专利名称：用于检测污染物的方法及系统的制作方法
相关申请
本申请对在2006年9月1日提交的60/841,774号临时专利申请(Provisional Application No.60/841,774)及在2006年12月22日提交的60/876,919号临时专利申请(Provisional Application No.60/876,919)提出优先权要求，所述临时专利的全部内容在此通过引用，被并入本专利。
引言 禽流感病毒H5N1在1990年代末被发现。根据报道，在超过46个国家发现动物病例，在10个国家发现人类感染，自2003年起有258人受感染，共有153例死亡。最近，美国联邦政府的应急预案的报告草案预言，如果在美国突发禽流感，多达2亿美国人将可能受感染，而且20万人可能在几个月内死亡。美国疾病控制与预防中心(CDC)预计，未指明的流感大流行可在美国导致大约8.9万至20.7万例死亡、31.4万人至73.4万人住院就诊、1800万至4200万例门诊就诊及2000万至4700万例外加病症。直接的经济损失可能多达数千亿美元。预计全球性的流感大流行将在全世界造成200万至740万例人类死亡。
在美国，2001及2002年突发的低病原性禽流感(LPAI)导致450万只鸡及火鸡死亡，而且估计已经使家禽养殖业遭受大约1.25亿美元的损失。根据世界银行的报告，截至2005年中，禽流感已经导致超过1.40亿只家禽死亡或被销毁，而且对家禽养殖业造成的损失估计超过100亿美元。
发明内容
控制禽流感的蔓延的关键在于迅速地检测出该疾病，接着是销毁受感染动物、两英里半径范围的隔离以防止人员及动物移动、以及在隔离区外为动物进行接种疫苗。在目前，用于检测流感的技术-比如病毒培养、实时聚合酶链式反应(RT-PCR)及酶联免疫吸附试验(ELISA)-经常都是费时、昂贵或对禽流感(AI)病毒的亚型测试不精确。因此，需要适合在旷野或病人床边使用的、简单、迅速、经得起考验及可靠的检验。
在一个实施例中，提供阻抗生物传感器(impedance biosensor)，用于检测起始物料中的污染物。所述生物传感器包括输入设备、输出设备及微流控单元(microfluidic cell)，全部这些设备由座板(housing)支持。所述起始物料可以与所述微流控单元及阻抗分析器接合，该阻抗分析器由所述座板支持，而且可以操作来测量所述起始物料的阻抗，以便检测污染物的存在。
在另一个实施例中，提供用于检测起始物料中的污染物的方法。所述起始物料与能够结合到所述污染物的亲和性部分接触，以形成靶(target)。所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子。在此描述的非标记阻抗生物传感器用于检测所述靶。所述靶的检测可指示所述起始物料中的污染物的存在。
在又一个实施例中，提供用于检测起始物料中的病毒的方法。所述起始物料与红细胞接触，而所述病毒能够结合到所述红细胞以形成复合物。所述复合物以生物传感器检测。所述复合物的检测可指示所述起始物料中的所述病毒的存在。
在再一个实施例中，提供用于检测起始物料中的污染物的方法。所述起始物料与能够结合到所述污染物的亲和性部分接触，以形成靶，其中所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子。所述靶以阻抗生物传感器检测。所述靶的检测可指示所述起始物料中的所述污染物的存在。
在另一个实施例中，提供用于检测起始物料中的污染物的方法。所述起始物料与能够结合到所述污染物的亲和性部分接触，以形成靶，其中所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子。所述靶从所述起始物料分离，并被递送到微流控单元。所述微流控单元中配置有交叉梳状阵列化微电极。所述靶以所述交叉梳状阵列化微电极生物传感器检测，其中所述靶的检测可指示所述起始物料中的所述污染物的存在。
图1为便携式生物传感器的正面图。
图2-4为图1中所示的生物传感器的不同视图。
图5为图1中所示的生物传感器的内部视图，图中显示该生物传感器的前盖已拆开。
图6为图1中所示的生物传感器的结构图。
图7为图1中所示的生物传感器的电气示意图。
图8为用于生物传感器的匣式盒组装件的构造图。
图9为微流控单元的顶视图，该微流控单元带有图1中所示的生物传感器的、嵌入交叉梳状阵列化微电极(IDAM)。
图10为微通道的立体图，所述微通道用于微流控单元。
图11为图10中所示的微通道的顶视图。
图12为交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片，该芯片用于图9中所示的微流控单元。
