状减轻或缺乏，或康复时间更快。
术语"免疫原性"蛋白或多肽指能诱导上述免疫应答的氨基酸序列。 如本文所用，"免疫原性"蛋白或多肽包括所述具体TTV免疫原的全长序 列，包括任意前体和成熟形式、其同类物，或其免疫原性片段。"免疫原 性片段"指所述TTV免疫原的片段，其包含有一个或多个表位，因此能诱 导上述免疫应答反应。
用于本发明目的的免疫原性片段通常至少长约2个氨基酸，更优选至 少长约5个氨基酸，最优选至少长约10-15个氨基酸。此片段的长度没有 严格的上限，可包含接近该蛋白全长的序列，或是包含所述TTV免疫原的 2个或多个表位的融合蛋白。
"同源性"指二条聚核苷酸或二条多肽之间的相同性百分比。当二条 DNA或二条多肽的序列显示在限定分子长度上至少约50%,优选至少约 75%，更优选至少约80%-85%，还要优选至少约90%，最优选至少约 95%-98%序列相同时，这两个序列"基本上同源"。如本文所用，基本上 同源也指序列显示与特定的DNA或多肽序列完全相同。
通常"相同性"指二条聚核苷酸或二条多肽序列相应的核苷酸与核苷酸，或氨基酸与氨基酸分别精确相同。可通过将二种分子的序列分成长度 较短的序列，进行排列对比直接比较，精确计算二条序列相匹配的数目， 结果乘以100，来测定相同性百分比。可利用目前可得到的计算机程序来帮
助分析，例如ALIGN, M.O.Dayhoff主编的"蛋白质序列和结构的图册G4"w
iSVrw由W， ， Dayhoff，M.O，增补本5期，2: 353-358， 国立生物医学研究基金会(National biomedical Reseach Foundation),华盛顿 DC，对于肽分析，其采纳了 Smith和Waterman的局部同源性算法，^/v朋ce /"^/7/.MflAj:482-489,1981。测定核苷酸序列相同性的程序可获自威斯康 新序列分析软件包第8版(获自美国威斯康星州麦迪逊的遗传学计算机小组 (Genetics Computer Group ， Madison,WI)，例如BESTFIT、 FASTA和GAP 程序，它们也依赖于Smith和Waterman的算法。采用厂商推荐的默认参数， 按照上述威斯康新序列分析软件包的说明不难使用这些程序。例如，可采 用Smith和Waterman同源性算法中6个核酸苷位置的默认评分表和空格罚 分，测定某具体核苷酸与参比序列的相同性百分比。
本发明说明书中测定相同性百分比的另一种方法是采用爱丁伯格大学 版权所有，由John F.Collins和ShaneS.Sturrok开发的，加利福尼亚州芒廷 维尤的IC公司(IntelliGenetics， Mountain View, CA))分发销售的MPSRCH 程序包。这套软件包中采用Smith-Waterman算法，可采用评分表中的默认 参数(如开放空格罚12分，延伸空格罚l分， 一个空格罚6分)。从数据产 生的"匹配"值反映了 "序列相同性"。计算序列之间相同性或相似性的 其它合适的程序一般是该领域知道的，例如，另一种采用默认参数的排列 对比程序是BLAST。例如，可用的BLASTN和BLASTP采用以下默认参 数遗传密码=标准；过滤=无；链=二条；截断值=60;期望值=10;矩阵 =BLOSUM62;描述=50条序列；检索-HIGH SCORE;数据库=非丰余， GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS 翻译十Swiss 蛋白 +Spupdate+PIR。这些程序的细节是该领域熟知的。
或者，可在二条聚核苷酸同源区之间能形成稳定双链体的条件下使它 们杂交，然后用单链特异性核酸酶消化，测定消化片段的大小，来测定同 源性。例如在特定系统规定的严谨条件下进行Southern杂交实验来鉴定DNA序列是否基本上同源。确定合适的杂交条件在该领域技术人员的能力 范围内。参见例如Sambrook等，同上；"DM4克潑"，同上； 文"，同上。
"编码序列"或"编码"所选多肽的序列是一种核酸分子，当将其安 置在合适控制序列的控制下，在体外或体内能转录(对于DNA)和翻译(对于 mRNA)成为多肽。编码序列的二边界由其5'(氨基)末端的起始密码子和 3'(羧基)末端的翻译终止密码子所确定。转录终止序列可位于编码序列的3' 端°
"载体"指遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病 毒、病毒颗粒等等，当将它们与适当的控制元件相连时能够复制并能将基 因序列转移给细胞。因此，该术语包括克隆载体和表达载体，以及病毒载 体。
"重组载体"指包含了能在体外或体内表达的异源核酸序列的载体。 术语"转染"用于指细胞摄入外源DNA，当外源DNA被引入细胞膜 内侧时细胞即被"转染"。该领域知道有许多转染技术，参见例如Graham 等,(1973)J^o/ogy, H:456; Sambrook等,(1989)"分f克廣，实殺室手，"， 冷泉港实验室(Cold Spring Harbour Laboratories),纽约；Davis等.(1986)"分 f生激学游基本方法"，Elsevier;和Chu等(1981)Ge"eJl:197。可利用这 些技术将一种或多种外源DNA分子引入到合适的宿主细胞中。
术语"异源性"指正常时不是连接在一起和/或正常时与特定细胞无关 的核酸序列，如编码序列和控制序列。因此，某核酸结构或载体中的"异 源区"是天然与另一种分子无关的其他核酸分子内或与其相连的核酸区段。 例如，核酸结构中的异源区可包括编码序列侧接了天然状况下与该编码不 相连接的序列。异源编码序列的另一个例子是在天然状况下本身不存在的 编码序列(如含有不同于天然基因的密码子的合成序列)。类似地，用细胞在 正常状况下不存在的结构转化细胞应认为是符合本发明目的的异源结构。 等位基因变体或天然发生的突变不能算是这里所说的异源DNA。
"核酸"序列指DNA或RNA序列。此术语的序列包括已知的DNA 和RNA碱基同类物的任何序列，例如但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、氮丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶、5-
氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲 基尿嘧啶、二羟尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基 假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、l-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、 2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟 嘌呤、5-甲基氨基甲基尿啼啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、(3-D-甘露 糖基Q核苷(queosine)、 5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲 基硫-N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、氧 基丁氧核苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫 尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、 尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。
集合名词术语DNA的"控制序列"指启动子序列、聚腺苷酸信号、转 录终止序列、上游调节区、复制起点、核糖体内部进入位点("IRES")、 增强子等等，它们共同实现了编码序列在受体细胞中的复制、转录和翻译。 并非需要总是存在所有这些控制序列，只要所选择的编码序列在适当的宿 主细胞中能被复制、转录和翻译即可。
术语"启动子"本文采用其普通含义，指包含DNA调节序列的核苷酸 区域，此调节序列源自能够结合RNA聚合酶和启动下游(3'-方向)编码序列 的转录的基因。转录启动子可包括"可诱导启动子"(可用分析物、协同因 子、调节蛋白等诱导与该启动子操作性相连的聚核苷酸序列表达)、"阻抑 型启动子"(可用分析物、协同因子、调节蛋白等诱导与该启动子操作性相 连的聚核苷酸序列表达)和"组成性启动子"。
"操作性相连"指各元件的安排使得所述各组分能执行它们通常的功 能。因此，与某编码序列操作性相连的控制序列能够影响该编码序列的表 达。控制序列不需要与编码序列毗连，只要它们能发挥功能指导其表达。 例如，在启动子序列与编码序列之间可存在插入的不翻译、不转录序列， 该启动子序列仍认为是"操作性相连于"该编码序列。
在本申请书中为了便于描述特定核酸分子中核苷酸序列的相对位置，
例如当所描述的特定核酸苷位于另一序列的"上游"、"下游"、"3引物(3')"或"5引物(5')"时，应理解为此序列的位置是DNA分子的"有义" 链或"编码"链，参见该领域常规。
本文提供的术语，某组合物或药物的"有效量"或"治疗有效量"指 该组合物或药物能提供所需"治疗效果"，如诱导上述的免疫应答，优选 预防、减轻或逆转TTV感染相关症状的无毒但足够的量。这种效果可以是 改变疾病向所需的结果或终点发展，从而使对象的疾病显示出改善，这常 常表现为疾病的相关体症或症状减轻。例如， 一种有代表性的治疗效果可 以是当对取自猪的样品作TTV培养时，对象猪的TTV感染为阴性。类似 地，组织活检表明有治疗效果是抗TTV的IgG、 IgM和IgA抗体产生降低。 类似地，血清抗TTV抗体降低表明有治疗效果。PCVAD-相关疾病的症状 减轻也表明有治疗效果。所需的精确剂量对象之间互不相同，取决于对象 动物的种类、年龄和全身状况，要治疗疾病的严重程度和给予的组合物的 具体成分，给药方式等等。本领域普通技术人员采用常规实验可确定个体 病例的合适"有效量"。
