专利名称：N-未保护的(3)-氨基-3-芳基丙酸酯的(r)酯的特异性水解的制作方法
技术领域：
本发明涉及酯水解酶存在的情况下通过生物分解产生富含(S)对 映体的氨基酸酯的方法。
背景技术：
p-氨基酸和酯，例如3-氨基-3-芳基丙酸酯，作为合成中间体具有 广泛的应用，特别是用于生产药学试剂。这样的分子是手性的，且优 选地可以单一对映体的形式或者至少是以对映体富集化形式被获得。这样的分子的对映体富集化形式及对应的羧酸可通过化学方法来 获得。例如，美国专利号6,673,926 B2描述了一种制备3S-氨基-3-芳基 丙酸(例如，芳基=3-吡啶基)及其衍生物的方法，所述方法使用经典 的分解(resolution)方法，所述方法需要多个步骤包括对3-氨基基团 的保护。人们已经描述了用于制备对映体富集化的P-氨基酸及酯的更具经 济学和生态学优势的替代生物催化方法。例如，在美国专利公开 2004/0029236 Al ， 以及Faulconbridge等人在Preparation of enantiomerically enriched aromatic P -amino acids via enzymatic resolution, Tetrahedron Letters 41 (2000) 2679-2681中描述了使用脂肪酶 PS酶来产生")-酸。其它的参考文献描述了用于制备对映体纯(enantiopure)的P-氨基 酸和/或P-氨基酯的方法，包括例如WO 01/16090A1,其包括对分子 的描述，但不包括对合成对映体富集化化合物的方法的描述。以下参 考文献描述了使用南极假丝酵母(Ozwfefo ""toW"/c")脂肪酶来催化 外消旋底物的氨基基团和二异丙醚中2，2，2-三氟乙酯之间的对应体选 择性酉先胺的形成M. Lui等人i ec抓yUv朋ces f/ze他m9se/ec"ve ^"Ae^ ac/d , Tetrahedron 58 (2002) 7991-8035; S. Gedey等人，Pre戸ra"'ow q/" /n'g/z(y e"朋"opwre ;fi-麵fwo esters Z>_y C朋t/油a打tor"/ca /z》ase A， Tetrahdron: Asymmetry 10(1999) 2573-2581 。因lt匕，在这些参考文献描述的方法中，只有通过使用激活的酯来使氨基基团 优选地在(W)-中心发生酰化才引起(幻-未反应底物的富集和(i ) -富集酰胺的形成。类似地，V. Sanchez等人在C朋&cfa朋toWc"ca /zjwse cato(yzed mso/她》w q/" e/Zz少/ fl附/woZw(yrate, Tetrahedron:Asymmetry, Vol. 8, No. 1， pp. 37-40, 1997中描述了一种与Gedey参考文 献类似的途径，但是产生对映体纯的3-氨基丁酸。欧洲专利申请EP 1 057 894 A2, A3描述了黄曲霉菌U5pergz7/似 y "v^)酯酶ATCC 11492来制备7V-节基-L-氮杂丁烷羧酸酯以产生") -酸的用途，但是这样的酶尚未被描述用于制备(3-氨基酸或(3-氨基酯。以上的现有技术所描述的生物催化途径(其涉及P-氨基酸酯的生 物催化的水解)均产生(S)-酸作为水解产物。如果需要对应的(幻-酯作为所需产物的话，则需要")-酸的重新酯化，这通常是通过化学 方法。所以，这些生物催化的途径需要多个步骤，因此相对较长且较曰虫 卬贝o发明内容本发明提供了改进的酶法制备氨基酸的方法。在一个方面，本发明为制备富含至少80Wee的(S)-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法，包括以下步骤在酯水解酶存在的情况下， 对应体选择性水解(enantioselectively hydrolyzing) 3誦氨基-3-芳基丙酸 酯的对映体混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(幻-(1)禾口 (1)代表,) — (糾)其中，八1 是0:4.3()未取代或取代的芳香族基团，R是Cw。线性或支链烷基基团；并回收未被水解的光学活性酯")-(1)。7在第二个方面，本发明为从曲霉"w^^7/m)中获得的一种酯水 解酶在制备富含至少80% ee的(50 -对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯中 的用途。在第三个方面，本发明为制备富含至少80%对映体过量 (enantiomeric excess, ee)的(W) -X寸映休的3-氨基-3-芳基丙酸的方法， 包含以下步骤在酯水解酶存在的情况下，对应体选择性水解3-氨基 -3-芳基丙酸酯的对映体混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式")-(1)和i - (1)代表其中，Ar是C4-3。未取代或取代的芳香族基团，R是d.u)线性或支 链垸基基团；并回收水解产物光学活性酸(i ) - (2)。在第四个方面，本发明为从曲霉中获得的一种酯水解酶在制备富含至少80。/。ee的CR)-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯中的用途。本发明涉及分解酯以留下未反应的(50 -酯或者直接产生(i )-酸，因此与现有技术中所描述的方法相比，减少了步骤。