图13-15显示图12中所示的交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片的制作过程。
图16A为非标记生物传感器系统的示意图，所述非标记生物传感器系统使用红细胞及磁性纳米粒子。
图16B显示磁性纳米粒子分离设备。
图17为波特图(bode plot)，其图解对照(control)组及带有磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)的大肠杆菌O157:H7组的阻抗大小对频率曲线。
图18为曲线图，其显示在图中指示的频率时、大肠杆菌O157:H7MNAC及只带有磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)的对照试样之间的阻抗差异(以标准化阻抗变化[NIC]表示)。
图19A-19D为一组曲线图，它们显示图中指示的试样的阻抗。图19A-19B显示来自细菌的纯培养的阻抗测量。图19C-19D显示来自掺有大肠杆菌的碎牛肉试样的阻抗测量。图19A及19C显示阻抗谱，而图19B及19D则显示频率为16kHz时的阻抗。
图20为曲线图，其显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-hemagglutinin，HA)抗体的固定化阻抗生物传感器及以红细胞预培养的、禽流感病毒(禽流感H5N1病毒)的阻抗测量。
图21为曲线图，其显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体、在禽流感结合之后添加红细胞的固定化阻抗生物传感器的禽流感病毒的阻抗测量。
图22为曲线图，其显示在以涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的磁性纳米粒子接触禽流感病毒之后、基于非标记阻抗生物传感器的、禽流感病毒的阻抗测量。
图23A及23B为一组曲线图，它们显示在禽流感病毒以及新城疫病及传染性支气管炎病毒共同存在时进行的阻抗测量。图23A的曲线显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的固定化阻抗生物传感器的、在带有新城疫病及传染性支气管炎病毒以及红细胞的混合物中的禽流感病毒的阻抗测量。图23B的曲线显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的固定化阻抗生物传感器的、在带有新城疫病及传染性支气管炎病毒的混合物中的禽流感病毒的阻抗测量，其中红细胞在添加所述抗体之后添加到所述生物传感器。
图24为曲线图，其显示在以涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的磁性纳米粒子接触禽流感病毒之后、基于非标记阻抗生物传感器的、在带有新城疫病及传染性支气管炎病毒的混合物中的禽流感病毒的阻抗测量。
图25A及25B为一组曲线图，它们显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的固定化阻抗生物传感器的、在以红细胞预培养之后、对照气管拭子(图25A)及掺有禽流感病毒的气管拭子(图25B)的阻抗测量。
图26为曲线图，其显示在以涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的磁性纳米粒子接触禽流感病毒之后、基于非标记阻抗生物传感器的、对照气管拭子及掺有禽流感病毒的气管拭子的阻抗测量。
图27A及27B为一组曲线图，它们显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的固定化阻抗生物传感器的、在以红细胞预培养之后、对照泄殖腔拭子(图27A)及掺有禽流感病毒的泄殖腔拭子(图27B)的阻抗测量。
图28A及28B为一组曲线图，它们显示基于涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的固定化阻抗生物传感器的、在以红细胞预培养之后、对照泄殖腔拭子及掺有十倍稀释的禽流感病毒的泄殖腔拭子的阻抗测量。图28A显示频率为10,400Hz时的阻抗，而图28B则显示阻抗谱。
图29A及29B为一组曲线图，它们显示在以涂上抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体的磁性纳米粒子接触禽流感病毒之后、基于非标记阻抗生物传感器的、在以红细胞预培养之后、对照泄殖腔拭子及掺有十倍稀释的禽流感病毒的泄殖腔拭子的阻抗测量。图29A显示频率为4,150Hz时的阻抗，而图29B则显示阻抗谱。