"治疗"或"处理"TTV感染包括(l)预防TTV疾病，或预防包含 其它病原体如PCV2的TTV-相关疾病，或(2)使接触TTV的对象猪的TTV 感染相关疾病发生率降低，(3)减少对象猪中存在的TTV含量，和/或改善 TTV感染相关的症状。
"生物学样品"本文用于指分离自个体的组织或体液的样品，包括但 不限于例如，血液、血浆、血清、粪便、尿、骨髓、胆汁、精液、淋巴液、 皮肤样品、皮肤外分泌物、呼吸道、肠道和泌尿生殖道样品、眼泪、唾液、 乳汁、血细胞、器官、活检样品，以及体外细胞培养样品，包括但不限于 用培养基培养的细胞(例如重组细胞)和组织生长产生的条件培养液，和细胞 成分。
"标记"和"可检测标记"本文用于指能被检测的分子，包括但不限 于放射性同位素、荧光素、化学发光素、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑 制剂、生色团、染料、金属离子、金属溶胶、配体(如生物素或半抗原)等等。 术语"荧光素"指能显示可检测范围荧光的物质或其一部分。可用于本发 明的标记物的具体例子包括荧光黄、罗丹明、丹磺酰、伞形酮、德克萨斯红、鲁米诺、阿克迪酯(acradimum ester)、 NADPH和a-(3-半乳糖苷酶。 2.实施本发明的方式
在详细描述本发明之前，应理解本发明不限于具体的制剂或工艺参数， 它们当然可以改变。也应理解本文所用术语目的只是为了描述本发明的具 体实施方式，不意味着限制本发明。
虽然实施本发明可采用类似于或相等于本文所述的一些方法和材料， 但本文描述的是优选的材料和方法。
本发明的中心内容是利用TTV和其产生的免疫原来开发用于疫苗和诊 断试剂的免疫原性组合物，以预防、治疗和诊断TTV感染。如以上所解释， TTV与PCVAD-相关疾病有关。因此。本发明提供预防、治疗和诊断这类 疾病，如PMWS和PDNS的组合物和方法。
可开发用于研究猪TTV感染的致病机理、治疗和预防TTV感染的新 的动物模型。例如，TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小猪、 或剖腹产小猪可用于研究各种TTV乙醚预防TTV感染的能力。此外，TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小猪、或剖腹产小猪也可用于 筛选能够治疗TTV感染的各种化合物。
为了进一步理解本发明，下面将关于动物模型、TTV免疫原及其各种 应用进行更详细的讨论。
TTV动物模型
猪是单胃杂食动物，胃部解剖学与生理学与人体非常接近。TTV-阴性 的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小猪、或剖腹产小猪适合研究TTV 感染，因而适合鉴定疫苗候选物，例如包含一种或多种源自TTV的免疫原 的疫苗，可用于预防猪的TTV感染。隔离屏障词养的猪没有影响个体牲畜 群的特定病原体。已经证明剖腹产小猪和隔离屏障饲养的小猪PCV和 PLHV的流行率非常低。参见例如Tucker等，Ze"Wra"s/ /a" a"o" (2003) 10:343-348。
因此，本发明优选利用动物模型来开发用于预防和/或治疗TTV感染的猪和其相关疾病的疫苗。
在此内容中，给予TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小 猪、或剖腹产小猪候选疫苗至少一次，优选再给予至少一次加强免疫。例
如，给予1-5日龄小猪待测试的疫苗组合物，然后于5-10天后给予加强， 任选第二次给予疫苗后5-10天进行第三次免疫。如需要可给小猪多次接种 疫苗。大约3-20天后，如最后一次免疫后4-10天，使接种疫苗的小猪接触 TTV。通常经胃肠道外或口服接种给予小猪10M()Spfu的TTV疫苗，更优 选105-107 pfu的TTV，并监测TTV感染指标。
这类指标包括TTV病毒滴度及PCVAD疾病症状，如PMWS症状、呼 吸道和肠道问题、消瘦、淋巴样病损、肉芽肿炎症、存在PCV2抗原和组 织病理学变化，及原位杂交检测PCV2。参见例如，Segales等，Sw/"e/^a欣 尸rod.(2002)边:277-281禾卩Rosell等，JCom; .尸W/w/.(1999)里:59-78。类似 地，可监测PDNS的症状。最明显的症状是猪皮肤常常出现轻度隆起的红-紫色疙瘩。这种疙瘩位于后腿、腰部、阴囊和耳部，但可延伸至腹部、腹 侧和前腿，最终覆盖全身。几天后病损结痂呈棕色。猪也出现昏睡和体温 升高。急性病例时猪腿肿胀导致跛行。也观察到呼吸窘迫和/或家畜腹泻。
或者，可先用TTV感染TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病 原体小猪、或剖腹产小猪以建立TTV感染。例如，给l-5日龄小猪经胃肠 道外接种TTV，其用量应足以引起感染，例如采用104-101()或更高pfu的 TTV，更具体用104-10"pfu的TTV接种。采用本领域熟知的PCR技术， 检査生物学样品如血清样品中有无病毒，和/或有无上述感染症状以证实 TTV感染的存在。
一旦确定有病毒感染，可在不同时间给予受感染小猪不同剂量的一种 化合物或一系列化合物，取决于筛选的具体目标。在这种方法的变化形式 中，可能需要给予TTV与化合物来确定与对照动物相比，该化合物是否能 在体内有效预防TTV病毒的初次感染/或预防随后的感染或病理过程。
因此，可以利用受感染小猪来筛选能预防TTV感染的化合物和条件， 如能阻断TTV进入宿主细胞和/或能减轻PCVAD-相关疾病所见到的TTV-相关变化的化合物和条件。通过在选择的时间检査受感染动物的生物学样
20品是否存在TTV和/或是否发生、抑制或改善了 PCVAD相关疾病(与相应 的对照动物，例如未治疗的TTV-感染动物作比较)来评估化合物的效果。 本文描述的动物模型能够根据不同的给药方式和化合物制剂，容易地评估 各种药物或化合物的效果。
除了利用TTV-感染动物来筛选治疗化合物外，也可利用这些动物来筛 选其作用是阻断或改善TTV感染和/或相关疾病的条件或刺激。这种刺激或 条件包括环境或饮食的变化，或导致动物应激状态的各种刺激或条件的联 合作用。例如，可使TTV-感染动物接触所选择的刺激或条件，或待测试的 刺激或条件的联合作用。然后定期检查接触动物的生物学样品中TTV数目 的变化和/或将相关疾病状态与未接触病毒的对照动物作比较。
TTV组合物
可利用本文所述的动物模型来鉴定TTV免疫原性组合物，用于诊断、 治疗和/或预防猪TTV感染。如以上所解释，用作疫苗和诊断的TTV组合 物可包含减毒或灭活的病毒。或者，也可提供包含分离的TTV免疫原，如 源自任何ORF的免疫原，特别是病毒ORF2编码的核衣壳蛋白的亚单位组 合物。也可用0RF1和ORF3产生的免疫原。也可利用包含源自多种基因 型，如猪基因型l和2的共有序列的蛋白质。
TTV组合物可源自任何TTV毒株和任何TTV基因型的分离物。已知 有许多TTV，其描述可参见Biagini等，"艾内罗病毒(Anellovirus)"，刊登 在Fauquet主编的"痨毒分类学，第S庙疯毒分类学房y^会议叛告"，第 335-341页，Elsevier/Academic出版社，纽约(2004); Devalle禾P Niel.， 丄Met/.KVo/. (2004)22: 166-173; Hino， S.,7 ev.MedK>o/.(2002) ]1:151-158; Nishizawa等，B/oc/^m.^/op/my./gM. Commww.( 1997)241:92-97; Okamoto和 Mayumi., GaWroeWero/. (2001) 1^:519-529;禾口 Peng等，Jn^.KVo/. (2002) 147:21-41。
具体的猪分离物包括但不限于Sd-TTV31、 Sd-TTVlp、 Sd-TTV2p、 TTV分离物3h和2h(参见例如，Niel等，^>o/.(2005)M: 1343-1347; Okamoto., Wro/.(2002)^1:1291-1297)。这些分离物的基因组序列，包
括分别编码DNA复制酶、核衣壳蛋白和凋亡序列的ORFl、 ORF2和ORF3序列例如在Niel等，^yo/.(2005)M: 1343-1347; Okamoto., /Ge". ^>o/, (2002) M:1291-1297以及在NCBI登录号AB076001 、 AY823991 、AY823990、 AY823989和AY823988中有所描述。登录号DQ229865和DQ229860分别 提供了猪基因型1 TTV和猪基因型2 TTV的序列。
可用各种技术来产生TTV免疫原，包括TTV全病毒。例如，可用该 领域熟知的技术直接从TTV-感染对象(如猪)分离得到TTV而获得此免疫 原。通常用聚合酶链式反应(PCR)技术来获得TTV DNA，包括T^qManTM 方法，采用源自TTV基因组序列的引物，其描述可参见Desai等， JMW.J^o/.(2005)22:136-143; Haramoto等，i e&(2005) !￡:2008-2013; Kekarainen等，JGe". P7ro/.(2006)^2:833陽837;和Martelli等，,F".MeA (2006) 11:234-238。
如此得到的TTV可在各种细胞系中复制，如肝细胞和白细胞系，包括 张氏肝细胞系、植物凝集素(PHA)-激活的外周血单核细胞(PBMC)培养物和 B淋巴母细胞系如Raji、 L23、 L35、 LCL13271细胞系。参见例如Desai.， JU.PW.(2005)22:136-143; Bonenfant等，X譜&謹卢齒细(2003) 辺:107-119;禾P Sinkora等，ye"mmw"o/./wmw"o; ^/z.(2001)^:79-91。各出版 物中描述了以上类型细胞的培养条件。适合所需应用的细胞培养条件(温 度、细胞密度、pH值等)变化范围很广，取决于所用的细胞系，不难适配成 符合所述TTV病毒要求的培养条件。在培养细胞中增殖TTV的方法包括 以下步骤用TTV接种培养的细胞，培养受感染的细胞到病毒增殖所需的 时间，例如通过病毒滴度测定或病毒抗原表达(如接种后24—168小时之间) 测定的时间，和收集增殖的病毒。用所需病毒接种培养的细胞，病毒与细 胞的比例(用PFU或TCID50测定)为1:500-1:1，优选1:100-1:5，更优选 1:50-1:10。将病毒加到细胞悬液中或加到单层细胞上，病毒吸附于细胞至 少60分钟但通常少于300分钟，优选25。C-40。C时90-240分钟，优选28 °C-37°C。通过冻融或酶作用除去感染的细胞培养物(如单层细胞)以提高收 获的培养上清液中的病毒成分。然后灭活或冻存收获的液体。
