β-内酰胺抗生素的生产的制作方法

专利名称：：β-内酰胺抗生素的生产的制作方法
技术领域：
：本发明涉及对/3-内酰胺抗生素的生产。
背景技术：
：/3-内酰胺抗生素是自然中微生物生产的次级代谢产物的最大家族。在临床上和经济上均最重要的^-内酰胺抗生素种类是青霉素(青霉垸)和头孢菌素(头孢烯)。它们的生物合成通过酶步骤的复杂途径发生。最初两个步骤是青霉垸和头孢烯类^-内酰胺抗生素生物合成途径中的关键步骤。通向青霉素和头孢菌素的生物合成途径在这两步后分化。青霉素、头孢菌素和头霉素抗生素是三种氨基酸的L-异构体——L-a-氨基己二酸(A)、L-半胱氨酸(C)和L-缬氨酸(V)成为三肽S-(L-ce-氨基己二酰基)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸或ACV的縮合。该步骤由S-(L-仏氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸合成酶或ACVS催化。在第二步骤中，三肽ACV被异青霉素N合成酶(下文称作IPNS)或环化酶的作用氧化环化。该反应的产物是异青霉素N;该化合物含有典型的/3-内酰胺和噻唑烷环结构，并具有抗菌活性。通过用疏水侧链交换亲水的a-氨基己二酰侧链，从异青霉素N形成青霉素G或V。工业工艺中通常使用的侧链为苯乙酸(PA)(产生青霉素G)或苯氧乙酸(POA)(产生青霉素V);该交换反应由酶酰基转移酶(AT)催化。由于酶AT的底物特异性，不可能把a-氨基己二酰侧链交换为感兴趣的任何侧链，尽管显示己二酸和己二酸的某些硫衍生物可以被交换(见WO95/04148和WO95/04149)。有工业重要性的青霉素和头孢菌素的侧链尤其不能通过AT被直接交换。因此，目前使用的大部分/5-内酰胺抗生素是通过半合成方法制备的。这些半合成的/3-内酰胺抗生素如下获得通过一个或多个化学和/或酶反应修饰N-取代的/3-内酰胺产物。这些半合成的方法具有下述缺点它们包含许多步骤、不是环境友好的并且相当昂贵。因此，会高度期望利用通向/3-内酰胺抗生素的完全发酵途径，例如通向阿莫西林、氨苄西林、头孢羟氨苄和头孢氨苄的完全发酵途径。对于半合成青霉垸和头孢烯抗生素的完全发酵途径可考虑多种选择。例如，可以专注于将异青霉素N的a-氨基己二酰侧链交换为感兴趣的合适侧链，例如在阿莫西林的情况下为a-氨基-对羟基苯乙酰侧链。这会需要修饰酶AT的底物特异性，因为天然的酶具有相当狭窄的底物特异性，并且不能够催化这样的交换。另外，这会需要修饰酶CoA连接酶，所述酶激活要被交换的侧链。或者，可以专注于以使得阿莫西林被直接合成和分泌的方式修饰青霉素生物合成途径中的最初两个步骤。然而，这会需要大量修饰ACVS和IPNS酶。例如对阿莫西林而言，首先将需要生产能产生阿莫西林侧链的三肽(即三肽D-对-羟基苯基甘氨酰-L-半胱氨酰-D-缬氨酸)来代替ACV。其次，将需要能够环化该三肽的酶。ACVS是催化三肽LLD-ACV(S-(L-ce-氨基己二酰)-L-半胱氨酰-D-缬氨酸)形成的非核糖体肽合成酶(NRPS)。在该三肽中，在L-a-氨基己二酸的S-羧基和L-半胱氨酸的氨基之间形成肽键，并额外地将缬氨酸的立体化学构象从L改变为D。近年来，若干实验室和研究所探寻定向工程改造NRPS的选项。作为主要的途径，结构域和模块被交换，并因此引入了新的特异性，导致产生改变的肽产物。在大部分情况下，工程改造途径被限制为相同生物(或甚至相同NRPS)的酶片段，严重地限制了酶工程改造的选项。目前文献中强调的NRPS工程改造的一个主要问题是肽氨基酸立体化学的改变，即从L-到D-立体化学的改变。差向异构化结构域紧下游的肽键形成縮合结构域对于肽基或氨酰基供体是D-特异的，对于氨基酰基受体是L-特异的。这样的縮合结构域被表述为DClj。该位置上的结构域不导致供体和受体基元的縮合(ClugstonS丄."a/.2003,Biochemistry,42,12095-12104)。可限制工程改造选项的又一问题是C和A结构域被认为是不可分离的对(MootzH.D."a/.2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,97,5848-5853)。6现在惊人地发现可对ACVS加以工程改造，以提供下述经工程改造的酶，所述酶能够催化三肽HpgCV或PgCV形成，其中在N-端肽键中使用a-羧基代替天然三肽ACV中使用的5-羧基，另外所述酶能够将第一个氨基酸的L立体化学构型修饰为D构型。若干小组进一步研究了酶IPNS的底物特异性。关于该主题的综述见BaldwinandBradley,Chem.Rev.1990,90，1079-1088禾QHuffman"fl/.J.Med.Chem.1992，35,1897-1914。例如，提到了间-COOH-DL-苯基甘氨酰基-L-半胱氨酰-D-缬氨酸和对-羟基苯乙酰基-L-半胱氨酰-D-缬氨酸不导致产生抗生素活性(上文Huffmanetal)。还惊人地发现天然的酶IPNS能够作用于三肽羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)和苯基甘氮酰-半胱氨酰-缬氨酸(PgCV)，更具体地作用于这些三肽的DLD-变体。对IPNS该特性的发现开启了进一步开发的道路，其中筛选IPNS变体以分离对这些非天然肽具有改进的活性的IPNS分子。本发明的发现首次使得能够完全发酵生产抗生素，所述抗生素之前仅能通过半合成的途径获得。发明详述因此，本发明第一方面提供了用于生产N-o;-氨基-羟基苯乙酰^-内酰胺抗生素或N-o;-氨基苯乙酰/3-内酰胺抗生素的工艺，所述工艺包括将三肽羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)或苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(PgCV)与IPNS接触，实现N-of-氨基-羟基苯乙酰/3-内酰胺抗生素或N-a-氨基苯乙酰/3-内酰胺抗生素的形成。本发明首次惊人地显示酶IPNS能够分别将非天然的三肽底物HpgCV或PgCV转化为分别带有N-a-氨基-羟基苯乙酰或N-a-氨基苯乙酰侧链的/3-内酰胺化合物(例如分别为阿莫西林或氨苄西林)。根据本发明，"IPNS酶"或"具有IPNS活性的酶"是将三肽HpgCV或PgCV环化为青霉垸抗生素分子的酶。这类IPNS酶定性的与￡"men'Ce〃a^5pwgZ〃M^m'^/a朋IPNSSEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的同一性程度。这些三肽中的氨基酸羟苯基甘氨酸(Hpg)和苯基甘氨酸(Pg)可以是D-以及L-形式，但是优选地是D-形式。羟苯基甘氨酸优选地为对-羟苯基甘氨酸。使用生物测定法和/或使用LC/MS分析完成IPNS的该非天然三肽-环化活性的检测。生物测定法的开发需要进行多种选择。例如，需要选择合适的微生物用于测试抗生素活性。另外，需要选择合适的IPNS，因为来自不同物种的IPNS酶似乎在特异性和稳定性上不同。既然己检测了如上所述IPNS的非天然三肽环化活性，则可能针对具有改进的特异活性和/或改变的底物特异性的酶，来优化反应条件并筛选IPNS变体。体外环化非天然三肽得到青霉烷抗生素典型地使用下文所述的反应条件完成。反应混合物的pH可以在6和8之间，使用任何合适的缓冲液。反应混合物应还含有合适量的Fe(II)离子。最后，还原剂例如DTT或TCEP(三(2-羧乙基)膦)的存在对于将前体三肽保持在还原状态是必需的。优选地，用这样的合适还原剂预处理前体三肽。可选地，形成的青霉烷抗生素如阿莫西林或氨苄西林可被进一步转化，产生头孢烯抗生素化合物。该转化至少需要酶扩环酶，例如用以形成头孢羟氨苄或头孢氨苄。可选地，可使用例如羟化酶和乙酰基转移酶活性或羟化酶和氨基甲酰基(carbamoyl)转移酶活性，通过进一步酶转化形成其它头孢烯化合物。这些转化必需的酶可适当地得自生产头孢烯的微生物，々口5Vre/^omycasc/avw/z'gen^、7Vocart/z'a/aCam(iM厂aws或v4cremcwz'wmsoge"讓。最近的综述见LirasandMartin,InternationalMicrobiology(2006)9:9-19。在本发明的一个优选的实施方案中，如下文所述使用IPNS酶。在一个实施方案中，在工艺中使用定制HpgCV和PgCV三肽作为起始化合物。在另一实施方案中，在下述工艺中生产三肽HpgCV和PgCV，所述工艺包括i)将氨基酸羟苯基甘氨酸(Hpg)或苯基甘氨酸(Pg)、半胱氨酸(C)和缬氨酸(V)与非核糖体肽合成酶(NRPS)接触，实现三肽羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)或苯基甘氨酰-半胱氮酰-缬氨酸(PgCV)的形成。在该实施方案中使用的NRPS是非天然的NRPS，其具有包含三个模块的模块结构，对Hpg或Pg特异的第一模块Ml、对C特异的第二模块M2和对V特异的第三模块M3，如下文所述。因此用于从其前体氨基酸生产N-a-氨基-羟基苯乙酰或N-仏氨基苯乙酰/3-内酰胺抗生素的整个工艺包括i)将氨基酸羟苯基甘氨酸(Hpg)或苯基甘氨酸(Pg)、半胱氨酸(C)和缬氨酸(V)与非核糖体肽合成酶(NRPS)接触，实现三肽羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)或苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(PgCV)的形成，和ii)将所述三肽与IPNS接触，实现N-a-氨基-羟基苯乙酰/3-内酰胺抗生素或N-a-氨基苯乙酰/3-内酰胺抗生素的形成。可使用经合适工程改造的微生物菌株体内进行该工艺，如下文所述。在本发明的第二方面中，提供了下述变体IPNS多肽，其与亲本IPNS多肽相比被修饰，并且与亲本IPNS相比对三肽HpgCV或PgCV具有经改进的环化活性。根据本发明的变体IPNS酶的"改进的活性"是下述活性，其确保与亲本IPNS相比，从前体三肽产生至少2倍量、优选地至少5倍量、更优选地至少IO倍量的抗生素活性。如果亲本IPNS对前体肽的活性不可检测到，则改进的活性包括超出检测极限的任何可测量的活性。可基于下述标准在亲本IPNS中选择用于修饰的合适位置a)在活性中心中产生空间，和/或b)削弱C-末端与活性位点的结合。当酶不负荷底物时，IPNS分子的C-末端作为半底物(quasi-substrate)作用，并与底物竞争活性结合位点。在底物到达活性中心的情况下，C-末端縮回，为底物产生空间。因此为了底物的结合转移该竞争是有益的。亲本IPNS可来源于任何合适的微生物来源，如下文所述。本发明的一种具体变体IPNS酶与SEQIDNO:1的IPNS比对时，与亲本IPNS酶相比在位置75、91、183、185、287、321、324、331中至少一个上被修饰，并且能够分别将三肽HpgCV或PgCV分别转化为抗生素阿莫西林或氨苄西林。这些位置上的修饰在肽侧链结合袋中产生了更多空间，从而与ACV的线性和柔性a-氨基-己二酰基侧链相比提供更大量的HpgCV和PgCV三肽的Hpg和Pg侧链。一种优选的变体在所有上述位置上含有修饰。这些位置上优选的修饰是修饰75LVT、91FH、183ACGTVL、185STGAC、287HSDQMK、321FSAVTQEM、324NDSTVA、331GASCVDN。特别优选的修饰为75VT、183AG、185GA、287HQ、321AVTM、324NSA、331ASVDN。修饰可以是指出的位置上具体氨基酸对不同氨基酸的取代，可以是指定位置上的氨基酸插入，或可以是从指定位置缺失氨基酸。与SEQIDNO:1的IPNS比X寸时，本发明的另一具体变体IPNS酶与亲本IPNS酶相比至少在位置185上被修饰，可选地在至少一个以下位置上被修饰(使用SEQIDNO:1:91、104、183、190、321、324、325、331的位置编码)，并且能够分别将三肽HpgCV或PgCV分别转化为抗生素阿莫西林或氨苄西林。