图30为条形图，其显示为检测家禽拭子试样中的禽流感病毒H5N1而使用非标记生物传感器系统来进行的阻抗测量。
图31A-31E为一组曲线图，它们显示阻抗测量，这些阻抗测量使用非商业性抗体对禽流感病毒H5N1来进行。
具体实施例方式 在详细地解释本发明的至少一个构造之前，应该了解本发明并不受以下的描述中陈列的或附图中图解的构造细节及组件安排的限制。本发明能够以其他构造实施，而且能够以多种不同方式实行或实现。
检测诸如细菌及病毒的少量污染物的存在的能力，尤其是在复杂背景下检测少量污染物的存在的能力，对生物技术、医疗诊断及大流行病的预防特别重要。检测及鉴别被感染的受治疗者身上或食品或供水中的污染物，对维护卫生及安全很有必要。此外，少量污染物的迅速检测将使疾病的临床诊断加快，而且可以获得更好的预后。在必须检测大量的试样中或复杂的试样中(比如食品或土壤中)的小量污染物时，其检测非常困难。本领域需要另外的、高度灵敏、精确而迅速的方法来检测及定量污染物。此外，也需要能够在旷野使用的手持或便携式设备来检测及定量污染物。
发明人在此描述用于检测及定量起始物料中的污染物的方法及系统。在此描述基于微流控及交叉梳状阵列化微电极的阻抗生物传感器。所述生物传感器可以实施于便携式设备，其能够对污染物进行高度灵敏、精确而迅速的检测，而且最小化试样之间的时间。本发明也提供检测起始物料中的污染物的多种方法。所述方法包括以能够结合到所述污染物的亲和性部分接触所述起始物料，以形成靶。所述亲和性部分能够偶联到磁性纳米粒子，以形成磁性靶。接着，合适地以生物传感器检测所述磁性靶，比如以在此描述的阻抗生物传感器检测所述磁性靶。此外，本发明提供检测起始物料中的流感及新城疫病毒的方法，所述方法以红细胞接触所述起始物料以形成复合物，以及合适地以生物传感器，即在此描述的阻抗生物传感器，检测所述复合物。
所述生物传感器技术基于一个或多个概念，包括(1)使用磁性纳米粒子，对家禽拭子试样中的靶病毒进行高效率及迅速的分离；(2)使用带有嵌入交叉梳状阵列化微电极的微流控生物芯片，以实现所述靶病毒的精确递送及高敏感度测量；以及(3)形成红细胞及纳米粒子的复合物，以获得更大的阻抗信号放大。已完成实验室规模的、对以失活禽流感病毒H5N1及其他病毒准备的基于鸡拭子试样进行的实验。实验结果显示，所述生物传感器能够明确地检测禽流感病毒H5N1，其检测限为在少于30分钟内，家禽泄殖腔或气管拭子试样中，至少100EID50/ml。所述生物传感器将能够在旷野使用，而且其成本估计少于10美元每试样。在此描述的生物传感器提出了禽流感的实时检测的概念。
阻抗生物传感器 参看图1，图1图解阻抗生物传感器20，该阻抗生物传感器20能够操作来检测被引入该阻抗生物传感器20中的溶液中的污染物的存在，并定量所述污染物的数量。可以由生物传感器20检测及定量的污染物包括，例如细菌、病毒、真核细胞、多肽或其他生物或化学污染物。生物传感器20为独立的设备，其可操作来测量阻抗值，以检测及定量溶液中的污染物。生物传感器20也可以由用户方便地携带。
继续参看图1并另外参看图2-5，生物传感器20包括座板24，其座板24包括前部28及后部32，前部28及后部32可以以紧固件(图中未显示)可移动地连接。生物传感器20也包括液晶显示器(LCD)36及输入设备或键区40，键区40由前部28支持。液晶显示器(LCD)36及键区40分别为用户提供输入及输出资源。电源插座44由后部32支持，并接收及支持电源48，例如一个电池或多个电池，以便为生物传感器20提供电能。在有些实施例中，电源48是一对AA 1.5V电池，其提供直流电能。在其他的实施例中，电源48是电绳及电插座，其提供交流电能。开口52设置在后部32，以便于将电源48插入插座44或从插座44移开电源48。盖子56在开口52上的可移动地连接到后部32的位置，以便可选择地覆盖或揭开插座44。
现在参看图6及7，生物传感器20包括微控制器60、数据存储器64、功率转换器68、动力过滤器72、报警器76、通信接口80、阻抗检测器84及匣式盒组装件88。应该理解，本发明的实施例包括硬件、软件及电气组件或模块，但为了便于讨论，这些实施例可能被图解或描述得好像有些组件单独地实施为硬件及/或软件。然而，本领域的普通技术人员及基于对本详细描述的阅读将可以理解，在至少一个实施例中，本发明的基于电气组件及软件的方面可以实施为不同的硬件及软件配置。因此，应该理解，可以使用多个基于硬件及软件的设备以及多个不同结构性组件来实施本发明。此外，如以下段落中描述的那样，图6及7中图解的特定机械结构的目的在于例示本发明的一个实施例，但也有可能采用其他替代性的结构。