灭活或杀死病毒的方法是本领域已知的。这种方法破坏了病毒感染哺 乳动物细胞的能力。可用化学或物理方法灭活。灭活TTV的化学方法包括用有效量的以下一种或多种试剂处理病毒洗涤剂、甲醛、福尔马林、(3-丙内酯或UV光。本领域知道灭活病毒的其它方法，如二元乙胺、乙酰乙
烯亚胺处理或Y射线照射。
例如，可用浓度0.01%-0.5%，优选0.5%-0.2%，还要优选0.025%-0.1% 的(3-丙内酯。可在收获之前或之后将灭活制剂加到含病毒的培养物(病毒材 料)中。可直接使用培养物或破坏细胞以释放与细胞结合的病毒然后进行收 集。另外，可在培养物冻存和融化后，或在一步或多步纯化去除污染细胞 后加入灭活剂。在病毒材料中加入P-丙内酯，用氢氧化钠(如1NNaOH)或 碳酸氢钠溶液控制pH偏酸的不良漂移。在4°C-37°C的温度下培育合并的灭 活剂-病毒材料，培育时间宜为24-72小时。
或者，可用二元乙烯亚胺(BEI)灭活病毒， 一种代表性的灭活TTV的方 法如下。将等体积的0.2摩尔溴化乙胺氢溴酸盐溶液与0.4摩尔氢氧化钠溶 液混合以制备BEI。此混合液在约37。C培育60分钟。将产生的环化灭活剂 BEI，以0.5%-4%，优选1-3%(体积比)加入到病毒材料中。灭活的病毒材料 在4'C-37"C保持24-72小时并定时搅拌。培育结束时，加入20ml除菌的1 摩尔硫代硫酸钠液以确保BEI的中和。将灭活的病毒材料经稀释和未经稀 释的样品加入到易感细胞(组织)培养物中以检测有无未被灭活的病毒。多次 传代培养细胞，用各种方法检査是否存在TTV，这些方法包括细胞病变效 应(CPE)和抗原检测。这种试验能测定病毒灭活是否完全。
本领域知道纯化灭活病毒的方法，包括梯度离心、超速离心、连续流 超离心和层析，如离子交换层析、分子大小排斥层析、液相亲和层析中的 一种或多种。适用于本发明的纯化方法的其它例子包括聚乙二醇划硫酸 铵沉淀，以及超滤和微滤。
本发明的纯化病毒制品基本上没有源自细胞或细胞培养物的污染蛋白 质，优选每微克病毒抗原所含细胞核酸不到50pg。还要优选此纯化的病毒 制品包含不到约20pg，甚至更优选不到约10pg的细胞核酸。本领域知道检 测病毒样品中宿主细胞核酸的方法。优选管理当局如WHO或FDA批准的 或推荐的标准方法。
本发明也包括含减毒TTV的组合物。如本文所用，减毒指TTV在对象猪中的毒力降低。使病毒减毒的方法是本领域已知的。这种方法包括在 上述培养细胞中系列传代病毒直到该病毒显示功能减退。培养病毒的温度 可以是导致组织传代培养物减毒的任何温度。本领域技术人员能检测经细 胞培养物一次或多次传代后病毒的功能是否减退。在上述动物模型中病毒 复制水平降低或毒力降低，表明其功能已减退。
产生减毒TTV的一种具体方法包括在亚适温度或"冷"温度下在细胞
培养物中传代病毒，和/或通过随机诱变(如利用5-氟尿嘧啶的化学诱变)或 定点诱变将减毒突变引入TTV基因组中。冷适应通常包括在约20°C-32°C 之间，优选在约22。C-30。C之间，最优选在约24。C-28。C之间的温度下传代。 冷适应或减毒可通过在逐渐降低的温度下传代进行，以引入额外的限制生 长突变。获得安全的免疫减毒的病毒所需的传代次数至少部分地取决于所 用的条件。利用对TTV培养物在动物中的毒力和免疫能力的定期检测，不 难确定组织培养与温度特定组合的参数。
也可通过突变各个病毒区域，如0RF1、 0RF2和0EF3中的一个或多 个以降低病毒的结构蛋白或非结构蛋白的表达而使TTV减毒。这种减毒 TTV在病毒基因组的一个或多个区域中可包含一个或多个添加、缺失或插 入。
一旦减毒，用本领域知道的技术如上述灭活病毒中所述的方法来纯化 病毒。
也可制备亚单位组合物。例如，采用本领域熟知的重组方法，产生源 自病毒基因组任何区域，如ORFl、 OEF2和/或ORF3区衍生的一种或多种 免疫原。就这方面而言，可根据TTV基因组的序列设计寡核苷酸探针，用 于探测基因组或cDNA文库中编码可用作本发明免疫原的TTV基因。然后 可用标准技术进一步分离此种基因，如果需要可用限制性酶在全长序列的 所需部分突变该基因。或者，可用合成法而非克隆法制备编码感兴趣蛋白 质的DNA序列。设计的此DNA序列含有编码特定氨基酸序列的适当密码 子。 一般而言，如果这种序列将用于表达，应选择指定宿主的优选密码子。 完整序列由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸装配得到，并装配成完整的 编码序列。参见例如，Edge(1981)淑匿292:756: Nambair等(1984)Sc/e"ce
24221:1299; Jay等(1984>/編.CAem. 259:6311。也可采用已知技术，如苯酚 抽提从病毒直接分离TTV基因，可进一步操纵此序列以产生所需的改变。 参见例如Sambrook(同上)描述的用于获得和分离DNA的技术。
一旦制备或分离得到所需蛋白的编码序列，可将它们克隆到合适的载 体或复制子中。本领域技术人员知道有许多克隆载体，选择合适的克隆载 体是一项选择工作。可用于克隆的重组DNA载体和用作转化的宿主细胞的 例子包括噬菌体n义^l,熟、pBR322(尤嫁,熟、pACYC177(乂「應, 勒、pKT230(革！銜丝熟、pGV1106(革^厥丝熟、pLAFRl(革^像丝熟、 pME290(求乂濕^慮應革上历丝熟、pHV 14((尤嫁伴慮，祐享,范^熟、 pBD9(芽溜〃熟、pIJ61(慈霉熟、pUC6(楚霉熟、YIp5(摩母熟、YCpl9(摩 母熟和牛乳头瘤病毒(喊晃动激一智厕。参见"DNA克隆"第I和II巻，同 上；Sambrook等，同上；B.Perbal,同上。
可将此基因置于启动子、核糖体结合位点(对于细菌表达)和任选的操纵 子(本文总称为"控制"元件)的控制下，使得在用含此表达结构的载体转化 的宿主细胞中将编码所需蛋白的DNA序列转录为RNA。此编码序列可含 或不含信号肽或引导序列。如果包含信号序列，它们可以是天然的同源序 列或异源序列。引导序列可在翻译加工后被宿主去除。参见例如美国专利 No.4,431，739; 4,425,437; 4,338,397。
也可能需要其它调控序列，以调节宿主细胞生长时该蛋白序列的表达。 本领域技术人员知道调控序列，例子包括在响应化学或物理刺激应答时(包 括存在调节化合物时)开放或关闭基因表达的那些序列。载体中也可存在其 它类型的调控元件，例如增强子序列。
可在插入载体例如上述克隆载体之前，将控制序列和其它调控序列连 接于该编码序列。或者，将此编码序列直接克隆入已经含有控制序列和合 适的限制性位点的表达载体中。
在某些情况下，可能需要修饰此编码序列，使之以适当朝向(即保持读
码框正确)连接于控制序列。也可能需要制造感兴趣序列的突变体或类似
物。可通过删除编码该蛋白序列的一部分，在其序列中插入一序列，和/或 取代其序列中的一个或多个核苷酸来制造突变体或类似物。修饰核苷酸序列的技术，如定点诱变的描述可参见例如Sambrook等，同上；"DNA克 隆"第I和II巻，同上；"核酸杂交"，同上。
用上述系统制备的多肽常常需要是融合多肽。如采用非融合蛋白，这 些蛋白可在细胞内表达或由细胞分泌到生长培养液中。
此外，可构建包含编码例如多种TTV免疫原的嵌合基因序列的质粒。 此种基因序列可以是双顺反子基因构型。位于不同基因之间的其它调控元 件可对远处编码区的RNA进行有效翻译。或者，也可构建具有编码多种抗 原的一个开放读码框的嵌合基因转录单元。制备的融合基因可合成嵌合蛋 白，或者可工程改造蛋白加工信号以提供蛋白酶(如信号肽酶)的切割位点， 使模板RNA翻译产生的两种或更多种蛋白释放。此种加工蛋白酶也可在此 系统中独立地表达或作为与抗原和/或细胞因子编码区嵌合体的一部分表 达。此蛋白酶本身既是加工酶又是疫苗抗原。
然后用表达载体转化合适的宿主细胞。可在广泛的各种系统中表达此 种分子，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母菌表达系统，所有系统 为本领域熟知。例如，昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人 员知道的，其描述可参见例如Summers和Smith,得克萨斯农业试验田第 1555号文件(7"ems爿gn'c咖m/ ￡JcpeWwe"Z S她'ow M>.7555)(1987)。
杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可从加利福尼亚州圣地亚哥的英 吉公司(Invitrogen, San Diego CA)的商品化试剂盒("MaxBac"试剂盒)中获 得。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统为本领域所熟知，其描述可参 见例如Sambrook等，同上。酵母菌表达系统也为本领域所熟知，其描述可 见例如"酵母菌基因工程"(Barr等，主编，1989)伦敦巴特沃思(Butterworths, London)。
也知道可用于上述系统的一些合适的宿主细胞。例如，本领域知道的 哺乳动物细胞系包括从美国典型培养物收藏所(ATCC)获得的永生细胞系， 例如但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、HeLa细胞、乳仓鼠肾细胞(BHK)、 猴肾细胞(COS)、人胚肾细胞(如HEK293)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)、 马-达二氏牛肾细胞("MDBK")及其它细胞。类似地，细菌宿主如大肠杆 菌、枯草芽孢杆菌和链球菌也可用作本发明的表达构建物。本发明可用的