这些位置上的修饰将底物与IPNS-C-端残基-Q330-T331之间对活性位点结合的竞争朝向底物移动，这通过削弱C-端与活性位点的结合和/或通过稳定下述构象来实现，所述构象中活性位点是可被用于底物结合的。惊人地显示至少在位置185上的修饰对含有该修饰的IPNS酶赋予了与不含该修饰的亲本IPNS相比被高度改进的环化活性。根据本发明的一种优选的变体包含修饰185RKH，更优选地包含修饰185RK，最优选地包含修饰185R。位置185上的原始氨基酸取决于使用的亲本IPNS，例如可以是S、T或V。在一个实施方案中，185RKH修饰与位置91,104,183，190,321,324，325,331中至少一个上的修饰组合，如下表中所述。当C-端区域N-G-Q-T331采取活性构象时，R和K尤其可有利地与C-端T331相互作用。惊人地，185RK和T331之间的相互作用非常有利于提高针对HpgCV和PgCV的活性。类似地，185RK帮助形成使用HpgCV和PgCV作为底物的活性构象。<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>*在其中指明了氨基酸的所有这些位置上，具体的氨基酸在目前已知的所有天然IPNS酶中是保守的。在本发明中，名称例如"185RK"表示所述亲本IPNS的位置185上的氨基酸被R或K取代，或当亲本IPNS中位置185上不存在氨基酸时在亲本IPNS的该位置上插入R或K。原始氨基酸残基的性质会取决于使用的亲本IPNS。名称例如"VST185RK"表示存在于亲本IPNS位置185上的特异氨基酸残基(在该例子中为V、S或T)被取代为不同的氨基酸(在该例子中为R或K)。合适的亲本IPNS是可得自真菌或细菌生物的IPNS多肽，所述真菌或细菌生物能够生产/3-内酰胺。一种优选的亲本IPNS是可得自以下的IPNSA:Cep/a/o5/o"'M附acremom.謹、Pem'c朋w附cA，ogewwm、F/avo6a"en'w附^pe"'as、5Vreptom_ycasc/avw/z.gen^、！SYrepto，cesgr&ei禾口/或5^eptom;;cMca"/e，。一种特别优选的亲本IPNS可得自Streptomycesclavuligerus禾口/或Aspergillus(Emericella)nidulans。典型地，这类亲本IPNS是具有IPNS活性的多肽，所述多肽与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%，优选地至少55%，优选地至少60%，更优选地至少65%，更优选地至少70%，更优选地至少75%，或最优选地至少80%的同一性程度。除了上文展示的修饰(优选地为修饰185RKH)以外，IPNS多肽可包含涉及多肽中下述位置的额外的修饰，所述位置中修饰不显著影响多肽的折叠或活性。典型地，这类修饰可归因于菌株内差异或种内差异，或其可以是保守修饰例如下述取代，其中非极性的、极性不带电的、极性带电的或芳香族氨基酸被取代为来自相同范畴的不同氨基酸。具有这类额外修饰的多肽典型地与SEQIDNO:1的序列具有至少50%的同一性程度。因此，在一个实施方案中，具有IPNS活性并包含至少一种上文展示的修饰的多肽与SEQIDNO:1的序列具有至少50%，优选地至少55%，更优选地至少60%，更优选地至少65%，更优选地至少70%，更优选地至少75%，或更优选地至少80%的同一性程度。术语"同源性"或"百分比同一性"在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，本文中确定为了测定两条氨基酸序列的百分比同一性，为了最佳比较的目的比对序列(例如可为了最佳比对在各序列中引入缺口)。然后比较相应氨基酸位置上的氨基酸残基。当第一条序列中的一个位置被与第二条序列中相应位置上相同的氨基酸残基占据时，则分子在该位置上是同一的。两条序列之间的百分比同一性是序列共享的同一位置数量的函数(即％同一性=同一位置数/位置总数(即包括缺口的重叠位置)x100)。优选地，两条序列长度相同。技术人员应当知道，可获得若干不同的计算机程序测定两条序列之间的同源性。例如，可使用数学算法完成序列的比较和两条序列间百分比同一性的测定。在一个优选的实施方案中，使用NeedlemanandWunsch(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))算法测定两条氨基酸序列之间的百分比同一性，所述算法已被掺入AccelrysGCG软件包的GAP程序中(可得自http:〃www.accelrys.com/products/gcg/)，其使用Blossom62矢巨阵或PAM250矩阵，禾B16、14、12、10、8、6或4的缺口权重，禾Q0.5、1、2、3、4、5或6的长度权重。技术人员应当知道，所有这些不同的参数会产生轻微差异的结果，但是使用不同的算法时两条序列的总体百分比同一性不会被显著改变。优选地，矩阵是Blossom62矩阵，使用10.0的缺口权重和0.5的长度权重。本发明的蛋白质序列可进一步被用作"查询序列"，针对公共数据库进行搜索，从而例如鉴定其它家族成员或相关序列。这类搜索可使用Altschul，"a/.(1990)J.Mol.Biol.215:403-10的blastp、psi画blast、phi-blast和tblastn程序(2.0版)进行。使用blastp、psi-blast、phi-blast和tblastn程序时，可使用各自程序(例如blastp、psi-blast、phi-blast禾口tblastn程序)的黑犬认参数。见www.ncbi.nlm.nih.gov上的NationalCenterforBiotechnologyInformation主页。第三方面，提供了一种多肽，其为包含三个模块的非核糖体肽合成酶对Hpg或Pg特异的第一模块Ml、对C特异的第二模块M2和对V特异的第三模块M3。用于表征模块的术语对氨基酸"特异"表示具体的模块使得能够掺合指出的氨基酸。第一模块Ml使得能够掺合第一氨基酸L-对-羟苯基甘氨酸或L-苯基甘氨酸，并优选地使得能够将其转化为相应的D-氨基酸。第二模块M2使得能够在L-半胱氨酸与氨基酸Hpg或Pg偶联时掺合该氨基酸L-半胱氨酸。具体地，当氨基酸Hpg或Pg处于其D-形式时，对C特异的M2模块包含DCL结构域，所述D(^结构域与对其异源的A结构域融合。第三模块M3使得能够掺合氨基酸L-缬氨酸并将其转化为相应的D-氨基酸。藉此，肽合成酶催化DLD-三肽羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)或苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(PgCV)从其L-氨基酸前体Hpg或Pg、C和V形成。本发明使用的术语"模块"定义了一种催化单位，其能够将一个肽构建块(通常为氨基酸)掺合进产物(通常为肽)中，并可包含用于修饰(如差向异构化和甲基化)的结构域。NRPS的每个模块由所谓的"结构域"组成，各结构域负责一个肽构建块掺合中的特异反应步骤。每个模块至少含有负责识别和活化专用氨基酸的腺苷酰化结构域(A结构域)，和负责将中间产物转运至催化中心的硫醇化结构域(T或PCP结构域)。第二和其它模块还含有负责肽键形成的縮合结构域(C结构域)，最后一个模块还含有负责释放肽的终止结构域(TE结构域)。可选地，模块可含有额外的结构域，如复杂将被整合的氨基酸的L-形式转化为D-形式的差向异构化结构域(E-结构域)。NRPS模块结构的综述见SieberS.A."a/.2005，Chem.Rev"105，715-738。杂种肽合成酶Ml模块的合适来源是催化下述肽形成的NRPS酶，所述肽含有要作为第一氨基酸被整合进XCV三肽中的氨基酸X，其中X为Hpg或Pg。因此，考虑要作为三肽的第一氨基酸被整合的氨基酸的性质来选择合适的Ml模块。具体地，模块的A结构域确定对具体氨基酸的选择性。因此，可基于A结构域对要被整合的氨基酸的特异性选择M1模块。如StachdhausT."a/.1999,CA缀cfe編.，8，493-505所定义，这样的选择可根据A结构域的特异性决定标记基序(specificitydeterminingsignaturemotif)而发生。作为NRPS的第一模块时，Ml模块不需要含有C-结构域和TE-结构域。因此，如果C和/或TE结构域存在于来源模块中，那么它们可适当地被去除，以获得不含C和/或TE结构域的第一模块M1。如果需要将L-氨基酸转化为D-氨基酸，则模块Ml除了含有A和T结构域外，还应含有E-结构域。因此，如果来源模块中不存在E结构域，则将该E-结构域与来源模块的T结构域融合，获得含有A、T和E结构域的第一模块Ml。通常，NRPS模块Ml对对-羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸的特异性可通过实验数据判断，和/或可基于StachelhausT."a/.1999,CA證.&勘/"8,493-505公开的A结构域的特异性决定标记基序。优选地，具有对-羟苯基甘氨酸特异性的第一模块Ml可得自CDA(钙依赖型抗生素)合成酶，尤其是CDA合成酶的第六个模块(如HojatiZ."a/.2002,CA缀&編.，9，1175-1187所公开给出CDA合成酶模块的编号)。优选地，CDA合成酶可得自5^eptowj;cMcoe//co/or。或者，Hpg特异的t莫块可得自Chloroerenomycin合成酶，尤其是Chloroerenomycin合成酶的第四和第五模块，优选地是可得自Jw_yco/flto;w&的Chloroerenomycin合成酶(TraugerJ.W.a/.2000，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，97,3112-3117);或来自Complestatin合成酶，尤其是Complestatin合成酶的第七个模块，优选地是可得自S^印tom少c^/ave"fifM/ae的Complestatin合成酶(ChiuH.T."a/.2001,Proc.Nat.Acad.Sci.USA,98,8548-8553)。所有这些模块均具有对L-Hpg的特异性并将其转化为D-立体异构体。优选地，具有苯基甘氨酸特异性的第一模块Ml可得自普那霉素(Pristinamycin)合成酶，尤其是普那霉素合成酶SnbD蛋白质的C-端模块，如Thibaut,D."a/.1997，J.Bact.,179,697-704中所公开。优选地，普那霉素合成酶可得自》，画yces戸'Wwa—rafc。来自普那霉素合成酶的C-末端来源模块含有TE结构域并且不含E结14构域。为了制备在本发明的肽合成酶中作为第一模块发挥功能的模块，可从C-末端来源模块中适当地去除TE结构域，并将E结构域与藉此修饰的C-末端模块的T结构域融合。E结构域可得自任何合适的NRPS，例如来自相同NRPS酵的另一模块，或也可来自不同NRSP酶的模块，所述酶具有腺苷酰化结构域的相似(例如对羟苯基甘氨酸或苯基甘氨酸)或不同的氨基酸特异性的。优选地，E结构域可得自来自S^e;tomj;cMco^'co/or的CDA合成酶，优选地来自于第六模块，如上文所述。因此，在该实施方案中，NRPS的模块M1是杂种模块。肽合成酶的第二模块M2应当使得能够掺合氨基酸半胱氨酸作为三肽DLD-XCV的第二氨基酸，其中X为Hpg或Pg。对该模块的选择可基于StachelhausT."a/.1999所松开的A结构域特异性决定标记基序。为了使得能够将L-半胱氨酸受体与D-X-氨酰基供体偶联，M2的C结构域为DCL结构域(如上文所述和如ClugstonS丄.Wfl/.2003中所解释的)。该DCL结构域与对其异源的A结构域融合。该语境中使用术语"异源"时表示C和A结构域来自不同的模块。这些不同的模块可来自相同的酶或可来自不同的酶。