如以下进一步描述的那样，微控制器60执行生物传感器20的多种操作及功能，并与生物传感器20的不同组件进行通信。在一个实施例中，微控制器60为由爱特梅尔公司(ATMEL Corporation)提供的AT89C55WD型微芯片集成电路。然而，本领域的普通技术人员将可以理解，可以使用其他组件及组件组合，比如微处理器、数字信号处理器、专用集成电路(ASICs)等等来取代微控制器60。以图7为例，微控制器60连接到包括振荡器X2及电容器C12及C13的振荡器电路、以及包括感应器L3、电容器C7及C14、二极管D2及电阻器R34的VCC/复位电路。
键区40及液晶显示器(LCD)36分别为用户提供输入及输出资源，但也可以使用其他类别的输入及输出设备。这样的输出设备在本领域中属于传统设备，所以在此将不作进一步的描述。以图7为例，液晶显示器(LCD)36为由OPTREX公司提供的LCD1604B型液晶显示器。
数据存储器64装置在生物传感器20中，其在生物传感器20上存储数据。数据存储器64可以包含多种传统存储设备，例如由爱特梅尔公司(ATMEL Corporation)提供的AT24LC256型存储器集成电路。应该理解，虽然图中显示数据存储器64为单独的存储器，但在其他实施例中，所述数据存储器可以与生物传感器20的其他元件(例如微控制器60)组合。
通信接口80用于生物传感器20与外部电气设备(比如个人计算机、打印机等等)之间的通信。以图7为例，通信接口80包括电容器C22、C23、C24、C25及C26以及设备U9，设备U9可以是由Maximum公司提供的MAX232型通信集成电路。
阻抗检测器84可操作来感应引入匣式盒组装件88的试样的阻抗，以及向微控制器60提供与所传感的阻抗有关的值。以图7为例，阻抗检测器84包括感应器L2；电容器C15、C27及C28；电阻器R2、R3及R32；振荡器X1；以及阻抗集成电路U4，阻抗集成电路U4可以是由模拟器件公司(Analog Devices，Inc.)提供的AD5934型阻抗集成电路。阻抗检测器84本身或与其他电路(例如微控制器60)组合形成阻抗分析器85，以便在其他事情中根据所感应的阻抗进行确定。例如，阻抗分析器85可以用于检测污染物的存在。以下将讨论阻抗分析器85进行的其他确定。
功率转换器68接收来自电源的电能，并将所述电能转换/调节到图7中所示的电路使用的适当电压。以图7为例，所述功率转换器包括感应器L1；电容器C6、C10及C11；二极管D1；电压集成电路U2，电压集成电路U2可以是由凌力尔特公司(Linear Technology Corporation)提供的LT 1302型电压集成电路；以及电压集成电路U3，电压集成电路U3可以是由Microsemi公司提供的LX8117-33CDD型电压集成电路。
报警器76提供可视及/或可听报警。以图7为例，报警器76包括电阻器R35及R36、发光二级管D3、晶体管Q1及呼叫器SP1。
动力过滤器72过滤VCC电压并包括电容器(以图7为例)C2、C3、C4、C5、C9、C17、C18、C19、C20、C31、C32、C33及C34。
参看图5及8，以下将更详细地描述匣式盒组装件88。匣式盒组装件88安置在座板24的上部，其划分为测试部分92及废料储存室部分96。试样被引入测试部分92以供测试，然后在测试之后，所述试样被施放到废料储存室部分96，所述试样或多个试样在废料储存室部分96累积，直到处置为止。所述试样通过注射口100，被引入生物传感器20，注射口100可通达座板24的外部。入口软管104连接在注射口100与微流控单元108(见以下更详细讨论)之间，而出口软管112连接在微流控单元108与废料储存室96之间。排放口116流动地连接到废料储存室96，以便从废料储存室96排放所述试样。
微流控单元 微流学技术有许多优点，其中包括表面与体积比率高、试样数量小、控制准确及成本低。已经设计及制作微流控通道(深40μm、宽50μm的横截面)。请参阅李氏及苏氏于2006在《微生物学中的迅速方法及自动化期刊》14期96-109页(Journal of Rapid Methods andAutomation in Microbiology 1496-109)中的撰著(所述著述的全部内容在此通过引用，被并入本专利)。已设计及制作交叉梳状阵列化微电极(3对宽度为25μm的电极指)到所述微流控通道中，以进行对试样中的生物靶敏感的阻抗测量。