具体实施方式
根据本发明而制备的化合物为富含(幻-对映体的氨基酸酯，所述 氨基酸酯由式(S) - (1)代表氨基酸从3-氨基-3-芳基丙酸酯的对映体混合物中制备，所述的3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(50 - (1)和i - (1)代表其中，八1"是(34.3。芳香族基团，R是d.H)烷基基团。合适的Ar基团包括，芳基、异芳基、取代的芳基或取代的异芳基。 除非另有指明，如这里所用的"芳基"是指芳香族基团，例如苯基、 萘基等。芳基基团可以是未取代的或者是被一个或多个取代基所取代 的。芳基基团上合适的取代基包括但不限于独立地选自以下的基团 卤素、垸基、烷氧基、垸芳基、氨基、酰胺、硝基、硫基基团、羧基、 羟基。除非另有指明，如这里所用的"异芳基"代表任何五元或六元 单环结构，其含有至少一个杂原子，所述杂原子选自O、 N或S，或者 是二环系统，其中杂芳基环与另一个芳基环融合。合适的杂芳基基团 的例子包括但不限于吡咯基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡唑基、哒 嗪基、呋喃基、吡喃基、咪唑基、苯硫基、噁唑基、异噻唑基、异噁 唑基、呋咕基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、嘲哚基、异B引哚基、氮茚 基、吲唑基、嘌呤基、异喹啉基、喹啉基、异噻唑基等。优选地，Ar 为苯基或取代的苯基，最优选为苯基。合适的R基团包括Cwo线性或支链烷基基团。不论单独使用还是 作为取代基基团的一部分，如这里所用的"烷基"应该包括含有l.至(/o-u)10个碳原子的直链和支链。例如，垸基包括甲基、乙基、正丙基、异 丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基等。优选 地，R是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基或仲丁基，最优 选为甲基或乙基。在特别优选的
具体实施方式
中，(幻-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯是 从(50 -乙基3-氨基-3苯基丙酸酯和(7 )-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯 的混合物中制备的，(幻-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯和CR)-乙基3-氨 基-3苯基丙酸酯由以下化学式代表")-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯(7 )-乙基3-氨基-3苯基丙酸酉i本发明所述的3-氨基-3-芳基丙酸酯具有(幻-对映体的对映体过 量或"ee"。"对映体过量"或"ee"是一种对映体相对于另一种来说存 在多少的度量，其由以下式子所代表%对映体过量二 (主要对映体的摩尔数-另一个对映体的摩尔数/两 种对映体的总摩尔数)*100.优选地，本发明所述的3-氨基-3-芳基丙酸酯富含至少80% ee的(S) -对映体，更优选为至少90。/。ee，再更优选为至少95。/。ee。本发明所用的酶是一种酯水解酶。优选地，酯水解酶从曲霉属中 获得，更优选为从黄曲霉种中获得。再更有选地，酯水解酶来自黄曲 霉柱头变禾中(J^erg/〃1^ y/(2vws vgk co/wmwa/^ )的酉旨7JC解酉每，其中黄曲 霉柱头变种菌株UKNCC 095253和UKNCC 015958为最优选。酶可以 是在水溶液中、全细胞、冷冻的干细胞、固定于固体载体、保持在膜 生物反应器中，或其组合。制备(幻-乙基3-氨基-3苯基丙酸酯的示例性反应过程如下10所需产物反应参数的选择为高度自由决定的，使用本领域已知的和常规的方法可找到合适的条件。作为指引，反应的pH值范围应该是4至10， 优选为5至9，更优选为6至8。如果pH太高，将会具有发生酯的非 选择性化学水解的趋势。如果pH太低，则酶会降解。优选地，反应在大约IO摄氏度以上的温度下进行，更优选为至少 大约15摄氏度。