优选地，A结构域可来自ACVS的第二模块。惊人地，包含这类dCl-A结构域构型的杂种M2模块表现为能够掺合氨基酸半胱氨酸。在一个优选的实施方案中，M2模块的DCL结构域可得自下述模块紧下游的模块，所述模块是本发明的肽合成酶第一模块Ml的来源。例如，肽合成酶的M2模块的DCL结构域是CDA合成酶的第七模块的°0_结构域，所述第七模块是第一模块M1的来源。在另一实施方案中，肽合成酶的M2模块的DCL结构域是^"a7/MRB14伊枯草菌素(Iturin)合成酶蛋白质ItuC的第二模块的°<^结构域，如TsugeK."2001,J.Bact.，183,6265-6273所定义。在本发明的一个优选的实施方案中，肽合成酶的第二模块M2至少部分可得自下述酶，所述酶是肽合成酶第三模块M3的来源。具体地，肽合成酶M2模块的A和T结构域可得自下述模块紧下游的模块，所述模块是本发明肽合成酶第三模块的来源。例如，肽合成酶M2模块的A和T结构域可以是ACVS第二模块的A和T结构域。肽合成酶的第三模块M3应当使得能够掺合氨基酸缬氨酸作为三肽的第三氨基酸，并将其转化为D-形式，产生三肽DLD-XCV。在本发明的一个优选的实施方案中，肽合成酶的第三模块可得自ACVS，尤其是ACVS的第三模块。如上所述的ACVS优选地是细菌或真菌ACVS，更优选地是可得自7Voc^y/Za/flctawwfwra朋的细菌ACVS或可得自丝状真菌如Pem'd'wmcA，ogewwm、Jcre附cw.m/wcA，ogewi/w、j5/e厂g77/wsw/c/m/"打s的真菌ACVS。肽合成酶的模块Ml、M2和M3可具有如下显示的氨基酸序列。然而，这些序列仅作为例子显示，而不旨在限制本发明的范围。技术人员应当明白，NRPSA结构域例如共享约30-60%的氨基酸序列同一性，甚至对相同氨基酸具有特异性但是来自不同来源的A结构域，并且在若干核心基序中包含特异性决定标记基序(StachelhausT.eM/.1999)。肽合成酶的Ml模块例如具有根据SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列或下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2或SEQIDNO:4的氨基酸序列具有至少30%,更优选地至少40%,进一步更优选地至少50%，最优选地至少60%的百分比同一性。具有至少30%百分比同一性的这类多肽模块也被称作同源序列或同源物。肽合成酶的M2模块例如具有根据SEQIDNO:6或根据SEQIDNO:8的氨基酸序列或下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:6或SEQIDNO:8的氨基酸序列具有至少30。/。，更优选地至少40%，进一步更优选地至少50%，最优选地至少60%的百分比同一性。肽合成酶的M3模块例如具有根据SEQIDNO:10的氨基酸序列或下述氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO:10的氨基酸序列具有至少30%，更优选地至少40%，进一步更优选地至少50%，最优选地至少60%的百分比同一性。肽合成酶的模块可得自如上所述的天然NRPS酶，或可通过诱变技术衍生自这类天然NRPS酶，所述诱变技术例如随机和/或定向诱变和/或基因改组。如果需要的话，还可工程改造来源模块以添加必需的结构域、缺失非必需的结构域或将结构域取代为来自另一模块的相应结构域。典型地，模块的A结构域决定了对具体氨基酸的特异性，而E和C结构域可得自选择的任何模块。例如在下述情况下可缺失来源模块的C结构域，所述情况为被选择用于掺合第一氨基酸X的来源模块不是来源酶中的第一模块(Ml)模块并因此包含C结构域。在下述情况下可添加合适的E结构域，所述情况为来源模块不含有E结构域同时期望被掺合的氨基酸的差向异构化。可通过将适当的结构域和/或模块以适当的顺序融合，构建被工程改造的NRPS酶。还可能将酶的模块或结构域交换为另一酶的合适模块或结构域。可使用本领域普遍已知的遗传工程改造技术完成结构域和/或模块的该融合或交换。两个不同结构域或模块的融合典型地可在连接子区域中完成，所述连接子区域存在于模块或结构域之间。见例如公开了这些类型构建的EP1255816和MootzH.D.Wa/.2000。也可以通过对合适的多核苷酸序列的定制合成来获得部分或所有的序列。例如，可如下完成来自Hpg-特异的NRPS模块的ATE三结构域片段与ACVS的双模块Cys-Val-特异片段的融合。可通过在连接子位置上限制性酶消化相应的NRPS基因来分离Hpg特异模块的ATE片段，更特别地，在C-末端模块的情况下在Hpg特异模块的C结构域与A结构域之间，或在内部延长模块的情况下在Hpg特异模块的C结构域与A结构域之间和在E结构域与随后的结构域(C或TE结构域)之间。可通过l)保持C-末端完整，和2)将Cys特异模块2的C结构域交换为具有DCL特异性的C-结构域，获得ACVS的双模块Cys-Val片段。与ATE片段的分离类似，可分离ATEC四结构域片段，其包含邻近的下游模块的C结构域。后者与不含上游c结构域的ACVS的双模块Cys-Val片段融合。可适当地对如本文所述的NRPS酶进行诱变技术，例如改进酶的催化特性。尽管通常通过在合适的宿主生物中表达编码多肽的多核苷酸序列来制造如本文所述的多肽，但是可通过合成手段生产它们。17第四方面，提供了包含下述多核苷酸序列的多核苷酸(例如经分离的和/或经纯化的)，所述多核苷酸序列编码本发明前几方面的变体IPNS或NRPS多肽。本发明的多核苷酸还包括编码多肽的任何简并版本的多核苷酸序列。例如，技术人员使用常规技术可制造下述核苷酸取代，以反映本发明的多肽要在其中表达的任何具体宿主生物的密码子选择，所述核苷酸取代不影响本发明的多核苷酸中编码的蛋白质序列。优选地，通过密码子配对优化来优化多核苷酸中的编码序列。本发明的多核苷酸序列可以是RNA或DNA，并包括基因组DNA、合成DNA或cDNA。优选地，该多核苷酸为DNA序列。编码第一方面NRPS酶的模块Ml、M2和M3的多核苷酸可例如具有根据SEQIDNO:3、SEQIDNO:5、SEQIDNO:7、SEQIDNO:9和SEQIDNO:11的核苷酸序列，编码SEQIDNO:2、SEQIDNO:4、SEQIDNO:6、SEQIDNO:8和SEQIDNO:10的氨基酸序列，或可以是编码上述氨基酸序列的同源物的核苷酸序列，如上文所述。可根据本领域公知的方法合成多核苷酸。可通过将下述寡核苷酸组合来生产它们，所述寡核苷酸根据或沿着本发明多核苷酸的核苷酸序列被合成。或者，可通过在任何期望的位置上诱变亲本多核苷酸来合成它们。多核苷酸还可用于获得编码被进一步修饰的多肽的多核苷酸，例如通过对多核苷酸进行额外的诱变技术来实现。因此，典型地通过下述方法获得具有改进的活性的多肽，所述方法包括步骤对编码多肽的多核苷酸进行诱变，针对期望的活性筛选获得的变体多肽群体，和分离具有改进的活性的变体。可使用本领域技术人员已知的任何合适技术完成诱变。诱变可包括对多核苷酸进行随机诱变以及定向诱变。使用定向诱变时，优选地将其与选择的位置上的饱和诱变组合，使得能够将原始氨基酸取代为任何其它氨基酸。可使用多核苷酸改组(基因改组)技术(例如如W095/22625、WO98/27230、WO98/01581、WOOO/46344和/或WO03/010183中所公开的)获得下述变体，所述变体带有存在于起始分子群体的任何成员中的任何变体位置的随机组合。起始种群可还包含根据本发明的一个或多个变18体。本发明还提供了包含本发明多核苷酸的载体，所述多核苷酸包括克隆和表达载体或盒。在表达载体或盒中，多核苷酸与调节序列可操作地连接，所述调节序列能够使得宿主细胞从多肽的编码序列表达该多肽。术语"可操作地连接"是指并置(juxtaposition)，其中所述组件处于允许它们以其预期的方式发挥功能的关系中。与编码序列"可操作地连接"的调节序列如启动子、增强子或另一表达调节信号以下述方式放置，所述方式使得在与调节序列相容的条件下达成多肽从其编码序列的表达。可选择与下述宿主细胞相容的启动子/增强子和其它表达调节信号，表达盒或载体针对所述宿主细胞被设计。如果多肽被生产为被分泌的蛋白质，则表达盒中编码成熟形式多肽的多核苷酸序列与编码信号肽的多核苷酸序列可操作地连接。编码本发明多肽的DNA序列优选地作为表达盒的部分被引入合适的宿主中。为了用表达盒转化合适的宿主，可获得本领域技术人员公知的转化步骤。表达盒可作为带有可选择标记物的载体的部分被用于转化宿主，或表达盒可以作为独立的分子与带有可选择标记物的载体一起被共转化。载体可包含一个或多个可选择的标记物基因。对于大部分丝状真菌和酵母而言，表达构建体被优选地整合进宿主细胞的基因组中，从而获得稳定的转化体。在该情况下，构建体被整合在基因组中的随机基因座上，或使用同源重组被整合在预定的靶基因座上。因此，本发明的第五方面提供了用本发明多核苷酸或载体转化的或者包含本发明多核苷酸或载体的宿主细胞。合适的宿主细胞是允许高水平表达感兴趣的多肽的宿主细胞。一旦需要生产并进一步(例如在体外反应中)使用多肽，则这类宿主细胞是可使用的。可选择异源宿主，其中本发明的多肽以基本不含其它多肽的形式被生产，所述其它多肽具有与本发明多肽相似的活性。这可通过选择宿主来达成，所述宿主通常不生产具有类似活性的这类多肽。合适的宿主细胞还是能够生产/3-内酰胺化合物的细胞，优选地是具有高水平生产/3-内酰胺化合物能力的宿主细胞。宿主细胞可例如是原核(例如细菌)、真菌或酵母细胞。可基于生产青霉烷或头孢烯化合物的选择来选择宿主。期望生产头孢烯化合物时，宿主可天然地含有导向头孢烯化合物的生物合成途径的必需基因，尤其是编码扩环酶活性和可选地编码羟化酶和乙酰基转移酶活性的基因。或者，导向头孢烯化合物的生物合成途径的一个或多个基因可被转化进缺乏这些基因的宿主细胞中。从而技术人员已知酶"扩环酶和扩环酶/羟化酶能够扩环氨苄西林和阿莫西林(Chin"a/.2003,FEMSMicrobiol.Lett.，218,251-257;Lloyd"a/.2004,J.Biol.Chem.279,15420-15426)。在一个实施方案中，合适的宿主是其中编码ACVS和/或IPNS酶的天然基因(例如通过插入失活)被失活的细胞。还可能缺失完整的青霉素生物合成簇，其包含编码ACVS、IPNS和AT的基因。藉此，可能生产感兴趣的/3-内酰胺化合物而不同时生产天然的/3-内酰胺。因此使用如上所述的编码NRPS的基因和/或编码IPNS的基因可发生插入失活。在含有多拷贝/3-内酰胺基因簇的宿主细胞中，可选择其中这些簇被自发缺失的宿主细胞。例如，/3-内酰胺基因簇的缺失被描述于专利申请PCT/EP2007/054045中。另一合适的宿主细胞是能够合成前体氨基酸Hpg或Pg的细胞。导向Hpg或Pg的生物合成途径基因的异源表达公开于WO02/34921中。Pg或Hpg的生物合成如下达成分别从芳香族氨基酸途径撤出苯基丙酮酸(PP)或对-羟基基丙酮酸(HPP)，将PP或HPP分别转化为苦杏仁酸(MA)或对-羟基苦杏仁酸(HMA)，将MA或HMA分别转化为苯基乙醛酸(PGL)或对-羟苯基乙醛酸(HPGL)，并最终将PGL或HPGL分别转化为D-Pg或D-Hpg。实施例15例示了尸em'c/〃^/mc/o^ge"wm中Hpg或Pg生物合成途径的表达。另一合适的宿主细胞是(过)表达4'-磷酸-泛酰巯基乙胺转移酶(4，-phospho-pantetheinetransferase,PPTase)的细胞。4'-磷酸泛酰巯基乙胺(PPT)是(除了其它以外)脂肪酸合成酶和聚酮合成酶的酰基运载体蛋白质和NRPS的肽运载体蛋白质的必需辅基。在单体前体的多步骤装配期间，PPT的游离巯基作用于与酰基反应中间产物共价结合成为硫酯，所述酰基反应中间产物典型地为乙酰基、丙二酰基和氨酰基。PPT基元衍生自辅酶A(CoA)并被翻译后转移至不变的丝氨酸侧链上。