26酵母菌宿主包括酿酒酵母菌、白色念珠菌、麦芽糖念珠菌、多形汉森酵 母菌、脆壁克鲁维酵母菌、乳酸克鲁维酵母菌、高里毕赤酵母菌(P/c/n'a gw〃/eWmo"A7)、巴斯德毕赤酵母菌(尸/c/ /a pflWo〃\s)、稷酒裂殖酵母菌 OS"c/n'z(Wflcc/ flromj;ces pom6e)禾卩耳l5罗维亚洲酵母菌(7(a7Tow,fl /^ o/j"ca)等。 用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞包括埃及伊蚊、苜蓿丫纹夜娥 (y4wtogra/ /^ ca/z/orm'ca)、家香、黑腹果虫場、秋行军虫0S; O(iop/era々wg^7e^/a) 和粉纹夜娥(7Wc/w/ /w^ "/)细胞等。
根据所选择的表达系统和宿主，可在能表达感兴趣免疫原的条件下， 培养用表达载体转化的宿主细胞来生产本发明的免疫原。然后从宿主细胞 分离得到免疫原并纯化。如果表达系统提供的是分泌型免疫原，可直接从 培养液中纯化。如果免疫原不分泌，需从细胞裂解液中分离。选择合适的 培养条件和回收方法属于本领域的技术范围。
也可采用本领域技术人员已知的方法，例如固相或液相肽合成法，通 过化学合成来产生TTV免疫原。如果所述抗原较小则优选化学合成肽。固 相肽合成技术可参见例如，J. M. Stewart和J. D. Young,"腐賴嚴合成"第 2版，伊利诺斯州罗克福德的皮尔斯化学公司(Pierce Chemical, Rockford, IL) (1984);以及G. Barany和R. B. Merrifield "肽分析、合成、生物学(The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology)" , E. Gross禾口 J. Meienhofer主编，第 2巻，纽约学术出版社(Academic Press, New York), (1980), 3-254页；和M. Bodansky，"嚴会成游辰湮"柏林SV(Springer-Verlag, Berlin) (1984);经典 的液相合成技术可参见E. Gross和J. Meienhofer主编的"肽分析、合成、 生物学"同上，第l巻。
可利用TTV免疫原来产生多克隆和单克隆抗体。如需要多克隆抗体， 可用本发明的免疫原或其片段或突变的免疫原来免疫所选哺乳动物(如小 鼠、家兔、山羊、马等等)。收集免疫动物的血清并根据已知方法进行处理。 参见例如Jurgens等.(1985)JC/^o肌348:363-370。如果采用含多克隆抗体的 血清，可用已知方法通过免疫亲和层析纯化此多克隆抗体。
本领域技术人员也不难制备TTV免疫原的单克隆抗体。利用杂交瘤技 术制备单克隆抗体的方法是熟知的。通过细胞融合，也可通过其它技术如用致癌性DNA直接转化或用EB病毒转染B淋巴细胞产生永生的抗体产生 细胞系。参见例如M. Schreier等，杂3t^"发术(7fy6〃V/omfl rec/m/《we^ (1980); Hammerling等，牵克潑贫体与r潘應染^"i(Mo"oc/o"a/ ^""6o力'^朋d T-ce〃外6nWom— (1981); Kennett等，卓克廣贫沐fMowoc/om3/ J油7W/e^ (1980);也可参见美国专利4,341,761; 4,399,121; 4,427,783; 4,444,887; 4,452,570; 4,466,917; 4,472,500, 4，491，632和4，493,8卯。可筛检产生的抗感 兴趣TTV免疫原或其片段的多组单克隆抗体的各种性质，即同种型、表位、 亲和力等。利用单克隆抗体通过免疫亲和技术纯化它们所针对的各自抗原。 也可将多克隆和单克隆抗体共同用于被动免疫，或与亚单位疫苗联用以增 强免疫应答反应。
TTV制剂和给药
可将本发明的灭活、减毒或分离的TTV免疫原单独或与其它抗原组合， 配制成组合物，如疫苗或诊断组合物，如下所述用于免疫对象。例如，此
组合物可包含其它引起猪疾病的病原体的免疫原，例如但不限于猪细小
病毒、猪环病毒、猪生殖和呼吸道综合征病毒、猪流感病毒、伪狂犬病毒、
引起猪发热的猪瘟病毒、猪嗜淋巴疱疹病毒(PLHV1和PLHV2)、支原体 (Afycop/fw廳s; ; )、 缠绕杆斷//￡//006""^ 弯曲杆菌(C續p卢6fl"er
^; )、 胞内劳森菌(Z證s画'"卿)、胸膜肺炎方文线菌(v4c""o6ac〃/ws 7 /ewro/7wewwow/ae)、虽lJ猪嗜血杆菌(/faemop/n7w5/ anxyw&)、链球菌、巴斯《恵 菌CPaWewe〃fl s; ; )、 f少门菌OS"a/mowe〃a ^; / )、 大肠杆菌、梭菌(C7oWn.tZ/wm J7 p)、 红斑丹毒杆菌C&";Ay;^/c^An'x r力ww'o/ flA,ae)的免疫原。
制备此种制剂的方法可参见例如"雷明顿药物科学"，宾夕法尼亚州伊 斯顿(Easton, Pennsylvania)的Mack出版公司，第18版，1990。通常将本发 明的疫苗制成可注射的液体溶液或悬浮液。也可制成适合的固体剂型，在 注射前溶于运载液配成溶液或悬浮液。也可乳化此制品或将其活性成分包 裹在运载脂质体中。配制适合口服的疫苗并不难。通常将免疫原活性成分 与相容的药物运载体，如水、盐水、葡聚糖、甘油、乙醇等及其组合混合 在一起。此外，如需要，运载体可含有微量辅助物质，如增湿剂、乳化剂和pH缓冲剂。
也可在该制剂中加入能增强疫苗效力的佐剂。佐剂可包括例如胞壁 酰二肽、阿夫立定(avridine)、氢氧化铝、明矾、弗氏佐剂、不完全弗氏佐 剂(ICFA) 、 二甲基二十八烷基溴化铵(dimethyl dioctadecyl ammonium bromide, DDA)、油、水包油乳剂、皂甙、细胞因子和该领域已知的其它物 质。这类佐剂是熟知的，可从许多商品生产公司来源如迪弗可(Difco)、辉 瑞动物健康公司(Pfizer Animal Heath)、新港实验室(Newport Laboratories) 等购得。
也可将TTV免疫原与载体相连以提高其免疫原性。合适的载体包括 代谢缓慢的大分子如蛋白质，包括血清白蛋白、匙孔血兰蛋白、免疫球蛋 白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和该领域技术人员已知的其它蛋白质； 多糖，如葡聚糖、琼脂糖、纤维素、纤维素珠等；聚合氨基酸如聚谷氨酸、 聚赖氨酸等；氨基酸共聚物；和灭活的病毒颗粒。
可采用天然形式的TTV免疫原，或其功能基团经修饰后的形式，如琥 珀酰化其赖氨酸残基或与半胱氨酸硫代内酯反应的修饰形式。例如，也可 通过2-亚氨基硫解酶或3-(4-二硫代吡啶基)丙酸酯的N-羟基琥珀酰亚胺酯
的氨基官能团的反应将巯基引入载体(或抗原)中。合适的载体也可经修饰以 引入间隔臂(例如环己二胺或类似大小的其他双官能性分子)用于连接肽。
此外，可将TTV免疫原以中性或其盐形式配制成疫苗组合物。药学上 可接受的盐包括酸加成盐(与活性多肽的游离氨基形成的盐)，它是与无机酸 如盐酸或磷酸形成的盐，或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、苦杏仁酸等 形成的盐。也可使游离羧基与无机碱如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁反应形 成盐，与有机碱如异丙胺、三甲基胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因 等反应形成盐。
疫苗制剂含有"治疗有效量"的活性成分，即其用量能在给予该组合 物的对象中诱导免疫应答。在治疗和预防TTV感染时，本领域技术人员不 难用标准试验测定这种"治疗有效量"。通常TTV免疫原在组合物中的含 量约为1%-95%(w/w)，或者适当时甚至高于或低于此范围。对于本发明的 疫苗制剂，当每只动物给予0.25-3ml剂量的注射溶液时，每毫升注射液中0.1-500mg，优选l-100mg，更优选10-50mg，如20、 25、 30、 35、 40mg
等等或以上所述范围内的任何剂量的活性成分应足以诱导免疫应答。
如采用灭活的或减毒的制品，组合物通常包含10M0^pfu的TTV，更 具体说104-108 pfu的TTV，优选105-107 pfu的TTV。
为了免疫对象，疫苗通常胃肠外给予，常常肌内注射给予。然而，其 它给药方式，如皮下、腹膜内和静脉内注射也是可以接受的。给药量取决 于所治疗的动物，该动物免疫系统合成抗体的能力及所需的保护程度。本 领域技术人员通过常规试验建立剂量反应曲线，不难确定有效剂量。给予 至少一个剂量、优选二个或多个剂量的疫苗来免疫对象动物。而且，可能 需要给予动物多个剂量以维持对感染的免疫力。
适合其它给药方式的其它疫苗剂型包括栓剂，在某些情况下为气溶胶、 鼻内、口服制剂和缓释制剂。对于栓剂，运载体组合物包含传统粘合剂和 运载体，如聚亚烷基二醇(polyalkaline glycol)或甘油三酯。由包含约 0.5%-10%，优选约1。/。-2。/。(w/w)的活性成分的混合物形成此种栓剂。口服 运载体包括常用的赋形剂，如药用甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精 钠、纤维素、碳酸镁等。这些口服疫苗组合物可采取溶液、悬浮液、片剂、 丸剂、胶囊、缓释制剂或粉末剂的形式，含约10%-95%，优选约25%-70% 的活性成分。
鼻内给药剂型通常包含不会刺激鼻粘膜或不会明显破坏鼻纤毛功能的 运载体。可用于本发明的稀释剂例如有水、盐水或其它已知物质。鼻给药 制剂也可含有防腐剂，例如但不限于三氯叔丁醇和洁尔灭(benzalkonium chloride)。可加入表面活性剂以促进鼻粘膜吸收疫苗蛋白。
控释或缓释剂型的制备是将蛋白掺入到载体或运载体中，所述载体或 运载体包括脂质体，非重吸收性不能渗透的聚合物如乙烯乙酸乙烯酯共聚 物和热塑性聚酯弹性共聚物(Hytrel copolymers),可溶胀聚合物如水凝胶， 或重吸收性聚合物如用于制备可吸收缝线的胶原蛋白和某些聚酸或聚酯。 也可利用本领域熟知的植入型微小泵递送TTV免疫原。