反应温度优选为在100摄氏度以下，优选为在大约40 摄氏度以下。本发明的反应可在为此目的提供的任何反应载体中进行，只要反 应载体具有合适的pH和温度控制。例如，本发明的反应可在普通间歇 式反应器、环流反应器或酶膜反应器。反应通常是在水性条件下例如在水和/或水性缓冲液中进行。如 果反应物或反应产物的溶解性是考虑因素，则反应也可在有机共溶剂 中进行，例如除了水或水性缓冲液之外添加疏水性有机溶剂或亲水性 有机溶剂。这样的疏水性有机溶剂可以是例如醚类，如叔丁基甲醚、 异丙醚或碳氢化合物如甲苯、己烷、环己烷、庚烷和异辛烷；而亲水 性有机溶液可以是例如醇类如叔丁醇、甲醇、乙醇、异丙醇和正丁醇， 醚例如四氢呋喃，亚砜例如二甲基亚砜，酮类例如丙酮，或腈例如乙 腈。这些疏水性有机溶剂或亲水性有机溶剂中的每一个可用作单一的 共溶剂或者与彼此组合，也可考虑一种疏水性有机溶剂和一种亲水性 有机溶剂的组合。所需的终产物在发生水解后被保留且必须被回收。优选地，所需 的终产物通过萃取、过滤或其组合来回收。实施例以下实施例解释本发明的一些
具体实施方式
且只是为了解释而不 是限制。实施例1-底物溶液(柠檬酸钠磷酸盐缓冲液中的10.0 g/L的3-氨基-3-苯基-丙酸乙酯)的制备底物溶液通过向20 ml柠檬酸/钠磷酸盐缓冲液(根据Mcllvaine， /伤o. C7^附.，1921, 49, 183制备)中加入0.2 g酉旨(根据r"ra/z^/ra", 2002， 58，7449制备)来制备；用磷酸将pH调至所需要的值。实施例2-曲霉细胞的制备从United Kingdom National Culture Collection (UKNCC)获得黄曲 霉柱头变种菌株015958 (最初是来自Collection of Filamentous Fungi and Plant Pathogenic Bacteria (CABI))并以甘油贝亡藏于-70。C 。这个ti 藏(250pl)用于在带有阻挡的250ml锥形瓶中接种50 ml无菌马铃薯 右旋糖肉汤。培养物在25。C和250 rpm下生长72小时。然后这个培养 物用于在工作台发酵器中接种2.0L的无菌马铃薯右旋糖肉汤，培养物 在25。C， 500 rpm和1.0 L空气/分钟下不控制pH值生长72小时。通 过过滤收取细胞以产生35.7g的湿细胞，然后冷冻于-2(TC。然后将细 胞冻干以产生7.25 g的干细胞。实施例3:生物转化反应混合物的制备200mg收取的冻干的黄曲霉细胞与底物贮存液(20ml)在27。C下 温育(作为空白，在一个反应中，以缓冲液代替细胞)。 实施例4:生物转化的非手性分析将100 (il的生物转化混合物转移至900的HPLC溶剂(20%乙 腈+10mM磷酸钾，pH3.0)中终止反应，进行非手性分析。 分析使用C18 (BDS)柱(150 x 4.6 mm，或等价的)和HPLC溶剂(20% 乙腈+10mM磷酸钾，pH3.0)以2ml/分钟在210nm处监视吸光度来 进行非手性HPLC分析。实施例5-生物转化的手性分析对于手性分析，将100 W的生物转化反应物转移至900 ^的庚垸 中，混合，以无水硫酸钠干燥并过滤，通过HPLC分析有机层。 分析可进行手性分析以区分酯底物的两种异构体。使用Diacel Chiralcel OD-H柱(250x4.6 mm，或等价的)，以90%庚垸/ 10%异丙醇作为流12动相。使用lml/分钟的流速，在210nm处检测。结果对于pH7.0下进行的生物转化，17小时的反应时间产生了 50%的 转化(空白转化7%)，(幻-酯的分离纯度为〉98.5o/oee。
权利要求
1、一种制备富含至少80％对映体过量(ee)的(S)-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法，包括在酯水解酶存在的情况下，对应体选择性水解3-氨基-3-芳基丙酸酯的对映体混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(S)-(1)和R-(1)代表其中，Ar是C4-30未取代或取代的芳香族基团，R是C1-10线性或支链烷基基团；和回收未水解的光学活性酯(S)-(1)。
2、 根据权利要求1所述的方法，其中Ar是苯基或取代的苯基。
3、 根据权利要求1所述的方法，其中R是甲基、乙基、丙基、异 丙基、丁基、异丁基或仲丁基。
4、 根据权利要求1所述的方法，其中富集的3-氨基-3-芳基丙酸酉旨 是(S) -3-氨基-3-芳基丙酸乙酯。
5、 根据权利要求l-4任一项所述的方法，其中所制备的(60酯的 对映体过量是90%以上。
6、 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中所述的酯水解酶从 曲霉ApergW/Ms中获得。