脱辅蛋白质到全蛋白质的该Mg^-依赖的转化由4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶(PPTases)催化。(过)表达具有广泛底物特异性的PPTase是有利的。这样的PPTase例如由来自5a"〃w6rev^的gsp基因编码(Borchert&a/.1994，J.Bacteriology,176，2458-2462)。宿主可适当地包含如上所述的一种或多种修饰。一种优选的宿主是Pem'cWw附c/z，ogewwm的菌株。在又一方面中，本发明提供了用于制备根据本发明的多肽的方法，所述方法通过在有助于表达(由载体或盒表达)根据本发明的多肽的条件下培养宿主细胞(例如用如上所述的表达载体或盒转化)，并可选地回收被表达的多肽来实现。多肽可作为被分泌的蛋白质被生产，在该情况下表达构建体中编码成熟形式多肽的多核苷酸序列与编码信号肽的多核苷酸序列可操作地连接。多肽也可以作为融合蛋白被生产，即与另一多肽(的部分)融合，例如与麦芽糖-结合蛋白融合。对体外反应而言，可使用被分泌的多肽或包含该多肽的无细胞提取物。可选地，多肽可以在使用前被(部分)纯化。在又一方面，本发明提供了制备/5-内酰胺化合物的工艺，所述工艺通过下文所述来实现在提供如本文所述的IPNS和/或NRPS多肽表达并且有助于^-内酰胺化合物生产的条件下，培养前述方面的宿主细胞，并可选地回收该0-内酰胺化合物。根据本发明，产生的/3-内酰胺化合物是N-酰化的/3-内酰胺化合物，其中N-酰基侧链是N-a-氨基-羟基苯乙酰或N-a-氨基苯乙酰侧链。有利地，本发明公开了这类/3-内酰胺抗生素的完全发酵生产。这类/3-内酰胺抗生素的例子是阿莫西林、氨苄西林、头孢羟氨苄和头孢氨苄。可使用本领域已知的步骤培养根据本发明的宿主细胞。对启动子和宿主细胞的每个组合而言，可获得有助于本发明多肽表达的培养条件。达到期望的细胞密度或多肽效价(titre)时，终止培养并使用已知的步骤回收多肽。另外，可建立有助于生产^-内酰胺的发酵条件。发酵培养基可包括己知的培养基，其含有碳源(例如葡萄糖、麦芽糖、糖蜜)、氮源(例如硫酸铵，硝酸铵，氯化铵，有机氮源例如酵母提取物、麦芽提取物、蛋白胨)、维生素和其它无机营养物来源(例如磷酸盐、镁、钾、锌、铁、微量元素等)。可选择，可包含诱导剂。对合适培养基的选择可基于表达宿主的选择，和/或基于表达构建体的调节需要。这类培养基是本领域技术人员已知的。如果需要的话，培养基可含有额外的组分，所述组分偏好经转化的表达宿主超出其它可能污染的微生物。还可能必需用要生产的/3-内酰胺化合物的前体化合物补充培养基。例如取决于使用的宿主细胞，培养基中可能必需包括氨基酸Hpg或Pg。如果是这样，则这些氨基酸优选地作为分离的补料被添加。发酵可进行0.5-30天的周期。其可以是分批、连续或补料分批过程，适当地在0和45。C之间范围中的温度下，例如在2和10之间的pH下。优选的发酵条件是20和37'C之间范围内的温度和/或3和9之间的pH。通常基于表达宿主细胞的选择和/或要被表达的蛋白质和/或/5-内酰胺化合物来选择适当的条件。如果必需的话，发酵后可通过离心或过滤的手段将细胞从发酵液中去除。发酵终止和/或去除细胞后，可使用常规手段回收本发明的多肽或产生的/3-内酰胺化合物。回收可包括纯化和/或萃取和/或结晶步骤。便利地，将本发明的多肽或/3-内酰胺化合物与合适的(固体或液体)运载体或稀释剂(包括缓冲剂)组合，产生多肽或/3-内酰胺化合物组合物。多肽或i3-内酰胺化合物可附着于运载体或与运载体混合，例如被固定在固体运载体上。因此本发明又一方面提供了包含本发明多肽或i3-内酰胺化合物的组合物。这可以是适合包装、运输和/或储存的形式，优选地在其中多肽的活性被保留。组合物可以是糊剂、液体、乳剂、粉末、薄片、颗粒、丸粒或其它挤压物形式。实施例一般性的材料和方法除非另有说明，都如其它地方(Sambrook，J.Wa/.,1989,Mo/eaz/wc/om."g.'/aZorato^y柳awwa/，2ndEd"ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor，NewYork)所述来进行标准DNA步骤。使用校正读码酶Phusion聚合酶(Finnzymes)扩增DNA。限制性酶来自Invitrogen或NewEnglandBiolabs。真菌生长在矿物质培养基中进行，该培养基含有(g/L):葡萄糖(5);乳糖(80);尿素(4.5);(NH4)2S04(1.1);Na2S04(2.9);KH2P04(5.2);K2HP04(4.8)和10mL/L微量元素溶液A，所述溶液A含有柠檬酸(150);FeS04.7H20(15);MgS04.7H20(150);H3B03(0.0075);CuS04,5H20(0.24);CoS04.7H20(0.375);ZnS04.7H20(5);MnS04.H20(2.28);CaCl2.2H20(0.99);在灭菌前调pH为6.5。使用丰富培养基YEPD时，含有(g/L):酵母提取物(10);蛋白胨(10);葡萄糖(20)。将培养物在定轨摇床中于25t:下以280rpm孵育72-168小时。用菌株Wisconsin54-1255(ATCC28089)进ffPem'"7//MmcArj^ogewwm转化。具有改进的/5-内酰胺产率的其它尸."o^oge""m菌株，包括菌株Wisconsin54-1255，也是合适的。这样的菌株的一个例子是CBS455.95。另外，具有导致/3-内酰胺生产缺失或减少的突变或缺失的尸.cAo^ge丽m菌株也适合用作转化宿主，例如其中/5-内酰胺基因簇被缺失的菌株，如专利申请PCT/EP2007/054045中所述。如WO2004/106347中所述进行尸.c/o^oge"wm的转化。对尸em'c巡Mmc/zr^oge做w的培养和对非天然三肽如DLD-Hpg-Cys-Val或将尸em'c〃/纟Mmc/zo^oge"ww在矿物质培养基(25mL)中于25。C下培养96小时。可选地，培养物在有或没有氨基酸如L-Hpg(1mM终浓度)或L-Pg(1mM终浓度)时生长。在发酵结束时，通过离心或过滤取出菌丝体，并用生理盐水洗涤菌丝体。使用MS技术如LC-MS/MS，针对三肽如DLD-Hpg-Cys-Val禾nDLD-Pg-Cys-Val测定菌丝体和培养基二者。作为标准，使用定制合成的DLD-Hpg-Cys-Val和DLD-Pg-Cys-Val三肽。结果在实施例1DLDPg-Cvs-Val的分析23菌丝体或培养基中，均未鉴定出三肽如DLD-Hpg-Cys-Val和DLD-Pg-Cys-Val三肽。结论是P.c/o^oge肌m不生产这些非天然的三肽。实施例2克隆非核糖体肽合成酶模块和结构域盒2a.克隆NRPS模块片段，所述片段催化L-Hpg的掺合和随后成为D-Hpg的异构化从S^e;to^ycMcoe"co/orA3(2)分离染色体DNA。随后进行PCR反应，向反应混合物中添加3-8%DMSO，另外使用标准条件。使用以下的寡核苷酸HpgFwl(caccatggcgacgctgccggaactgttc;SEQIDNO:12)禾口HpgRevl(tcaattaattaaccactc-ggactcaaggtcggac;SEQIDNO:13)。将得到的PCR片段Hpgl(产生来自Xtw//co/or的CDA1合成酶模块6的ATE三结构域)克隆进pENTR/SD/D-Topo载体(Invitrogen，荷兰)中，得到质粒pHpgl。2b.合成NRPS模块片段的定制合成，所述片段催化L-Pg的掺合和随后成为D-Pg的异构化定制合成(DNA2.0，MenloPark,CA，美国)由根据SEQIDNO:5的DNA序列组成的合成DNA片段。该DNA片段具有ATE三结构域。该AT片段来源于&;r^ri"^//rato普那霉素合成酶的SnbD蛋白质的C-末端模块，E-结构域来自于S.coelicolorCDA合成酶模块6。使用供应商提供的方案，将DNA片段克隆进载体pCR-Blunt(Invitrogen)中，得到载体pPgl。2c.克隆对半胱氨酸和缬氨酸掺合特异的双模块NPRS片段对该实验而言，采取来自尸emW〃/wwc/^sogwm附禾卩TVocani/fl/acto^/wra朋的ACV(3(L-Q!-氨基己二酸盐)-L-半胱氨酸，D-缬氨酸)三肽合成酶的基因作为模板。使用任一生物的染色体DNA模板进行PCR扩增。对尸.cAoA^g朋w附而言，使用以下的寡核苷酸寡聚体对PcM2M3fwl(caccttaattaatgaggagaatgcagcaacggac;SEQIDNO:14)禾口PcM2M3revl(tcaatagcgagcgaggtgttc;SEQIDNO:15)，产生片段PcM2M3—1(结构域组构CATCATETe)，寡聚体对PcM2M3fw2(caccactagtctggagtatctctcatctatc;SEQIDNO:16)禾qPcM2M3revl(tcaatagcgagcgaggtgttc;SEQIDNO:15)，产生片段PcM2M3_2(结构域组构ATCATETe)。将片段PcM2M3—1克隆进pENTR/SD/D-Topo中，得到pPcM2M3—1，并将片段PcM2M3—2克隆进相同的载体中，得到质粒pPcM2M3—2。以类似的方式使用Nocardialactamdurans的染色体DNA进行PCR扩增。使用寡核苷酸NlM2M3fWl(caccttaattaatgccgaagaggtcaccacc;SEQIDNO:17)和NlM2M3revl(ggtcatcgctccctagg;SEQIDNO:18)的反应得到DNA片段N1M2M3—1(结构域组构CATCATETe)，而使用寡聚体NlM2M3fw2(caccactagtctcatctcaccgtcgatg;SEQIDNO:19)和NlM2M3revl(ggtcatcgctccctagg;SEQIDNO.'18)的反应导致产生片段N1M2M3—2(结构域组构ATCATETe)。最终将两条片段均克隆进pENTR/SD/D-Topo载体中，分别得到质粒pMM2M3—1和pNlM2M3—2。2d.克隆对D-和L-氨基酸之间肽键形成特异的NRPS縮合结构域片段克隆了具有dCl立体化学的两种不同的縮合结构域。使用S^印towycascoe//co/or染色体DNA，使用寡核苷酸sc—C—fw(caccttaattaatagccagcaaccgacccgtgcg;SEQIDNO:20)禾口sc—C-rev(ttactagtgtcgcgggcgtacgcctcgtc;SEQIDNO:21)，从CDAI合成酶PCR-扩增第一结构域，得到片段sc—C。定制合成第二片段并命名为Bs—C，其由根据SEQIDNO:22的来自B.subtilis伊枯草菌素合成酶ItuC模块C2的NRPSDCLC-结构域组成。两条片段均被克隆进载体pENTR/SD/D-Topo中，分别得到质粒pSC一C和pBS一C。实施例3通过融合克隆出的NRPS模块和结构域盒来构建三肽非核糖体肽合成酶基用限制性酶Pad和Ascl消化质粒pHpgl，得到5.9kbDNA片段，其含有Hpg-特异的NRPS模块基因和大部分载体序列。用Ascl和Pad切割质粒pPcMlM2—1，显示8.5kbDNA片段。将该片段和来自pHpgl的5.925kb片段连接，给出载体pSCPCHybridl。用Spel和Ascl限制性消化质粒pPcMlM2—2、pSC一C，分别得到7.0kb和1.4kb的片段。连接两条片段并得到质粒pPcMlM2—3。用Pcil禾BPacl切割质粒pPcMlM2一3和质粒pHpgl，分别得到12kb和4.5kbDNA片段。连接两条片段得到最终构建体pSC—SC—C—PCM2M3Hybridl。用Pacl和Spel进一步限制性消化pSC—SC—C—PCM2M3Hybridl禾卩pBS—C分另ij得至U16kb(pSC—SC—C—PCM2M3Hybridl，不含ACV合成酶的C-结构域)和1.4kb(BacillussubtilisC-结构域)的片段。