也可通过表达本发明TTV免疫原的载体病毒来给予此免疫原。本发明 可用的载体病毒包括但不限于牛痘苗病毒和其它痘病毒、腺病毒和疱疹
30病毒。例如，可如下构建表达新型蛋白质的重组牛痘苗病毒。将编码特定
蛋白的DNA先插入到合适的载体中，使之毗邻牛痘启动子和侧连牛痘DNA 序列，如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后用此载体转染细胞，同时用牛痘 感染。同源重组可将牛痘启动子和编码本发明蛋白的基因一起插入到病毒 基因组中。在5-溴脱氧尿苷的存在下培养细胞，挑选抗该试剂的病毒空斑， 选出产生的TK'重组体。
另一种可选的给药途径涉及基因治疗或核酸免疫。可直接给予对象动 物编码对象TTV免疫原的核酸序列(伴随调控元件)使之在体内翻译。或者 在活体外用此基因转染对象细胞或组织，将转化材料重新引入宿主体内进 行基因转移。通过注射将DNA直接引入宿主生物体内(参见国际公开 WO/90/111092和Wolff等(1990)Science MZ: 1465-1468)。也可用已知方法 实施脂质体介导的基因转移。参见例如Hazinski等，(1991) J 7 e^k Ce〃 Mo/. 5/。/. 4:206-209; Brigham等.(1989) / MW Sc,. 298:278-281: Canonico等，(1991) C7/". h. 39:219A;和Nabel等，Sc/e"ce (1990) 249: 1285-1288。可将耙向制剂，例如针对特定类型细胞表面表达抗原的抗体共 价偶联于脂质体表面，而将核酸递送给易感的特定组织和细胞。
诊断学
也可利用TTV组合物作为诊断试剂来检测生物学样品中抗TTV的反 应活性抗体的存在。例如，用标准的电泳和免疫诊断技术，包括诸如免疫 竞争试验、直接反应或夹心试验等免疫试验，来检测是否存在与TTV制品 反应的抗体。这类试验包括但不限于蛋白质印迹；凝集试验；酶标记介 导的免疫试验如ELISA;生物素/亲和素试验；放射免疫试验；免疫电泳； 免疫沉淀试验等等。反应通常包括显示标记如荧光、化学发光、放射活性 标记、酶标记或染料分子，或检测抗原与抗体之间反应形成的复合物的其 它方法。
上述试验通常包括将液相中未结合的抗体与固相支持物上的抗原-抗 体结合形成的复合物进行分离。可用于实施本发明的固相支持物包括硝 酸纤维素基材(如膜或微滴孔形式)；聚氯乙烯基材(如片层或微滴孔)；聚苯乙烯胶乳基材(如珠或微滴板)；聚偏氟乙烯基材；重氮化纸、尼龙膜、活化
珠、反应性磁珠等等。
通常在适合结合的条件，先使固相支持物与固相组分(如一种或多种
TTV抗原)反应，使得该组分被充分固定到支持物上。有时，先将抗原与具 有较佳结合性能的蛋白质偶联以促进抗原固定于支持物。合适的偶联蛋白 包括但不限于大分子如血清白蛋白、包括牛血清白蛋白(BSA)、匙孔血兰 蛋白、免疫球蛋白分子、甲状腺球蛋白、卵白蛋白和该领域技术人员已知 的其它蛋白质。可用于使该抗原与支持物相结合的其它分子包括多糖、
聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物等。这些分子和将这些分
子与抗原偶联的方法是该领域普通技术人员熟知的。参见例如Brinkley, M.A" 5/oco"乂wg^e C/zem. (1992) 3:2-13; Hashida等，《/ (1984) 6:56-63; 以及Anjaneyulu禾口 Staros, /",ema〃owa/ J! o/尸ep"V/e awt/ /VWe/w (1987) 30: 117- 124。
固相支持物与固相组分反应后，洗漆支持物去除未固定的固相组分， 然后在结合的结合条件下，使结合在支持物上的组分与怀疑含有配体分子 (如针对固定抗原的抗体)的生物学样品相接触。洗涤除去任何未结合的配体 后，在结合的结合条件下加入第二结合分子，此第二结合分子能与结合的 配体选择性缔合。然后用本领域熟知的技术检测是否存在此第二结合分子。
更具体说，可用ELISA方法，此法中微滴板的各孔被TTV抗原包被。 将含有或怀疑含有抗-TTV免疫球蛋白分子的生物学样品加入包被孔中。试 验中需要用一块微滴板，用第一抗原分子包被选定数目的孔，用第二抗原 分子包被另一组孔等等。或者，连续进行一系列ELISA。培育足够时间使 抗体结合固定的抗原后，洗涤平板去除未结合物质并加入可检测标记的第 二结合分子。让该第二结合分子与任何捕获的样品抗体反应，洗涤平板并 用本领域熟知的方法检测第二结合分子的存在。
因此，在一个具体的实施方式中，用包含针对抗体配基的抗体的第二 结合分子不难检测出生物学样品中结合抗-TTV抗原的配体的存在。本领域 熟知有用的免疫球蛋白(Ig)分子并可从市场上购买。本文所用的Ig分子优 选IgG或IgA类，然而在某些情况下，IgM也可能适合。采用该领域技术人员已知的方法，不难将Ig分子与可检测的标记酶，如辣根过氧化物酶、 葡萄糖氧化酶、P-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶和脲酶等偶联。然后用相应的 酶底物产生可检测信号。在其它有关实施方式中，可用该领域技术人员已 知的方法进行竞争性ELISA技术。
也可在溶液中进行试验，如此病毒蛋白与病毒蛋白的特异性抗体在沉 淀条件下形成复合物。在一个具体的实施方式中，采用本领域已知的偶联
技术如直接或间接化学偶联，使TTV抗原连接于固相颗粒(如琼脂糖珠等)。 然后在适合的结合条件下使抗原包被颗粒与怀疑含有TTV抗体的生物学样 品相接触。结合抗体之间的交联导致形成颗粒性抗原-抗体复合物凝聚体， 该凝聚体可沉淀并通过洗涤和/或离心与样品分离。可利用一些标准方法， 例如上述免疫诊断方法来分析反应混合物，以确定其是否存在抗体-抗原复 合物。
在还有一种实施方式中，提供免疫亲和基质，将怀疑含有TTV抗体的 生物学样品中的多克隆抗体固定在基板上。就这方面而言，先利用固定的 抗原进行样品的初步亲和纯化。经此处理的样品只含有抗TTV分子，避免 了亲和支持物潜在的非特异性结合。本领域知道有许多固定免疫球蛋白(完 整的或其特异性片段)的方法，产量高并具有良好的抗原结合活性。不受任 何具体方法的限制，可利用固定的蛋白A或蛋白G来固定免疫球蛋白。
因此，在固定免疫球蛋白以提供免疫亲和基质后，在适合的结合条件 下，使具有不同和独特标记的TTV抗原与结合抗体相接触。洗涤除去免疫 亲和支持物上非特异结合的抗原之后，用本领域已知方法检测各特异性标 记来确定结合抗原的存在。
可以试剂盒的形式提供上述分析试剂，包括TTV免疫原、任选固定在 固相支持物上，以及合适的说明书和其它必须试剂，以便执行上述免疫试 验。试剂盒也装有(取决于所用的具体免疫试验)合适的标记物和其它包装试 剂和材料(即洗涤缓冲液等)。可用此试剂盒进行标准免疫试验，如上述那些 试验。
3.实施例以下是实施本发明具体实施方式
的例子。提供这些实施例的目的是为 了说明，不意味以任何方式限制本发明的范围。
业已作出努力来确保所用数字(如用量，温度等)的准确，但是当然应允 许存在某些实验性误差和偏差。
实施例1
猪基因型1TTV传染悉生猪
为了确定TTV能否传染悉生猪而产生TTV猪模型，进行了以下实验。
材料和方法
动物
由剖腹产小队从择日交配的妊娠母猪接生获得悉生小猪，动物饲养条 件和定期收集血液样品的取样程序按前人(Krakowka S, Eaton KA (1996)，猪 生物医学石开究进展 n(y4t/vo!"ces /" Sw/"e i e5earc/z //),
Tumbleson M, Schook L主编(纽约布莱出版社(Plenum Press, NY))，第 779-810页)所报告的进行。
传染性TTV的来源和PCR试验
收集来自20头无特定病原体饲养的健康幼猪(14-16周龄)的无菌柠檬 酸化血液和血清样品，冰上保存直到输送给实验室。低速离心收集富含白 细胞的血浆分别-70。C冻存。用PCR按Mclntosh等，Ca"J. (2006)2^:58-61所述检测配对血清有无猪环病毒2(PCV2)DNA，也用发表的 猪引物序列以nPCR试验检测有无猪基因型(g)l和g2-TTV DNA(Kekarainen 等，^>o/.(2006)^2:833-837)。
扩增序列的分析
扩增nPCR-阳性样品以常规方法测序。然后将获得的序列与Genbank 保存的猪基因型(g)l和2TTVDNA排列对比，鉴定为猪gl或2，与这些发 表的序列同源。
在悉生猪中系列传代
收集PCV2-DNA阴性、TTV-阳性富含白细胞的血浆(r^18)，腹膜内接 种(IP)3日龄悉生小猪(8.5ml/小猪)。接种28天后，nPCR检测二头猪TTVDNA-病毒血症阳性。结束此二头猪生命，制备一头猪肝脏的20。/。(w/v)匀浆， -70°。冻存。融化第一代(p)匀浆用氯仿抽提二轮(c)以消除了 pl匀浆液中所 含外包膜病毒的感染力(Feinstone等，/"/ec"附mw".(1983)4i:816-821)。将 5ml新融化的cTTVpl匀浆液经IP给予2日龄悉生小猪；感染后10天(PID10) 结束这些小猪生命。无菌收集这些小猪的肝脏和骨髓，分别用nPCR检测 TTV。制备的小猪10。/。(w/v)骨髓-肝脏匀浆液具有最强的nPCRTTV信号， 用氯仿处理2次取其水相(cTTVp2)-7(TC冻存。融化cTTVp2匀浆液，取0.5ml 如上所述接种(IP)二头15日龄悉生小猪，在PID10天结束后收集各小猪的 肝脏和骨髓(cTTVp3)。如上所述，用PCR和nPCR分别检测骨髓和肝脏有 无TTV DNA，用磷酸缓冲盐水制作具有最优良引物对结合条带的配对BM/ 肝脏样品的匀浆，以10y。(w/v)悬液形式接体内接种产生第4代 TTV(TTVp4)。不用氯仿抽提此第4代(TTVp4)而将其分成2.0ml等份-70。C 冻存，作为感染性病毒贮存液供随后的体内致病机理研究。 组织学和免疫组化分析(IHC):