7、 根据权利要求6所述的方法，其中所述的酯水解酶来自黄曲霉柱头变禾中爿"erg7'〃us_/7avMS var. co/wm/ian's 。
8、 根据权利要求l-7任一项所述的方法，其中所述的酶是在水溶 液中、全细胞、冷冻的干细胞、固定于固体载体、保持在膜生物反应 器中，或其组合。
9、 根据权利要求8所述的方法，其中黄曲霉柱头变种^^erg"/m _/7flvws var. co/ww ar^的酶是分离的和纯化的开》式。
10、 根据权利要求l-9任一项所述的方法，其中所述水解在pH为 4至10中进行。
11、 根据权利要求10所述的方法，其中所述水解在pH为6至8 中进行。
12、 根据权利要求1-11任一项所述的方法，其中所述水解在温度 为+5。C至+10(TC中进行。
13、 根据权利要求1-12任一项所述的方法，其中所述水解在温度 为+15。C至+40。C中进行。
14、 一种从曲霉J^er^7/M中获得的酯水解酶在制备富含至少80% ee的(S0 -对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯中的用途。
15、 ~"禾中从黄曲霉柱头变禾中^sperg/〃wsy/mw v<ar. co/wmwar/s中获 得的酯水解酶在制备富含至少S0。/。ee的(S)-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯中的用途。
16、 一种制备富含至少80%对映体过量(ee)的-对映体的 3-氨基-3-芳基丙酸的方法，包括在酯水解酶存在的情况下，对应体选择性水解3-氨基-3-芳基丙酸酯的对映体混合物，所述3-氨基-3-芳基丙酸酯由式(幻-(1)禾Q i -(1)代表<formula>formula see original document page 4</formula>其中，Ar是C4-3o未取代或取代的芳香族基团，R是Cw。线性或支 链垸基基团；和回收水解产物光学活性酸(A) - (2)。<formula>formula see original document page 4</formula>
17、 根据权利要求16所述的方法，其中Ar是苯基或取代的苯基。
18、 根据权利要求16所述的方法，其中富集的3-氨基-3-芳基丙酸 是(i ) -3-氨基-3-苯基丙酸。
19、 根据权利要求16-18任一项所述的方法，其中所制备的(W) 酸的对映体过量是90%以上。
20、 根据权利要求16-19任一项所述的方法，其中所述酯水解酶从 曲霉As/ ergz7/^中获得。
21、 根据权利要求20所述的方法，其中所述酯水解酶来自黄曲霉 柱头变禾中Js/ e《/〃M^^/JavM^ vac co/M附waW"
22、 根据权利要求16-21任一项所述的方法，其中酶是在水溶液中、 全细胞、冷冻的干细胞、固定于固体载体、保持在膜生物反应器中， 或其组合。
23、 根据权利要求22所述的方法，其中所述黄曲霉柱头变种 J^erg/〃RSy7(Tmy rar co/wwwan^的酶是分离的禾B纯化的开乡式。
24、 根据权利要求16-23任一项所述的方法，其中所述水解发生在 pH为4至10中进行。
25、 根据权利要求24所述的方法，其中所述水解在pH为6至8中进行。
26、 根据权利要求16-25任一项所述的方法，其中所述水解在温度 为+5。C至+100。C中进行。
27、 根据权利要求26所述的方法，其中所述水解在温度为+15"C 至+40。C中进行。
28、 一种从曲霉j^^^7/w中获得的酯水解酶在制备富含至少80% ee的(i )-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸中的用途。
29、 ——禾中从黄曲毒柱头变禾中J5/ ^g7'〃"51 y m^s1 co/wm"ar/s中获 得的酯水解酶在制备富含至少80% ee的(i )-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸中的用途。
全文摘要
本发明披露了一种制备富含至少80％ee的(S)-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法，或制备富含至少80％对映体过量(ee)的(R)-对映体的3-氨基-3-芳基丙酸酯的方法。所述方法包含对应体选择性水解3-氨基-3-芳基丙酸酯的对映体混合物，并回收未水解的光学活性酯(S)-(I)。也披露了来自曲霉的酯水解酶在此方法中的用途。
文档编号C12P41/00GK101558159SQ200780037016
公开日2009年10月14日 申请日期2007年10月2日 优先权日2006年10月3日
发明者A·A·坎特里尔, M·拜克罗夫特, P·A·基恩 申请人:雷迪实验室(欧洲)有限公司