连接两条片段得到质粒pSC—BS—C—PCM2M3Hybrid2。用Pacl和AflII限制性消化pHpgl和pMMlM2—1，得到3.7kb和8.8kbDNA片段。连接两条片段得到质粒pSCNLHybridl。用SpeI和AflII限制性消化质粒pSC—SC—C—PCM2M3Hybridl和pNlMlM2—2，分别得到4kb(来自Hpg模块的ATEC四结构域组构和(D)C(L)结构域)和7kb(ATCATETe组构)片段。连接两条片段得到质粒pSC—SC—C—NLM2M3Hybridl。类似地，用Spel和AflII限制性消化质粒pSC—BS—C—PCM2M3Hybridl和pNlMlM2—2，分别得到4kb(来自Hpg模块的ATEC四结构域组构和(D)C(L)结构域)和7kb(ATCATETe组构)片段。连接产生质粒pSC_BS—C一NLM2M3Hybrid2。为了构建苯基甘氨酸特异的非核糖体肽合成酶融合基因，各自用AflII和Pacl限制酶限制性消化质粒pPgl和pSC—SC_C—NLM2M3Hybridl。将pPgl的3.4kbDNA片段(具有ATENRPS三结构域)连接至通过限制性消化pSC—SC—C—NLM2M3Hybridl获得的14kb载体片段，得到质粒pPg—SC—C—NlM2M3Hybridl。类似地，如果用载体pSC—BS—C—NLM2M3Hybrid2代替载体pSC—SC—C—NLM2M3Hybridl，则得到的质粒为pPg—BS—C—NlM2M3Hybrid2。实施例4构建用于杂种-非-核糖体g太合成酶的PenicilliumchysogenumGatewav⑧表达目的载体用Md消化质粒pPT12，其具有来自尸em'c/〃z'wwc/o^oge聽m的IPN合成酶的A^I-侧翼的启动子-终止子盒(载体描述见Theilgaard"a/.2000，BiotechnologyandBioengineering,72，380-387)。将藉此获得的IPNS启动子-终止子盒克隆进也用处理的pBluescriptIISK(Stratagene，荷兰)中。连接产生pProductl。用BamHl和Xhol限制性消化质粒pProduct1。另外，定制合成DNA片段，其带有位于gpdA启动子控制下的腐草霉素抗性盒。该盒具有根据SEQIDNO:23的序列。用BamHI和Xhol限制性消化该定制合成的DNA片段后，将得到的DNA连接进载体pProductl(其被BamHl、Xhol打开)中。得到的质粒称作pProduct2。在最后的克隆步骤中，从Gateway目的载体如pET-DEST42(Invitrogen,Carlsbad，CA,USA)PCR扩增含有attRl-cat画ccdB-attR2盒(氯霉素抗性和对E.coli的毒性基因)的DNA片段。使用以下的寡核苷酸fw:ttatcgatttgcataaaaaacagac(SEQIDNO:24)、rev:ttatcgatgcttaccttcaagcttcg(SEQIDNO:25)。用Clal限制性消化得到的DNA片段，随后将其克隆进pPraduct2，所述pPraduct2之前同样通过Clal消化被打开。此处，筛选以下述方向带有attRl-cat-ccdB-attR2片段的质粒，所述方向使得attRl被融合至接近IPNS启动子PIPNS。得到的Gateway⑧目标载体被命名为pDEST-Pcexprl。构建用于非核糖体肽合成酶的尸.c/rv^gem/m表达构建体为了构建P.c/o^ogewwm表达构建体，使用如Invitrogen所述的标准条件进行GatewayLR-Clonase反应。详细的方案见http:〃www.invitrogen.com上的Gateway⑧技术手册。就反应而言，将入门载体pSCNLHybridl、pSC—SC—C—NLM2M3Hybridl和pSC—BS—C—NLM2M3Hybrid2各自与Gateway目标载体pDEST-Pcexprl孵育。得到的表达质粒名称见表l。备选地，为了构建尸.cA/7wgemwT表达构建体，通过融合-PCR将含有经改造的三肽NRPS-基因的构建体与A^I-侧翼的启动子-终止子盒功能上连接，所述盒来自尸ew'cz很wmc/^wge"wm的；cZC-基因(载体描述见Theilgaard"a/.2000,BiotechnologyandBioengineering,72,380-387)。得到的表达质粒名称见表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例6用经线性化的质粒pEXPR-NRPS4转化Penicilliumchrysogenum，培养和三肽分析在独立的实验中，用pEXPR-NRPS4转化尸em'c/〃&mc/o^ogem/m，所述pEXPR-NRPS4在转化前被切割载体主链的合适酶线性化，所述酶例如PsiI或PciI。在含有50g/mL腐草霉素和1M蔗糖的矿物质培养基琼脂平板上进行对转化体的选择。将这些原生质体再生平板上出现的腐草霉素抗性菌落在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上重新划线并培养至孢子形成。通过菌落PCR针对NRPS基因的存在筛选腐草霉素抗性转化体。为此，将小块菌落悬浮于50LTE缓冲液(Sambrook"a/.，1989)中并在95°〇孵育10分钟。为了弃去细胞碎片，将混合物在3000rpm离心5分钟。上清液(5L)被用作PCR反应的模板，所述PCR反应使用来自HTBiotechnologyLtd的Super-Taq。在来自Invitrogen的E-gel96上分析PCR反应。菌落-PCR筛选中使用以下的寡核苷酸(见SEQIDNO:26和SEQIDNO:27):经转化的质粒pEXPR-NRPS4用于菌落PCR的寡核苷酸Fw:GCCTGGTGCCTGATGCRev:GGTGTGGTCGGAGACG这些PCR反应的期望大小为303bp。在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上对阳性克隆进行进一步纯化步骤。随后将它们在如"一般性材料和方法"中所述的矿物质培养基上培养。另外，根据分析的是何种三肽，添加氨基酸L-Hpg(4-羟苯基甘氨酸)或L-Pg(苯基甘氨酸)至1mM的终浓度。以摇瓶规模或在24-孔微量滴定板上进行培养。在发酵结束时，通过离心或过滤取出菌丝体，并用生理盐水洗涤菌丝体。使用MS技术如LC-MS/MS，针对三肽如DLD-Hpg-Cys-Val(在向培养基添加L-Hpg的情况下)禾BDLD-Pg-Cys-Val(在向培养基添加L-Pg的情况下)测定菌丝体和培养基二者。作为标准，使用定制合成的DLD-Hpg-Cys-Val和DLD-Pg-Cys-Val三肽。结果在菌丝体或培养基中，均未鉴定出三肽如DLD-Hpg-Cys-Val和DLD-Pg-Cys-Val三肽。结论是如果整合了NRPS表达盒构建体如pEXPR-NRPS4，那么尸.cAo^ogewwm不生产这些非天然的三肽。实施例7用经线性化的质粒pEXPR-NRPS5和pEXPR-NRPS6转化Penicilliumchrysogenum，培养和生产DLD-Hpg-Cys-Val三肽在独立的实验中，用pEXPR-NRPS5或pEXPR-NRPS6转化尸em'd〃!'wmc/ir"ogewMm，所述pEXPR-NRPS5或pEXPR-NRPS6在转化前被切割载体主链的合适酶线性化，所述酶例如PsiI或PciI。尸.cAowgem/m的转化在例如WO2004/106347中所述的条件下进行。在含有50g/mL腐草霉素和1M蔗糖的矿物质培养基琼脂平板上进行对转化体的选择。将这些原生质体再生平板上出现的腐草霉素抗性菌落在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上重新划线并培养至孢子形成。通过菌落PCR针对NRPS基因的存在筛选腐草霉素抗性转化体。为此，将小块菌落悬浮于50LTE缓冲液(Sambrooke"/.,1989)中并在95。C孵育IO分钟。为了弃去细胞碎片，将混合物在3000rpm离心5分钟。上清液(5L)被用作PCR反应的模板，所述PCR反应使用来自HTBiotechnologyLtd的Super-Taq。在来自Invitrogen的E-gel96上分析PCR反应。菌落-PCR筛选中使用以下的寡核苷酸(见SEQIDNO:26和SEQIDNO:27):经转化的质粒pEXPR-NRPS5或pEXPR-NRPS6用于菌落PCR的寡核苷酸Fw:GCCTGGTGCCTGATGCRev:GGTGTGGTCGGAGACG这些PCR反应的期望大小为303bp。在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上对阳性克隆进行进一步纯化步骤。随后将它们在如"一般性材料和方法"中所述的矿物质培养基上培养。另外，根据分析的是何种三肽，添加氨基酸L-Hpg(4-羟苯基甘氨酸)或L-Pg(苯基甘氨酸)至1mM的终浓度。以摇瓶规模或在24-孔微量滴定板上进行培养。在发酵结束时，通过离心或过滤取出菌丝体，并用生理盐水洗涤菌丝体。使用MS技术如LC-MS/MS，针对三肽如DLD-Hpg-Cys-Val(在向培养基添加L-Hpg的情况下)禾卩DLD-Pg-Cys-Val(在向培养基添加L-Pg的情况下)测定菌丝体和培养基二者。作为标准，使用定制合成的DLD-Hpg-Cys-Val和DLD-Pg-Cys-Val三肽。菌丝体和上清液显示显著水平的三肽DLD-Hpg-Cys-Val三肽。使用未经转化的尸.c力o^ogem/m菌株Wisconsin54-1255(ATCC28089)的负对照显示不形成DLD-Hpg-Cys-Val三肽。该结果给出证明被转化的经改造的非核糖体肽合成酶产生非天然的三肽DLD-Hpg-Cys-Val。实施例8用经线性化的质粒pEXPR-NRPS7和pEXPR-NRPS8转化Penicilliumchrysogenum，培养和DLD-Pg-Cvs-Val三肽生产在独立的实验中，用pEXPR-NRPS7或pEXPR-NRPS8转化尸em'c"/^mcAo^og朋wm，所述pEXPR-NRPS7或pEXPR-NRPS8在转化前被切割载体主链的合适酶线性化，所述酶例如PsiI或PciI。P.cAo^ogem/m的转化在例如WO2004/106347中所述的条件下进行。在含有50g/mL腐草霉素和1M蔗糖的矿物质培养基琼脂平板上进行对转化体的选择。将这些原生质体再生平板上出现的腐草霉素抗性菌落在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上重新划线并培养至孢子形成。通过菌落PCR针对NRPS基因的存在筛选腐草霉素抗性转化体。为此，将小块菌落悬浮于50LTE缓冲液(Sambrook"fl/.,1989)中并在95。C孵育IO分钟。为了弃去细胞碎片，将混合物在3000rpm离心5分钟。上清液(5L)被用作PCR反应的模板，所述PCR反应使用来自HTBiotechnologyLtd的Super-Taq。在来自Invitrogen的E-gel96上分析PCR反应。菌落-PCR筛选中使用以下的寡核苷酸(见SEQIDNO:26和SEQIDNO:27):经转化的质粒pEXPR-NRPS7或pEXPR-NRPS8用于菌落PCR的寡核苷酸Fw:GCCTGGTGCCTGATGCRev:GGTGTGGTCGGAGACG这些PCR反应的期望大小为303bp。在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上对阳性克隆进行进一步纯化步骤。随后将它们在如"一般性材料和方法"中所述的矿物质培养基上培养。另外，根据分析的是何种三肽，添加氨基酸L-Hpg(4-羟苯基甘氨酸)或L-Pg(苯基甘氨酸)至lmM的终浓度。以摇瓶规模或在24-孔微量滴定板上进行培养。在发酵结束时，通过离心或过滤取出菌丝体，并用生理盐水洗涤菌丝体。