结束时，将所有TTV-接种小猪和对照猪的组织切片(腹股沟、腋窝、 肠系膜和支气管淋巴结、胸腺、骨髓，脾脏、肝、肺、肾和回肠)收集存放 在冷(4。C)乙醇中，固定24小时，然后作组织学检査，用常规方法苏木精伊 红染色。如Krakowka等，r".尸aAo/.(2001) 1^:31-42和Krakowka等， Ca".&t乂 (2007)化:716-724所述，染色双份组织切片有无PCV2核衣壳蛋 白。用Jones银染色双份肾切片和用过碘酸Schiff(PAS)染色基底膜，然后 用生物素化马抗小鼠IgG检测猪纤维蛋白原/纤维蛋白(克隆MFB-HB,纽约 州怀斯布的ACS公司(Accurate Chemical & Scientific Corporation, Westbury, NY))，用标准ABC试剂盒(Vectastain,加利福尼亚州伯林盖姆的维克托实 验室(Vector Laboratories, Burlingame， CA))和二氨基联苯胺(DAB)过氧化 物酶底物显色。用山羊抗-猪IgG，然后用生物素化抗-山羊IgG(马里兰州盖 瑟斯堡的KP实验室(Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg， MD))， 用标准ABC试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色，检测所选双份肾切片中猪 IgG的沉积。
原位杂交用设计的gl-TTV引物和地高辛-标记的核苷酸通过原位杂交(ISH)检测 所选组织是否存在TTVDNA。简言之，乙醇固定的双份组织切片用二甲苯 脱蜡，用过氧化氢甲醇液猝灭，经蛋白酶消化后用标准方法与标记探针(37 。C和55。C)杂交。基本上如Hamberg等，J. F"D/agJ"veW.(2007)i^:135-141 所述，用偶联辣根过氧化物酶的抗地高辛单克隆抗体检测标记探针，用二 氨基联苯胺显色。ISH的对照包括用PCV2-特异性探针的ISH，省略单克隆 抗地高辛抗体的ISH，无先前ISH用单克隆染色组织以及在TTV阴性组织 切片上的ISH。
筛检猪病原体
检测了所有终末血清，包括从传染实验前TTV-阳性常规猪收集的样品 和随后合并的组织匀浆TTV样品，以及悉生猪的终末血清样品，检测其是 否存在猪细小病毒(PPV)、猪流感病毒(SIV)、猪生殖和呼吸道综合征病毒 (PRRSV)，用逆转录酶(rt)PCR检测PRRSV和用PCR检测SIV RNA和猪环 病毒(PCV)l型和2型。康复期血清用病毒中和试验(脑心肌炎病毒和传染性 胃肠病毒)，琼脂凝胶免疫沉淀试验(SIV)，血凝抑制试验(PPV)和 ELISA(PRRSV)检测有无抗这些病毒的抗体。
实验设计
给2日龄悉生小猪腹膜内(IP)接种2.0ml氯仿抽提的第一代TTV(cTTV pl)，于PID5(N-2)、 7(N=2)、 21(N二2)和34(N-3)天结束，进行肉眼和组织 学评价。未感染的分开词养的对照小猪是同窝小猪(n^2)，不感染，分别于 PID6和34天结束。第二次体内攻击实验中，类似地给二窝(n-11)2日龄悉 生小猪IP接种2.0mlTTVp4，于PID 3(N=1)、 5(n=2)、 7(N=1)、 14(N:3)和 35(N-2)天结束(生命)。保存二窝分开饲养的小猪作为非感染对照，于34天 时结束。
结果
直接PCR和嵌套式PCR检测扩增子
嵌套式PCR和直接PCR 二者均从首次接种小猪的合并血浆以及接种 cTTVpl到cTTVp3和cTTVp4的小猪血清、肝脏和骨髓中产生了 292个碱基的扩增子。扩增从cTTVpl和cTTVp4回收的序列，测序并与Genbank 报告的猪TTV参比基因型(g)l(DQ229865)和g2(DQ229860)的序列作比较。 cTTVpl和cTTVp4扩增子与基因组的UTR相匹配；与gl-TTV的同源性各 为94.3%，与g2-TTV序列的相同性低于45%。在接种cTTVpl到cTTVp4 的小猪未发现基因型2 TTV DNA。用定量PCR(qPCR)检测每纳克(ng)提取 的体内各次传代接种产生的总DNA的gl-TTV DNA拷贝数。计算得到的数 值如下cTTVpl(<10拷贝/ng DNA)， cTTVp2(2.0 x 103拷贝/ng DNA)， cTTVp3(1.6x 1()3拷贝/ng DNA)禾口 cTTVp4(1.1 x 1()4拷贝/ng DNA)。 临床症状和肉眼观察发现
在cTTVpl或cTTVp4-感染的悉生小猪中均没有观察到临床症状。组 织肉眼检査鉴定发现PID5天终止时3只小猪有2只，PID7天终止时3只 小猪有1只，14天终止时3只小猪有2只患间质性肺炎。PID3-7天终止的 小猪见到轻度胸腺萎縮。2只PID14天终止的小猪头颈部腹侧和胸腔纵隔 有局灶性水肿。1只PID21天小猪显示右腋窝淋巴结和臂神经丛区域有局 部水肿。PID34终止小猪大致正常。未感染的悉生小猪无肉眼可见的病损。
组织学发现
所有的淋巴组织，不论感染状态时或PID时都有细胞减少和活性不良；
感染和对照小猪的支气管和肠系膜淋巴结罕见生发中心，最可能与饮食中
的粘膜抗原(母猪奶代用品)刺激有关。PID7天以前终止的小猪胸腺大小减 少不同，主要是由于富含T淋巴细胞的皮质减少。这种变化是暂时的(PID14 天的胸腺与对照猪无区别)，皮质厚度的减少与观察到的皮质细胞坏死和炎 症变化无关。PID21天或较早终止的所有小猪肝脏的肝细胞胞浆有空泡样 改变，与轻度脂肪变性/肝糖原浸润相符。10日龄(PID7)的对照和感染小猪 存在局灶性骨髓外造血。PID14前的肝脏中存在小的(淋巴细胞和组织细胞) 混合灶。
gl-TTV-感染小猪肺部组织随时间(PID依赖)的变化最为显著。PID5-7 天小猪的肺泡间隔壁增厚，有单个核细胞和胞外蛋白物质中度浸润。 一只 PID7天小猪的肺切片肺泡间隙中存在纤维蛋白渗出。PID14天3只小猪中 的1只(和PID34天4只小猪中的1只)肺泡间隙有细胞碎片和纤维蛋白渗出。在PID14-21天，肺部变化成熟可见弥散性间质肺炎，特征是蛋白性物质集
聚在毛细血管腔中，肺间隙有弥散性淋巴细胞和组织细胞浸润。PID34终 止时4只小猪中的3只仍存在弥散的小叶间质性肺炎。这些小猪的肺病损 严重程度低于PID21天小猪所见到的程度，除了一只小猪有与炎症性单个 核细胞活化和出现巨大合胞体细胞相关的区域广泛的纤维渗出性肺泡炎和 间质性肺炎。
PID7天前终止gl-TTV-感染小猪的肾脏未见组织学改变。然而PID14 天gl-TTVp4-感染小猪的肾脏中肾小球有不同程度肿胀和胞外嗜酸性蛋白 物质渗出肾小球间隙偶见炎症细胞。PID21天时肾小球病损发展至PID34 天仍存在，此时所选择的肾小球中有微量纤维结缔组织增生而瘢痕化。肾 小球的形态变化与先前膜性肾小球肾病的形态变化相符。未感染对照小猪 中不存在这种肾小球病损。这些肾小球病损为PAS-阳性，用Jones银染色 显示基底膜有不规则的结节性增厚，且猪纤维蛋白原、纤维蛋白和IgG为 IHC-阳性。
原位杂交(ISH)
对所选组织用ISH直接观察gl-TTV DNA。 PID5-感染小猪的骨髓样品 含有阳性信号。DAB反应产物局限于胞浆，在未确定谱系的大的单核细胞 样细胞核内罕见。反应产物在胞浆中呈弥散性着色或呈分散性颗粒，提示 为病毒包涵体。在PID5天的脾脏中也发现含TTV DNA的类似细胞。
其它猪病原体
ELISA检测所有小猪为猪呼吸生殖道病毒(PRRSV)血清阴性，rtPCR检 测所有终末血清为PRRSV RNA阴性。PCR检测小猪的终末血清为PCV2 DNA阴性，双份组织切片PCV2核衣壳蛋白染色均为阴性。终末血清猪流 感病毒(SIV)抗体阴性，猪细小病毒HAI-阴性。
TTV PCR:
各种TTV组织匀浆和所有接种这些匀浆的小猪的gl-TTV nPCR或直 接PCR均为阳性。在所有病例中，接种前悉生小猪血清为TTV-DNA阴性。 接种cTTVp2和其后的小猪组织中含有足够的TTV DNA，因此常规PCR 试验足以检测出TTV DNA。所有检査的组织(血清、淋巴结、胸腺、肺、肝、肾、脾和骨髓)在PID10天后均存在基因型1病毒DNA(数据未示出)。
综上所述，在上述传染实验中，所有20只用作悉生小猪体内传代的 TTV原料的常规小猪的血清中均鉴定到gl-TTV DNA。采用TTV-阳性合并 血浆易于将TTV传给TTV DNA阴性的悉生幼猪，通过一系列传代提高了 这些小猪(血浆)的TTVDNA含量，因而体内传代3次后不再需要用嵌套式 PCR来检测TTV DNA。 PID10天后，所有组织中均检测到TTV DNA。用 ISH，先在骨髓细胞中鉴定到TTVDNA，所鉴定的部位是TTV在人体内的 复制位点(Kikuchi等，JM^/.^W. (2000)61:165-170; Okamoto等， 5/o; /2;as.7 es.Comww". (2002) 270:657-662; Rodriguez-Inigo等，^im.J.尸C/zo/. (2000) 156:1227-1234)。
与悉生猪TTV感染有关的组织学病损谱显示其严重程度为PID-依赖 性升高，然后在康复期(PID21天后)下降。此病损可重现，但在年龄匹配的 未感染对照同窝小猪中不存在；TTV-相关组织学变化与疾病的临床症状无 关。在儿童中，TTV感染与呼吸道疾病和哮喘相关(Matti等，乂 Km/. (2003) 77:2418-2425; Biagini等，C〃". /"/e".版(2003) 36: 128-129; Pifferi等，J. /"/e". (2005) 192:1141-1148)。肉眼检查可检测出TTV-感染猪发生间质 性肺炎并经组织学证实，这强烈提示猪感染TTV也能引起亚临床呼吸疾病。 类似地，TTV-感染悉生猪肝脏中淋巴细胞-组织细胞浸润提示，肝脏可能是 TTV的复制位点。的确在人类肝匀浆中证明有TTV复制性亚型(双链DNA)， 原位杂交在肝细胞胞浆中鉴定到有TTV DNA(Rodriguez-Inigo等，</. 尸"组(2000) 156: 1227-1234)。
在TTV-感染悉生猪中鉴定到的肾小球病损具有特点。膜性肾小球肾病 可能与循环的TTV免疫复合物有关。对于TTV感染的人，多位学者提出 肾小球病损可能与TTV感染有关(Usta等，C/!'". W印/wo/. (2001) 11:335)。在 本实验中，Jones银染色显示肾小球基底膜增厚程度不同，为PAS阳性，基 底膜中或其上面有猪纤维蛋白/纤维蛋白原和IgG的不连续聚集体。在 PID5/7天猪中无这些改变但在PID14-21天时存在，这强烈提示它们与TTV 病毒血症有关，受感染的悉生猪产生了抗TTV抗体效应。