使用MS技术如LC-MS/MS，针对三肽如DLD-Pg-Cys-Val(在向培养基添加L-Pg的情况下)测定菌丝体和培养基二者。作为标准，使用定制合成的DLD-Hpg-Cys-Val和DLD-Pg-Cys-Val三肽。菌丝体和上清液显示显著水平的三肽DLD-Pg-Cys-Val三肽。使用未经转化的尸.c/o^ogewwm菌株Wisconsin54-1255(ATCC28089)的负对照显示不形成DLD-Hpg-Cys-Val三肽。该结果给出证明被转化的经改造的非核糖体肽合成酶产生非天然的三肽DLD-Pg-Cys-Val。实施例9通过DLD-HpgCV的转化体外生产阿莫西林从甘油菌禾中中接禾中含有户em'"'肌wmc/^wge做m(pAJL-pcbC)、7VocflWa/actomt/wra似(pAJL-/cZC-NL)禾口y^erg7.〃wsw油/朋s(pXTN313)的/dC-基因的三种不同构建体，并在2xTY和每ml35吗氯霉素中于37°C下过夜培养。各个pAC-基因编码IPNS，所述IPNS被生产为与MBP(麦芽糖结合蛋白质)的融合蛋白，所述MBP由来自E^Aen'c/^aco//的附a氾-基因编码。謹/E卞cK:融合基因处于IPTG-诱导型tac-启动子的控制下。从过夜培养物中分离质粒DNA。经分离的DNA被用于转化五.co/z'TOP10(Invitrogen)。使用一个经分离的菌落来接种补充有35吗氯霉素/ml的10ml2xTY。在37。C和280rpm下0/N孵育后，OD600将菌株稀释至100ml新鲜培养基中，达到0.015的终OD6GQ。允许在37"和280rpm生长，直到OD,达到0.4和0.6之间的数值。添加IPTG至0.5mM的终浓度。在22'C和220rpm继续孵育过夜。通过离心收集细胞并用milliQ水中0.9%NaCl洗涤。将细胞沉淀物重悬于1.5ml提取缓冲液(50mMTris.HClpH7.5;0.5mg溶菌酶/ml、5mMDTT)中。进行超声处理，从而裂解细胞。在14000rpm下在Eppendorf离心机中离心10分钟后，收集200pl等分式样并在液氮中冷冻。将冷冻的细胞提取物储存于-8(TC。用ACV和HpgCV作为底物进行IPNS活性测定。与用于IPNS活性测定的标准测定条件不同，对测定混合物进行修饰，从而最大化成功的机反应混合物如下反应混合物1(标准测定)30-50mMTris.HClpH8.0(优选地36mM)l-6.7mM抗坏血酸(优选地3mM)50|uM到2mMFeS04(优选地86|iM)0.3-2mM三肽(对ACV而言优选地1.5mM，对HpgCV而言优选地0.75mM)0.75-4mMDTT(优选地3mM)通过将二份等分式样的7.5mM二-ACV与一份等分式样的60mMDTT混合，然后在室温下孵育5到25分钟，将二-ACV还原为ACV。类似地，在实际测定前还原HpgCV。反应混合物2(备选测定)30画50mMHEPESpH7.0(优选地36mM)0.1-0.2加]\4抗坏血酸(优选地0.1mM)l匿50|nMFeSO4(优选地25pM)0.3-2mM三肽(对ACV而言优选地1.5mM，对HpgCV而言优选地1.5mM)0.2-1.2mMTCEP(三(2-羧乙基)膦)(优选地1mM)用TCEP预处理二-ACV，从而破坏二聚体中的S-S键。为此，将二等分式样的7.5mM二-ACV或HpgCV与一等分式样的20mMTCEP混合，然后在室温下孵育5到25分钟。将含有MBP-IPNS融合蛋白的5plCFE与595pl前述反应混合物孵育。在25。C下孵育IO分钟后，通过添加125pl反应与50nl冰冷的甲醇终止反应。在-2(TC下孵育至少一个小时后，通过LC/MS分析样品。使用以下的设定在LCQ(ThermoScientific)上进行LC/MS分析洗脱液洗脱液A:MilliQ水中0.1。/oFA洗脱液B:MilliQ水中0.1%FA梯度T(分钟)流速(ml/分钟)％A%B0.00.29825.00.298220.00.2782220.10.298230.00.2982柱VarianInertsil3ODS3CP22568150*2.1mm3,柱温度55°C流速0.2ml/分钟注射体积25^支架(tray)温度4°C滞留时间:固阿莫西林氨节西林约12.2分钟约4.9分钟约16.5分钟MS设备LC/MSLC/MS/MSLC/MS/MS/MSLCQ(SM05)OFFaxisESI/posProbe高度nr6,深度nr3360iw=5.0aa=30%366iw=5.0aa=30%350iw=5.0aa=30%349iw=5.0aa=30%m/z范围微扫描(microscans)注射时间MS:200-10001500ms用milliQ水将样品稀释10倍，并将25^注射进LC/MS体系中。以滞留时间(LC)、质核比(massovercharge,m/z)值(MS)以及在MSn-模式中裂解的裂解谱为基础鉴定底物(ACV、HpgCV、PgCV)和产物(IPN、阿莫西林、氨苄西林)。结果在下表中概述。表2:通过来自不同来源的MBP-IPNS融合蛋白将底物ACV和HpgCV分别转化为IPN和阿莫西林。ACV->IPNHpgCV^阿莫西林起源pcbC-基因反应混合物1反应混合物2反应混合物1反应混合物2P.c/7/ysoge〃"m16%50%0%0.0006%36%98%0%0扁7%36%99%0%0.0006%惊人地，在反应混合物2的实验条件下，MBP-IPNS能够将HpgCV转化为阿莫西林，而在反应混合物1的条件下阿莫西林均不被转化。实施例10开发允许检测DLD-HpgCV到阿莫西林的转化的生物测定法在2xTY-培养基中，于3(TC和280rpm下将细菌菌株^c/im'c/u'aco/ZESS、5ac飾sATCC6633禾口M/cracoccws/她wsATCC9341培养过夜。培养16小时后测量OD6QQ。典型地，OD自值为5.0，范围从2.0到8.0。制造浓度为7mg/ml的阿莫西林溶液。随后制造范围从1mg/1低至0.001mg/1的系列稀释液。MilliQ被用作负对照。在96孔微量培养板中，将25pl系列稀释液移入孔中。一式两份制备各微量培养板。在新鲜的2xTY-培养基中将过夜的细菌培养物稀释至0.01的OD6QQ。向每个孔中添加150pi经稀释的细菌培养物。用盖子盖上微量培养板并在25"C孵育，重复的微量培养板在37'C孵育。孵育16小时后，在微量培养板读数器中读出OD6QQ。根据该结果，可以读出仍然允许测试微生物不受抑制的生长的阿莫西林浓度。表3:仍然允许在2xTY培养基中不受抑制的生长的阿莫西林浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>实施例11开发允许检测DLD-PgCV到氨苄西林的转化的生物测定法在2xTY-培养基中，于3(TC和280rpm下将细菌菌株EscAm'c/n'aco//ESS、5a"'〃M55"Z"foATCC6633禾卩MzcracoccM/w,e"5ATCC9341培养过夜。培养16小时后测量OD,。典型地，OD自值为5.0，范围从2.0到8.0。制造浓度为7mg/ml的氨苄西林溶液。随后制造范围从1mg/l低至0.001mg/l的系列稀释液。MilliQ被用作负对照。在96孔微量培养板中，将25pl系列稀释液移入孔中。一式两份制备各微量培养板。在新鲜的2xTY-培养基中将过夜的细菌培养物稀释至0.01的OD6QQ。向每个孔中添加150^经稀释的细菌培养物。用气体可通透的粘性密封圈盖上微量培养板并在25t:孵育，重复的微量培养板在37X:孵育孵育16小时后，在微量培养板读数器中读出OD,。根据该结果，可以读出仍然允许测试微生物不受抑制的生长的氨苄西林浓度。表4:仍然允许在2xTY培养基上不受抑制的生长的氨苄西林浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>实施例12针对DLD-HpgCV到阿莫西林的体外转化来筛选来自不同属的"AC-基因在DNA2,0(1430O'BrienDrive,SuiteE，MenloPark,CA94025,USA)定购来自11个物种的pc6C-基因的编码区。为此，采取编码区的DNA序歹ll作为基石出。选择了以下的物禾中Cep/^/as/on'wmJcremom'wm、为了简化将来的克隆步骤，将起始密码子的序列改变为M/el的识别位点CATATG。同样，在终止密码子之后立即引入A^I-位点(ATGCAT)。尽可能多地去除内部A^z'I-禾t]iVJel-位点。用A^I和MM切割带有pc6C-基因的质粒，将pc6C-基因的编码区分离并亚克隆进被相同的酶切割的载体pSJ127中。用这种方式将；cM:-基因的编码区与编码麦芽糖结合蛋白的m"/五-基因按照读码框克隆，处于诱导型启动子的控制下。诱导表达后会合成融合蛋白，其由融合蛋白N-末端的麦芽糖结合蛋白和C-末端的IPNS组成。在含35)ig氯霉素/ml的2xTY-培养基中，将用ma/五-;c6C-质粒转化的Eco/fTOP10于37"C下和280rpm培养过夜。第二天测量OD,并将细胞在新鲜培养基中稀释至0.015的OD,。进一步培养细胞(37。C,280rpm)，直到OD,达到0.4和0.6之间的数值。添加IPTG至0.5mM的终浓度。在22°C、280rpm继续培养过夜。通过在5000rpm和4°C下离心10分钟收获细胞。用0.9%NaCl-溶液洗涤细胞，并通过离心再次沉淀。将细胞沉淀物在-2(TC冷冻至少16个小时。将细胞沉淀物重悬于1.5ml提取缓冲液(50mMTris.HClpH7.5;5mMDTT)中并通过超声处理制造提取物。在Eppendorf离心机(10分钟，14000rpm,4°C)中离心提取物从而去除细胞碎片。将上清液(无细胞提取物，CFE)等分进新鲜的Eppendorf管中，并冷冻于液氮中，随后储存在-8(TC。如下文所述来测定HpgCV到阿莫西林的转化。首先，通过将500^200mMHpgCV与500jul20mMTCEP混合然后在25。C下孵育10分钟，将底物HpgCV还原。其次，制造以下测定混合物(用于10个反应)300pi0.5mMFeS04.7H20;480)il1.25mM抗坏血酸；4270pi50mMHEPES(pH7.0)。通过将90pl被还原的底物、505pi测定混合物和5^含有MBP-IPNS融合蛋白的CFE混合来起始反应。将反应混合物在25°C孵育10分钟。在微量培养平板中，将25^反应混合物与150pi经稀释的Mz'cracoccM在2xTY中的过夜培养物(OD柳^.01)混合。为了证明任何可能的生长抑制是由阿莫西林的形成引起的，还在存在/3-内酰胺酶(来自BBLDifco的Penase)时测试每个样品，所述/3-内酰胺酶切割/3-内酰胺环并从而使抗生素活性失活。用盖子盖上微量培养板并在3(TC和550rpm下孵育过夜。在微量培养板读数器上读出OD6QQ。惊人地，来源于来自Am't/w/a似以及来自S.c/avw//gen^的户AC-基因的MBP-IPNS融合蛋白均显示对M./wteM的生长抑制，所述M./wtet^在存在Penase⑧时完全生长，表明抑制是由于从DLD-HpgCV形成了阿莫西林。这通过LC-MS/MS分析证实。为此，通过添加125pl反应混合物与50^冰冷的甲醇(-20。C)终止反应。将样品在-2(TC下孵育至少一个小时。进行离心步骤(4。C下14000rpm15分钟)，然后进行LC-MS/MS分析(见实施例9)。结果证实了生物测定法的结果。包括进LLD-ACV作为对照。事实上如所预期的，几乎所有的MBP-IPNS融合蛋白形成了IPN(异青霉素N)。向反应混合物中添加Penase消除了观察到的效果。再次通过LC-MS/MS证实了该结果。实施例13工程改造zcZ)C-基因使用来自Clontech的DiversifyPCR试剂盒，根据供应商的指导对克隆pSJ-AnIPNS(来自AmV/w/a似的pc6C-基因)和pSJ-ScIPNS(来自Xc/flvw/^ems的pc6C-基因)进行易错PCR(EP-PCR)。简而言之，可通过应用不同的PCR条件修饰通过PCR引入的错误数。使用限制性酶A/"&I和A^'I将被扩增的pc^C-插入物亚克隆进表达载体pBADMHmalEDEST中。在该质粒中，IPNS也会作为MBP融合蛋白被生工针对应用的每个条件对10个克隆加以测序。选用下述文库来筛选关于HpgCV到阿莫西林的转化被改进的变体，所述文库中观察到每kb约1个突变的突变率。培养被选择的Am'^/a朋-和S.c/avM//gemspcbC文库，并使用限制性酶A/t/el和Nsi将插入物亚克隆进表达载体pBADMHmalEDEST中。在该质粒中，IPNS也会作为MBP融合蛋白被生产。构建第三文库，其中在来自AmWM/a似的；cZ7C-基因中特异的位置上引入突变(定点途径)。根据两个标准选择这些位置a)在活性中心里产生空间，和b)削弱C-末端结合。活性中心里空间的产生可有益于改进天然IPNS对HpgCV的活性，因为Hpg-基元比ACV中的a-氨基己二酸盐-基元更大。当酶没有负荷底物时，IPNS分子的C-末端作为半底物作用。在底物通向活性中心的通道上，C-末端縮回，为底物产生空间。为了防止C-末端和底物之间的该竞争，此处同样引入了变更。选择八个氨基酸位置用于修饰175、Y91、S183、V185、N287、L321、L324和T331。涉及引物33-聚体，其中三个中部核苷酸(编码要被修饰的氨基酸)被随机化(NNN)，从而创建了得到的IPNS分子中指定位置上存在任何氨基酸的可能性。因此通过融合PCR修饰所有八个位置，得到八个亚-文库，每个亚-文库具有单个位点突变。制造了一个额外的文库，其中所有的突变以随机方式组合。另外，在该情况下使用限制性酶M/el和A^1，将藉此获得的文库的插入物亚克隆进表达载体pBADMHmalEDEST中。将三种文库从甘油菌种涂布在每ml含50zeocin的选择性琼脂-培养基上。对每个EP-PCR文库挑取2500个独立的克隆，并用于在96孔板中接种每ml含50|igzeocin的150pi2xTY-培养基。对定点文库而言，从每个亚-文库挑取200个克隆用于在96孔板中接种每ml含50zeocin的150^2xTY-培养基。在37'C和280rpm生长过夜后，将5pi铺满培养物(confluentculture)转移至深孔微量培养板中每ml含50zeocin的1ml新鲜2xTY-培养基中。允许在37。C和280rpm生长，直到横跨微量培养板的平均OD,达到0.4和0.6之间的数值。通过向每个个体孔中添加40nl5。/。L-阿拉伯糖，诱导细胞生产MBP-IPNS融合蛋白。随后将细胞在22"和220rpm培养24小时。通过离心收获细胞。弃去上清液并将细胞沉淀物在-2(TC下冷冻过夜。向含有细胞沉淀物的每个孔中添加100pl裂解缓冲液(50mMHEPESpH7.0;0.5mg/ml溶菌酶；0.1mg/mlDNAseI;5mMDTT;5mMMgS04)，然后在室温下孵育30分钟。对微量培养板加以离心，并将50JLll上清液转移至新鲜的微量培养板。向上清液中添加50|il测定混合物(50mMHEPESpH7.0;1mMTCEP;100pM抗坏血酸钠；25^M硫酸铁；5mMHpgCV)，然后在25°〇下孵育30分钟。添加125^在2xTY中稀释的M./Wew^培养物(终OD^为0.01)。将平板在3(TC孵育过夜。使用微量培养板读数器读出OD600。从定点A"/^/"似文库中选择18个克隆，16个来源于V185亚-文库，2个来自重组的亚-文库。所有这些克隆均显示对M./"tew生长的完全抑制，表明形成了抑制指示菌株生长的化合物。根据上述方案再次测试该抑制，又是阳性。另外，添加Penase⑧时不存在该抑制，表明抑制化合物为/3-内酰胺。在每ml含50pgzeocin的10ml2xTY中培养阳性克隆。在该测定中包括进pBAD-AnpcbC作为IPNS的对照来源。在37。C和280rpm培养过夜后测定OD6QQ。将每ml含50pgzeocin的100ml2xTY培养基接种至0.015的起始OD6lX)。将细胞在37。C和280rpm培养，直到OD,达到0.4到0.6的数值。通过添加L-阿拉伯糖至0.2%的终浓度，诱导融合蛋白MBP-IPNS的生产。培养在22。C和220rpm维持过夜。收获和洗涤细胞并在-2(TC冷冻过夜。通过添加1.5ml裂解缓冲液(50mMHEPESpH7.0;0.5mg/ml溶菌酶；0.1mg/mlDNAseI;5mMDTT;5mMMgS04)然后在室温下孵育30分钟制备细胞裂解物。将提取物离心，并将上清液(CFE)移液进新鲜管中。进行了两种生物测定1)液体生物测定将8plCFE与592pl测定混合物(50mMHEPESpH7.0;1mMTCEP;100|aM抗坏血酸钠；25pM硫酸铁；5mMHpgCV)混合。在25。C孵育IO分钟后，添加125pl在2xTY中稀释的M./她,培养物(终OD,为0.01)。使用ACV作为对照底物(LLD-和DLD-PgCV均可使用，尽管DLD-PgCV是优选的底物)。另外，对每个样品而言包括额外的对照，其中向测定混合物中添加Penase。在3CTC过夜培养后，读出OD600。2)在琼脂平板上的生物测定将8plCFE与592^测定混合物(50mMHEPESpH7.0;1mMTCEP;lOO)iM抗坏血酸钠；25pM硫酸铁；5mMHpgCV)混合。在25。C孵育IO分钟后，将50pl测定混合物点在其中制造了孔洞的琼脂平板中。对每个样品而言包括额外的对照，其中向测定混合物中添加Penase⑧。琼脂由2xTY-琼脂组成，其补充有M./wte^至0.01的终0D,。在3(TC孵育过夜后，评价i3-内酰胺的作用导致的亮区(clearedzone)的存在或不存在。表5显示了对一些突变体活性的综述。每种突变体代表了对作为底物的HpgCV具有相当的IPNS活性的更大组的突变体。来自Am'^/fl朋和Xc/ara/Zgw船的野生型IPNS酶的活性低于这些筛选测定的检测极限。表5:对选择的克隆和对照的IPNS活性进行的生物测定的综述。<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>对筛选中的所有阳性克隆进行序列分析，并对代表性的克隆进行LC/MS分析。进行LC/MS分析允许基于滞留时间、化合物的质量和产物的发酵模式鉴定形成的产物。通过标准加入法测定生产的阿莫西林量并以AU/mg蛋白质为单位表达，其中AU代表特定的反应条件下10分钟内形成的阿莫西林量(以ng为单位)。表6综述了克隆、被改变的氨基酸残基和克隆对HpgCV的活性(在五.co//CFE中以AU阿莫西林/mg蛋白质为单位)。表6:活性IPNS突变体的突变和对HpcCV的活性的综述<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>n.d.=不可检湖!]的实施例14DLD-PgCV到氨苄西林的转化在作为底物的DLD-PgCV上测定来自Am't/w/a氾的野生型pcZ)C-基因和突变体pc6C-克隆36A4(V185R)、35A12(V185K)、35F1(V185K,V293A)、36F3(T111A,H135R，V185R)、35H12(V185K,P190H)、36C4(V185H,T331C)的活性。为此，将克隆在每ml含有50吗zeocin的10ml2xTY中培养。在37。C和280rpm下过夜培养后，测量OD6QQ。将每ml含有50pgzeocin的100ml2xTY培养基接种至0.015的初始OD,。在37°C和280rpm下培养细胞，直到OD,达到0.4和0.6之间的数值。通过添加L-阿拉伯糖至0.2%的终浓度诱导融合蛋白MBP-IPNS的生产。培养在22。C和220rpm下维持过夜。收集并洗涤细胞，并在-2(TC冷冻过夜。通过添加1.5ml裂解缓冲液(50mMHEPESpH7.0;0.5mg/ml溶菌酶；0.1mg/mlDNAsel;5mMDTT;5mMMgS04)然后在室温下孵育30分钟制备细胞裂解物。将提取物离心，并将上清液(CFE)移液进新鲜管中。将8|ulCFE与592pi测定混合物(50mMHEPESpH7.0;1mMTCEP;100pM抗坏血酸钠；25jiM硫酸铁；5mMPgCV)混合。在25。C孵育10分钟后，向5(^1反应混合物中添加100pl在2xTY中稀释的M./wte,培养物(终OD^为0.01)。使用ACV作为对照底物。另外，对每个样品而言包括额外的对照，其中向测定混合物中添加Penase。在30°C过夜培养后，读出OD6°Q。所有的样品，甚至野生型A",/"朋IPNS融合蛋白到MBP都惊人地导致M./MteW生长的抑制。对这些样品进行LC/MS分析，允许基于滞留时间、化合物质量和产物的发酵模式鉴定形成的产物。通过标准加入法测定产生的氨苄西林量。在表7中概括了PgCV的活性。表7:通过LC-MS分析测定的突变体和野生型MBP-IPNS融合蛋白对PgCV的活性(以每10分钟每mg总蛋白质的ng产物为单位)。突变体活性(AU/mg蛋白质)AA/Gfw/aAsIPNS中的位置1111351852"29333136A4■V185R35A12150V185K35F1150V185KV293A36F330T1"AH135RV185R35H1250V185KP190H36C41V185HT331Cw.t.1实施例15构建生产D-Hpg或L-Hpg的Penicillium菌株15a构建Pem'cz7/z'Mm表达质米立通过从WO02/34921中所述的不同的相应pBAD质粒中PCR扩增来自J附;;co/ato/wz、on'ewtofe禾口5Vr印towy;cescoe/z'co/or的夢5基苯乙醇酸盐合成酶的基因(hmaS)和编码羟苯基甘氨酸氨基转移酶的基因(分别为来自尸wwfifomow"spz^z'da的hpgAT禾口来自《SW^/7to/w_ycMcoe/z'co/or的hpgT)，将这些基因克隆在质粒pIPCLTA中。从pGEM-Bldm扩增编码来自i^M^mowas的苯乙醇酸盐脱氢酶的基因md/3。选择的MM和位点中的插入，导致适当基因的ATG与启动子融合。通过PCR扩增所有的基因，并通过在上游引物中引入限制性位点和在下游引物中引入A^'I限制性位点构建扩增引物。因为来自尸w^/蘭o"w，/Wa的基因/^g^r含有内部A^I-位点，所以进行备选途径，其中使用引入A^el-和^al-位点的引物扩增插入物。将带有额外的Mfel/S^I位点的PCR片段作为平末端片段亚克隆进克隆载体pCR-blunt-TOPO(Invitrogen)43中，导致pCi-W-/^^4J>p的构建。序列测定揭示其下述质粒含有正确的插入物(其包含侧翼的MM/^sal位点)后，通过在pIPCLTA的7VtM//>zlOI位点中克隆含有/^^47、基因的A^el/fodt片段，将所述质粒用于构建pIPphpgATgWA。在pIPCLTA中，在该载体中引入的基因处于Pem'c/〃/wmc/owgem/m的pAC-启动子控制下。另外，这些构建体中使用编码酰基转移酶的户ewZ)五-基因的转录终止子。