悉生生物的标志之一是全身淋巴结和相关的淋巴细胞聚集发育不良。B细胞相关生发中心非常缺乏，富含T细胞的旁皮质区发育不良且被膜下窦
缺乏淋巴细胞。因此，悉生生物缺乏淋巴细胞和患有低丙球血症(Krakowka S, Eaton KA (1996)，猪生物医学研究进展11(y^va"c^ /" Sw/"e /" 5/omed/cfl/ 7 ewarc/z //), Tumbleson M, Schook L主编(纽约布莱出版社(Plenum Press, NY),第779-810页)。然而悉生生物的淋巴组织对传染疾病有反应，例如 PCV2感染(Krakowka等，F".尸aAo/. (2001) 38:31-42)，猪细小病毒 (Krakowka等，F".尸a组(2000) 37:254-266)和缠绕杆菌(Krakowka等， /"/ec,. /mmw". (1987) 55:2789-2796; Krakowka等，K". P^/w/, (1998) 35:274-282; Krakowka等，Jm. 乂 FeL (2005) 66:945-952)。用这些病原体 感染可导致淋巴细胞迅速激活，表现为淋巴组织增生和淋巴滤泡发育；在 病原感染的悉生生物中全面的免疫应答。在TTV-感染猪中除短暂的胸腺萎 縮外没有观察到淋巴组织的组织学改变，这是令人惊奇的。无论如何，TTV-感染猪的肺、肝、肾中的组织学病损显然与TTV感染有关。重要的是，这 些变化不能诊断为TTV，它们也在常规猪中发生(或其它同住共食猪或有关 的致病性微生物感染猪)，可能被排除作为与对各种未鉴定的环境因素的亚 临床应答反应有关的背景组织学改变。然而，不仅在此系列研究中而且前 人的报导(Krakowka S, Eaton KA (1996)，猪生物医学研究进展II04c/va"ces 〖"iSSW"e S/禱Wca/ i e"wc/z //)， Tumbleson M, Schook L主编(纽约布莱 出版社(Plenum Press, NY))，第779-810页)中均认为未感染的悉生猪缺乏这 些改变，悉生状态能够鉴定与TTV感染相关的细微组织学改变。
猪TTV的这些发现意味着对社区医疗有显著意义。自从1997发现它 们以来，学者们经过再三努力尝试证明在各种人类疾病中TTV的作用。以 前的所有研究因年龄匹配对照组高发无症状TTV感染而造成混乱，事实上 不可能在人类中鉴定到最早期的TTV感染，除非是母-胎儿传染的罕见情况 或是接受过TTV-阳性血液和血液产品病人的前瞻性研究。此外，缺乏TTV-感染的合适动物模型阻碍了对这些病原体导致人类疾病潜力的研究。已完 成了人源TTV传染灵长动物的研究(Tawara等，S/oc/zem. 5/op/z;^. Comm肌(2000) 278:470-476)，但这些实验由于非人灵长动物有它们自己的 猿TTV而变得复杂。
40因此，悉生生物提供了研究TTV的新方法。采用悉生动物可排除环境
影响，包括实验对象在居住环境中不慎感染了 TTV。感染病原体的悉生动
物中观察到肉眼可见的改变和组织学改变，这些改变直接明确地反映了病 原体与宿主之间的相互作用，外部变化如同住共食和合并感染、饮食差异
和环境压力不会对其造成混乱。此动物模型系统的开发对研究人类TTV可 能有广泛的意义。 实施列2
合并感染猪基因型1 TTV增强了 PCV2-相关的PWMS
材料和方法 悉生猪
剖腹产小队从择日交配的妊娠母猪接生获得总共36头悉生小猪，饲养 在无菌有围栏的隔离单元中(每单元3-6只小猪)。如(Krakowka S, Eaton KA (1996)，猪生物医学研究进展II(Jdva"cw /" SvW"e /" i esearc/z //),
Tumbleson M， Schook L主编(纽约布莱出版社(Plenum Press, NY)),第 779-810页)所述，各感染组在隔开的物质齐备的隔离单元中饲养以维持生 物安全性，喂养商品化母猪奶替代品饮食。实验前和结束时各隔离单元作 需氧菌和厌氧菌培养验证悉生生物状况；所有培养为细菌菌落阴性。
病毒
采用体内传代的第4代Stoon 1010 PCV2株(OSU/PCV2p4)作为PCV2 攻击接种源。其10% (w/v)的组织液每毫升含5 x 108 PCV2感染单位，用嵌 套式PCR试验(Kekarainen等，J. Gen. Virol. (2006) 87:833- 837)检测没有基 因型1和2TTVDNA。猪基因型l-TTV最初通过如上所述用来自常规幼猪 的TTV DNA-阳性血浆输血给新生的悉生小猪，从悉生小猪中回收。用氯 仿抽提TTV DNA阳性的猪肝脏和骨髓匀浆液(Feinstone等，/"/e". /mmw". (1983) 41:816-821)以去除所有包膜致病病毒(TTVpl)，然后通过三次悉生小 猪系列传代，第一代至第三代之间用氯仿抽提(分别为TTVpl-3)。第4代匀 浆(TTVp4)的10。/。(w/v)匀浆液不用氯仿抽提，将其分成2.0ml等份-70'C冻 存供随后的体内攻击实验用。
实验设计将小猪分成以下感染组组A是三窝小猪中未感染的对照猪(n-5);组 B是经口鼻单独感染PCV2/OSUp4(n =6);组C是腹膜内(IP)感染 gl-TTVpl(『4)或gl-TTVp4(n=4);组D是感染gl-TTVpl， 7天后感染 PCV2/OSDUp4(n =6);组E是感染gl-TTVp4， 7天后OSU/PCV2(n =6);组 F是感染PCV2/OSUp4， 7天后IP感染gl-TTVp4。收集感染前和每周的血 样品制备血清，每天观察小猪有无疾病症状至少3次。当小猪垂死或感染 后(PID)32-34天终止生命。
PCR:
用常规方法抽提冻存(-7(TC)的每周和终末血清样品中的DNA。采用已 发表的上述基因型1 TTV的引物序列，经嵌套式(n)PCR进行TTVDNA的 常规样品筛检。用PCR评估PCV2病毒血症(Mclntosh等，Ca". (2006) 70:58-61)。
组织学和免疫组化分析(IHC):
收集肺、肝、肾、回肠、脾脏、胸腺、腹股沟、腋窝、支气管和肠系 膜淋巴结样品存放在冷(4'C)100。/。乙醇中，4'C固定24小时，用常规方法作 组织学检查。双份组织切片用苏木精伊红染色，检査PCV2核衣壳蛋白 (Krakowka等，PaAo/. (2000) 37:274-282; Krakowka等，尸a"o/. (2001) 38:31-42; Krakowka等，K/ro/. /mmw"o/. (2002) 15:567- 582)。也用市
场购得的抗猪纤维蛋白原/纤维蛋白和抗猪IgG的单克隆抗体，以常规方法， 用VectastainTM试剂盒中的技术染色双份肾切片，观察有无这些蛋白沉积。
简言之，脱蜡的双份切片用含3% (v/v)H202的PBS液灭活内源性过氧化酶， 与相应的单克隆抗体反应，用4。/。(v/v)热灭活的马血清封闭，与生物素化马 抗小鼠IgG反应，与亲和素-过氧化物酶反应，用二氨基联苯胺(DAB)显色。 结果
A组未感染对照小猪
A组所有未感染小猪终末时临床表现正常且组织学变化与前人报告相 符(Ellis等，J. Vet. Diagn. Invest. (1999) 11:3-14; Krakowka S， Eaton KA (1996)，猪生物医学研究进展 SW"e 5/o膨Wca/ 7 ，orc/z //), Tumbleson M, Schook L主编(纽约布莱出版社(Plenum Press, NY)),第779-810页；Krakowka等，PflAo/. (2000) 37:274-282; Krakowka等， 尸aAo/, (2001) 38:31-42; Krakowka等，/mmww/. (2002) 15:567-582)。 双份组织切片PCV2核衣壳蛋白染色阴性，接种前和终末血清PCV2和 gl-TTV均呈阴性。
B组只接种PCV2/OSUp4的小猪
所有6头只感染PCV2/OSUp4的小猪病毒攻击后均存活且临床表现均 健康，但终末时有病毒血症。此组中6头小猪中的5头有出现中等支气管 淋巴结病，所有6头有轻度全身性淋巴结病。6头小猪中的一头肝脏苍白略 黄，6头小猪中的4头有轻度胸腺萎縮。组织学检查，可见导致淋巴结病的 淋巴增生(生发中心，T细胞依赖区和中等RE增生)。 一头猪淋巴结见有少 数合胞体巨大细胞，所有猪肝脏显示有中等炎症性单核细胞浸润。双份组 织切片PCV2核衣壳蛋白染色揭示有散在的小病灶或含有反应产物的少数 单个单核细胞。这些病灶局限于淋巴组织中，或肝脏和肺中炎症细胞浸润，
但在支气管淋巴结中最强。
C组单独接种gl-TTVpl或gl-TTVp4的小猪
只感染gl-TTVpl的4头小猪保持临床表现健康，直至PID32天终止 时。组织学检查，淋巴组织细胞减生，唯一的组织学变化是支气管和肠系 膜淋巴结偶有生发中心形成，与A组未感染对照小猪相似。4头小猪中的3 头肝实质中偶有炎症细胞浸润和弥散性间质肺炎。肾脏中，肾小球中等肿 胀，伴细胞外嗜酸性蛋白渗出和区段性肾小球硬化。3头小猪在PID20天 时gl-TTV DNA-nPCR强阳性，而一头猪此期间gl-TTV DNA弱阳性。所 有4头小猪终末血清样品PCR检测PCV2 DNA阴性。只感染gl-TTVp4的 悉生小猪中可见类似结果，只是肾小球病损更严重，间质性肺炎更明显， 且所有4头猪终末血清gl-TTV DNA病毒血症强阳性。这些接种小猪终末 时临床也无症状。所有gl-TTV感染小猪的终末血清PCV2DNA阴性。
D组感染gl-TTVpl和OSDUp4， 7天后
6头双重感染小猪中的3头发生急性致命的突发PMWS。感染PCV2 后18天1头小猪突然死亡，另二头小猪垂死并于感染PCV2后19天终止 生命。所有3头患PMWS的小猪有全身性淋巴结病、胸腺萎縮、腹水，肝脏苍白略黄。淋巴组织中深度淋巴缺损，所有的B和T细胞区被组织细胞 和肉芽肿炎症完全取代。所有3头小猪均存在大量肝细胞弥散性坏死。双
份组织切片PCV2核衣壳蛋白染色揭示，肝细胞和其它上皮细胞如支气管