构建以下的表达盒:<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>在对上述基因的克隆扩增中使用以下的引物:A:ylmvco/fl鄉57、基因;"o/ma5"g环C4的构建hmaS-Ao-Nde:5，-CAGGAGGAATTACATATGCAGAATTTCGAG(SEQIDNO:28)hmaS-Ao-Nsi:5，-CGGCCAGGGATGCATACGTCATCGCCGAGC(SEQIDNO:29)/75coAma&『v4的构建hmaS匿Sc-Nde:5'匿CAGGAGGAATTACATATGCCGCCCAGTGAC(SEQIDNO:30)hmaS-Sc画Nsi:5，-GAATTCCCATATGCATCCAGGTCATCGGCC(SEQIDNO:31)//5bo//7^Tg『J的构建hpgT-Sc陽Nde:5，-CAGGAGGAATTACATATGACCACCACCACC(SEQIDNO:32)hpgT-Sc-Nsi:5'陽TCCCATATGCATCCTCAACCGTTAGACGCC(SEQIDNO:33)C:i^g"^/o附o"d^/""fifa基因p/P;mJ/Sg『J的构建hpgT-Sc-Nde:5，-GTGAGGTAACATATGAGCCAGAATCTCTTT(SEQIDNO:34)hpgT-Sc-Nsi:5，-GTAATCAATGCATCACTCATGCGTGTGTTC(SEQIDNO:35)p/i^/^^4:rg『j的构建hpgAT-Nde5，-CAGGAGGAATTACATATGTCTATTTATAGC(SEQIDNO:36)hpgAT-翻I5，-GTCCTCGGTCTCATGCATCTCGAGTTAGCCCAGGAGGT(SEQIDNO:37)15b转化Pewc涯'wmcA，ogew讓用切割质粒pIAohmaSgWA、pIScohmaSgWA、pIPpmd旧gWA、pIPphpgATgWA和pIScohpgTgWA,所述7Vo/I将表达盒从载体上切割下来。用4ofDNA(即Mrt-消化产物)和0.25选择标记物片段转化来自DSM的工业青霉素-生产菌株尸6"/"7//1/附c/o^oge肌mDS12975。在该情况下，使用赋予腐草霉素抗性的片段。45转化了以下的表达盒组合:<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>在每升含有1克和1M蔗糖的矿物质培养基琼脂平板上进行对转化体的选择。在原生质体再生后出现的腐草霉素抗性菌落在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上再划线，并培养至孢子形成。将转化体在相同的培养基上划线，并使用对个体基因特异的弓I物通过PCR验证表达盒的整合。在琼脂斜面管中划线含有三种目的基因的转化体，并在冰上形成孢子。选择以下的菌株用于进一步分析:<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>15c通过Pgm'cz加Mm转化体发酵生产D-Hpg将Pem'c"/z't/mc/o^ogem/m转化体AFF108、AFF133、AFF146和AFF152在摇瓶上培养6天。通过NMR测定细胞内和细胞外产物。表8:通过NMR检测的细胞内D-Hpg浓度。细胞培养3到6天。<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>将细胞培养3、4、5和6天，以寻找D-Hpg的最适度。3天后的浓度足够高到在NMR谱中检测峰并定量D-Hpg含量。所有选择的转化体生产了可检测的D-Hpg水平，但是在AFF133(80/xg/gDW)中观察到最高的D-Hpg浓度。结果列于表8中。15d通过尸em'cW"m转化体发酵生产L-Hpg将含有L-Hpg生物合成基因的尸e"/c/肌wwc/o^oge"ww菌株AFF158、AFF162、AFF164、AFF191、AFF193和AFF195在摇瓶中培养3、4、5和6天。通过NMR测定细胞内和细胞外产物。仍然未能检测到细胞外产物，但是对细胞内而言，感受到了重大的L-Hpg水平(见表9)。可针对所有的菌株定量细胞内L-Hpg水平，并列于表6中。与D-Hpg水平不同，L-Hpg水平随时间提高并在培养5或6天左右达到最佳。在AFF195菌丝体中测量到在最高浓度，其为每克干重2.6mgL-Hpg。L-Hpg生产菌株获得的细胞内浓度是最高的D-Hpg生产者AFF133的30倍高。表9:通过NMR检测的细胞内L-Hpg浓度。<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>在接下来的实验中，将细胞培养5、6和7天，然而在5或6天后，L-Hpg浓度未进一步提高而是开始下降(数据未显示)。实施例16通过尸.c/mog纖/w发酵生产阿莫西林用以下的组合转化如专利申请PCT/EP2007/054045中所述的不含青霉素生物和成簇的尸e""'〃&mcAow)gem/w菌株l)带有编码HpgCVS(DLD-Hpg-Cys-Val合成酶)的NRPS-基因的质粒pEXPR-NRPS6(见表O，2)带有编码IPNS突变体V185R的基因的质粒，和3)带有来自Sflcz7/wZ^ev/s的编码Ppant-转移酶(PPT)的处于忍WJ-启动子控制下的g^-基因的质粒。在含有50Mg/mL腐草霉素和1M蔗糖的矿物质培养基琼脂平板上进行转化体的选择。将原生质体再生后出现的腐草霉素抗性菌落在不含蔗糖的新鲜腐草霉素琼脂平板上重新划线并培养至孢子形成。对每个转化体而言，在矿物质培养基上培养约100个菌落。另外，以从1mM到10mM变化的浓度添加氨基酸L-Hpg。在摇瓶上或24-孔微量滴定板中进行培养。赋予在200rpm下25。C进行一周。在若干个时间点(4天到7天)取样。离心发酵液从而去除菌丝体。取出总发酵液样品并冻干。针对阿莫西林的存在对冻干的发酵液样品和上清液二者加以分析。在上清液的情况下，如实施例2中所述，分别向190和150^M/wte^培养物中添加10和50|il上清液。向样品中添加Penase⑧作为对照，所述Penase⑧降解阿莫西林。若干个转化体显示对M./w/e^生长的抑制，表明转化体生产的阿莫西林的作用。Penase⑧的添加阻止了对M./wtew生长的抑制。用100-500^1l热milliQ水(90。C;体积取决于生物质的量)处理冻干的发酵液样品，从而制造裂解液。如上所述，将IOjil和50)ul裂解液分别与150|il和190|il经稀释的M./t/teus培养物混合。同样添加Penase⑧对照。在该情况下，若干样品也抑制了M./Mtet^的生长。阳性提取物对应于上清液样品。如实施例9中所述，通过LC/MS/MS证实了形成的/-内酰胺的身份为阿莫西林。权利要求1.用于制备N-α-氨基-羟基苯乙酰或N-α-氨基苯乙酰β-内酰胺抗生素的工艺，所述工艺包括将三肽羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)或三肽苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(PgCV)与IPNS接触，实现N-α-氨基-羟基苯乙酰β-内酰胺抗生素或N-α-氨基苯乙酰β-内酰胺抗生素的形成。2.根据权利要求1的工艺，其中所述IPNS与SEQIDNO:1的氨基酸序列具有至少50%的同一性程度，并且，使用SEQIDNO:1的位置编号与SEQIDNO:1的氨基酸序列比对时，其在第185上含有精氨酸、赖氨酸或组氨酸，并且任选地，在位置91、104、183、190、321、324、325、331中的至少一处含有修饰。3.根据权利要求1或2的工艺，其中如下制备所述三肽HpgCV或三肽PgCV:将氨基酸羟苯基甘氨酸(Hpg)或苯基甘氨酸(Pg)、半胱氨酸(C)和缬氨酸(V)与非核糖体肽合成酶(NRPS)接触，实现三肽HpgCV或三肽PgCV的形成，所述NRPS包含对Hpg或Pg特异的第一模块Ml、对C特异的第二模块M2和对V特异的第三模块M3。4.根据权利要求1到3中任一项的工艺，其中羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸是DLD-对羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸，且N-o;-氨基-羟基苯乙酰^内酰胺抗生素是阿莫西林。5.根据权利要求1到3中任一项的工艺，其中苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸是DLD-苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸，且N-a-氨基苯乙酰/3-内酰胺抗生素是氨苄西林。6.根据权利要求1到5中任一项的工艺，其中IPNS实现青霉垸/3-内酰胺抗生素的形成，且所述青霉烷/3-内酰胺抗生素被进一步转化为头孢烯/3-内酰胺抗生素。7.根据权利要求6的工艺，其中所述头孢烯/3-内酰胺抗生素是头孢羟氨苄或头孢氨苄。8.根据权利要求1到7中任一项的工艺，所述工艺在体内进行。9.一种变体IPNS酶，其在使用SEQIDNO:1的位置编号与SEQIDNO:1的氨基酸序列比对时，在第185上含有精氨酸、赖氨酸或组氨酸，并且任选地，在位置91、104、183、190、321、324、325、331中的至少一处含有修饰。10.—种催化三肽HpgCV或三肽PgCV形成的非核糖体肽合成酶(NRPS)，所述NRPS包含Hpg或Pg特异的第一模块Ml、对C特异的第二模块M2和对V特异的第三模块M3。11.权利要求10的肽合成酶，其中所述对Hpg特异的第一模块Ml可《寻自CDA合成酶、Chloroerenomycin合成酉每禾口/或Complestatin合成酶。12.权利要求10的肽合成酶，其中所述对pg特异的第一模块Ml可得自普那霉素合成酶。13.权利要求10-12中任一项的肽合成酶，其中所述M2模块包含与可得自ACVS第二模块的A结构域融合的DCL结构域，其中所述DQi吉构域对于所述A结构域来说是异源的。14.权利要求10-13中任一项的肽，其中所述模块M2的所述°(^结构域可得自所述第一模块来源的酶。15.权利要求10-13中任一项的肽合成酶，其中所述模块M2的°(^结构域是CDA合成酶的第七模块的C结构域。16.权利要求10-13中任一项的肽合成酶，其中所述模块M2的DCl結构域是伊枯草菌素合成酶第二模块的C结构域。17.权利要求10-16中任一项的肽合成酶，其中所述M2模块的A和T结构域和整个模块可得自ACVS，优选地得自细菌或真菌的ACVS。18.包含下述DNA序列的多核苷酸，所述DNA序列编码权利要求9的IPNS。19.包含下述DNA序列的多核苷酸，所述DNA序列编码权利要求10-17中任一项的肽合成酶。20.用权利要求18和/或19的多核苷酸转化的宿主细胞。21.权利要求20的宿主，其进一步被通向氨基酸Hpg或Pg的生物合成途径的基因转化。22.权利要求20或21的宿主，其包含通向/3-内酰胺抗生素的生物合成途径，优选地其中编码ACVS禾B/或IPNS的基因被失活。23.用于生产N-a-氨基-羟基苯乙酰iS-内酰胺抗生素或N-ce-氨基苯乙酰/5-内酰胺抗生素的工艺，包括在有益于/3-内酰胺抗生素生产的条件下培养权利要求20-22任一项的宿主。24.权利要求23的工艺，其中所述/3-内酰胺抗生素是阿莫西林、氨苄西林、头孢羟氨苄或头孢氨苄。全文摘要本发明描述了用于生产N-α-氨基-羟基苯乙酰或N-α-氨基苯乙酰β-内酰胺抗生素的工艺，所述工艺包括对分别是羟基苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(HpgCV)或苯基甘氨酰-半胱氨酰-缬氨酸(PgCV)的前体三肽进行由IPNS-催化的转化，使其分别成为N-羟基苯基甘氨酰β-内酰胺抗生素或N-苯基甘氨酰β-内酰胺抗生素。还可如下制备三肽HpgCV或三肽PgCV将氨基酸羟苯基甘氨酸(Hpg)或苯基甘氨酸(Pg)、半胱氨酸(C)和缬氨酸(V)与非核糖体肽合成酶(NRPS)接触，实现三肽HpgCV或三肽PgCV的形成，该NRPS包含对Hpg或Pg特异的第一模块M1、对C特异的第二模块M2和对V特异的第三模块M3。还提供了在该转化中具有改进的活性的IPNS以及催化三肽形成的NRPS。还提供了能够发酵生产具有N-α-氨基-羟基苯乙酰或N-α-氨基苯乙酰侧链的β-内酰胺抗生素的宿主细胞。文档编号C12N9/02GK101631853SQ200780037364公开日2010年1月20日申请日期2007年10月2日优先权日2006年10月5日发明者保罗·克莱斯森,瑞蒙·鲍尔,简·米特斯卡·拉恩·范德,马库斯·汉斯,鲁洛夫·阿利·兰斯·伯韦比格申请人:帝斯曼知识产权资产管理有限公司