上皮、扁桃腺上皮和覆盖回肠淋巴滤泡的肠道上皮细胞有压倒性弥散感染。 肾脏切片中，除了肾小管上皮细胞为病毒阳性外，肾小球显示有免疫复合
物形态的PCV2-阳性物质的强线性沉积。这些肾小球沉积物也是IgG和纤 维蛋白原/纤维蛋白阳性。
实验后存活下来的3头双重感染小猪有肉眼可见的病损，为"中等-严 重"亚临床PCV2感染。存在全身淋巴结病但所有3头猪的胸腺大小在正 常范围内。 一头猪轻度腹水，另一头猪肝脏略"苍白"。所有亚临床/感染 猪中，肺部维持肿胀和坚硬，比正常"略硬"，提示有间质性肺炎。2头小 猪治愈了小的肾皮质梗死。组织学和IHC检查揭示，所有3头猪为亚临床 但主动感染了 PCV2。所有6头小猪的终末血清含有gl-TTV和PCV2 DNA。
E组感染gl-TTVp4和OSDU/PCV2, 7天后
3日龄的6头小猪IP感染TTVp4， 一周后ON接种PCV2/OSUp4。在 PCV2感染后PID18天， 一头小猪发生急性食欲减退，PID19天发生临床上 明显的PMWS(黄疸、浮肿、腹水)而终止(生命)。第二头小猪PCV2感染后 PID25天突然死亡。这头小猪中，广泛的胸腔积液和伴严重的弥散性间质 性肺炎的肺水肿是最可能的死因。第3头小猪于PID21天发生皮下水肿， 食欲减退，PCV2感染后32天时结束(生命)。所有3头死亡的小猪均有全 身性淋巴结病、胸腺萎縮、肝脏小而苍白略黄，是悉生猪发生PMWS的典 型特征。此接种组6头小猪中的3头在35天结束时仍存活，虽然其中一头 结束时仍有轻度皮下水肿和腹水。其余2头双重感染的小猪结束时临床表 现健康，有肉眼可见和组织学病损，与亚临床PCV2感染相符。此第二次 实验猪组织中的组织学和IHC发现类似于D组猪，只是胸腔积液的小猪有 广泛的间质性PCV2核衣壳蛋白阳性肺炎。
F组感染PCV2/ OSDUp4和gl-TTVp4， IP7天后 在该实验组中，6头3日龄悉生小猪感染PCV2/OSDUp4， 一周后感染 gl-TTVpl。此外，此感染组中2头小猪还按前人(Krakowka等，尸flAo/.(2001) 38:31-42)所述，用不完全弗氏佐剂乳化的匙孔血兰蛋白(KLH/ICFA) 免疫进行免疫刺激。2头KLH/ICFA免疫小猪在PCV2/ OSDUp4感染后约2 周显示了短暂(2-3天)的食欲减退和皮下水肿但恢复，结束时临床正常(35 天龄，PCV2感染后32天)。此感染方案双重感染的所有6头小猪均存活。 所有6头小猪的肉眼可见和组织学病损与稳定的亚临床PCV2感染相符， 即胸腺大小正常，检测到的淋巴结病归因于KLH/ICFA-相关的肉芽肿和淋 巴网状内皮细胞增生的联合作用。IHC发现病毒抗原以单个阳性细胞的形 式限于淋巴组织。
综上所述以上实验表明，有效感染猪gl-TTV加速了用PCV2攻击的 悉生小猪发生PMWS。虽然这些数据加强了 TTV是促进PMWS的感染因 子的观点，但TTV促进的机制看来与PMWS的其它共同感染的机制有所 不同。对于后者，认为免疫刺激是促进PMWS的关键。而对于前者，TTV 感染伴随的免疫激活组织学证据微弱甚至没有，但用该物质共同感染显然 促进了 PMWS。
而且，共同感染的顺序决定了临床结局。PCV2感染后再感染TTV不 能促进PMWS，而TTV感染先于PCV2感染则可。也存在其它差别。虽然 潜伏期随PPV或PMWS免疫方式而不同，但在PCV2感染后4-5周之间可 见临床表现。以TTV为例，早至PID18天(平均PID23天)，大约二周前就 有PMWS表现。此外，在TTV动物模型中，PCV2的嗜性急速扩大，能显 著感染上皮细胞(肠道、呼吸道、肾小管和肝上皮细胞)，伴有全身淋巴组织 感染。就此点而言，此TTV模型更类似于环孢霉素A-诱导的PMWS免疫 抑制作用模型(Krakowka等，h>o/. /m m/"o/. (2002) 15:567-582)。
鉴于与TTV单独感染相关的组织学病损谱(不同)，gl-TTV介导的这种 潜在作用出乎意料且确实不可预测。因此，如大多数学者假设的那样，看 来TTV事实上不是^害的病毒。
因此，本发明描述了治疗、预防和诊断TTV感染的方法，以及用于此 方法的组合物。虽然已相当详细地描述了本发明的优选实施方式，但应理 解可不背离本发明权利要求书所明确的思路和范围对其作出明显的变化。
权利要求
1.一种组合物，其包含药学上可接受的运载体和至少一种选自下组的猪托克特诺病毒(TTV)免疫原灭活的免疫原性猪TTV，减毒的免疫原性猪TTV和分离的免疫原性猪TTV多肽。
2. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含灭活的 免疫原性猪TTV。
3. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含减毒的 免疫原性猪TTV。
4. 如权利要求l所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含分离的 免疫原性猪TTV多肽。
5. 如权利要求1-4中任何一项所述的组合物，其特征在于，所述组合 物还包含佐剂。
6. —种治疗或预防猪对象TTV感染的方法，所述方法包括给予所述对 象治疗有效量的如权利要求1-5中任何一项所述的组合物。
7. —种治疗或预防猪对象的猪环病毒相关疾病(PCVAD)的方法，所述 包括给予所述对象治疗有效量的如权利要求1-5中任何一项所述的组合物。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是断奶后多 系统衰竭综合征(PMWS)。
9. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是猪皮炎和 肾病综合征(PDNS)。
10. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是猪环病毒 2型(PCV2)
11. 一种制备组合物的方法，其包括(a) 提供至少一种选自下组的猪托克特诺病毒(TTV)免疫原灭活的免 疫原性猪TTV，减毒的免疫原性猪TTV和分离的免疫原性猪TTV多肽； 和(b) 将所述TTV免疫原与药学上可接受的运载体组合。
12. 如权利要求ll所述的方法，其特征在于，所述方法还包括提供佐剂。
13. —种检测脊椎动物对象的托克特诺病毒(TTV)感染的方法，所述方法包括(a) 提供来自对象的生物学样品，和(b) 在所述生物学样品中存在的TTV抗体能与TTV多肽结合的条件下， 使所述生物学样品与至少一种分离的免疫原性猪TTV多肽反应，从而检测该对象是否存在TTV感染。
14. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法还包括(c) 除去未结合的抗体；(d) 提供一种或多种能与所述结合抗体缔合的分子；和(e) 检测所述一种或多种分子的存在与否， 从而检测是否存在TTV感染。
15. 如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述可检测的标记是荧 光素或酶。
16. 如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述生物学样品是猪血 清样品。
17. —种用猪托克特诺病毒(TTV)分离物感染TTV-阴性的幼猪、隔离 屏障饲养的无特定病原体小猪、或剖腹产小猪的方法，所述方法包括(a) 从猪对象分离TTV;和(b) 给予所述小猪足以导致TTV感染剂量的TTV分离物。
18. —种评价疫苗预防托克特诺病毒(TTV)感染的能力的方法，所述方 法包括(a) 将候选疫苗给予猪对象；(b) 使步骤(a)的猪对象接触剂量足以引起未接种疫苗对象发生感染的 猪TTV分离物；和(c) 观察该猪对象中TTV感染的发生率，从而评价该候选疫苗预防TTV 感染的能力。
19. 如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述猪对象是TTV-阴 性的幼猪、隔离屏障词养的无特定病原体小猪、或剖腹产小猪。
20. —种评价疫苗预防猪环病毒相关疾病(PCVAD)的能力的方法，所述方法包括(a) 将候选疫苗给予猪对象；(b) 使步骤(a)的猪对象接触剂量足以引起未接种疫苗对象发生感染的猪托克特诺病毒OTv;)分离物；和(c) 观察该猪对象中PCVAD的发生率，从而评价该候选疫苗预防 PCVAD的能力。
21. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述猪对象是TTV-阴 性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小猪或剖腹产小猪。
22. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是断奶后 多系统衰竭综合征(PMWS)。
23. 如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是猪皮炎 和肾病综合征(PDNS)。
24. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCVAD是猪环病毒 2型(PCV2)。
25. —种鉴定能治疗猪托克特诺病毒(TTV)感染的化合物的方法，所述 方法包括(a) 使TTV-阴性的幼猪、隔离屏障饲养的无特定病原体小猪、或剖腹产 小猪接触剂量足以引起所述小猪发生感染的猪TTV分离物；(b) 向所述受感染的小猪递送某化合物或一系列化合物；和(c) 检测步骤(b)的小猪是否存在TTV，和/或与未治疗的TTV-感染小猪 相比，是否发生、抑制或改善了 PCVAD症状。
全文摘要
本说明书公开了治疗、预防和诊断猪托克特诺病毒(TTV)感染的组合物和方法。也说明了鉴定用于治疗和预防TTV感染的化合物的方法，以及产生这种感染动物模型的方法。
文档编号C12Q1/70GK101588814SQ200780037541
公开日2009年11月25日 申请日期2007年9月25日 优先权日2006年10月5日
发明者J·A·埃利森 申请人:西尔巴斯生物学股份有限公司