已经对“用于检测俘获到以特异性抗体改性的交叉梳状阵列化微电极的表面的鼠伤寒沙门菌及大肠杆菌O157:H7细胞的阻抗生物传感器”(Impedance biosensors to detectSalmonella typhimurium and E.coli O157:H7 cells captured onto thesurface of an interdigitated array microelectrode modified with specificantibody)(杨氏等人撰著，2004年，《分析化学》(AnalyticalChemistry)76期1107-1113页，所述著述的全部内容在此通过引用，被并入本专利)或“通过交叉梳状阵列化电极”(Passing through aninterdigitated array electrode)(Varshney等人，2007年，《生物传感器及生物电子学》(Biosens Bioelectron)22(11)期2408-2424页)进行描述(以上著述的全部内容在此通过引用，被并入本专利)。
继续参看图5及8并进一步参看图9-12，微流控单元108安置在测试部分92中，而且以多个阶段制作。在此描述的制作过程的目的仅在例示。因此，可以使用其他制作过程来制作能够执行期望操作的、而且属于本发明的精神及专利范围内的微流控单元。
阶段一，在镀有金层的玻璃晶片124上制作交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片120。在这个阶段，以
的金及以
的铬作为粘合层溅射玻璃晶片124。接着以4μm层厚的AZ 4330感光耐蚀材料旋涂玻璃晶片124。使用照相平版来定型所述感光耐蚀材料，然后显影所述感光耐蚀材料。以定型的感光耐蚀材料作为遮蔽层来蚀刻玻璃晶片124上的金及铬，以获得所述电极。在有些实施例中，交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片120包含50对金电极指，每指宽25μm，指间间隙为25μm。
阶段二，准备模子128，以便制作微通道132。在这个阶段，以SU-8140旋涂硅(Si)晶片136，然后软烤(soft bake)硅晶片136。接着，遮蔽硅晶片136及SU-8涂层140，然后暴露于紫外线以显影SU-8结构140。接着硬烤(hard bake)模子128。
阶段三，微通道132形成并且与交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片120键合。在这个阶段，聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)144被倒入模子128，然后在60℃的温度条件下部分地固化(cured)1小时。接着，聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道144从模子128中拉出。为了将聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道144键合在交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片120上，使聚二甲基硅氧烷(PDMS)通道144与微电极148对齐，然后在80℃的温度条件下热键合到所述芯片，为时8小时。合成的微通道132包括入口152、出口156及沿着两者之间的方向的检测室160。在有些实施例中，微通道132深15μm、宽500μm，而检测室160的大小为0.5×0.5×0.02mm，其体积为5nl。微流控单元108也包括电气连接器164，这些电气连接器164连接到所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)，以便向其提供电能以及在所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)与微处理器60之间传送信息。
阻抗生物传感器的操作 既然已经描述生物传感器20，以下将描述生物传感器20的用途及例示性操作。通过阻抗测量，生物传感器20可用来检测及定量被引入试样的污染物的存在。
以下所作有关生物传感器20的操作描述，是检测及定量试样中的污染物的存在的一个方式，其目的并非在于限制本发明的范围。因此，也可以使用其他检测及定量污染物的方式，例如使用其他生物传感器，也属于本发明的精神及专利范围之内。
在有些实施例中，所述交叉梳状阵列化微电极操作如下述。流经所述交叉梳状阵列化微电极的电流，特别是流经所述电极指之间的空间的电流，被所述通道中的靶的存在阻止。所述阻抗与存在的靶数量成正比，而且是被施加的电压信号的频率的函数。
在所述试样与亲和性部分接触及亲和性部分-污染物“靶”形成之后，所述靶从其他试样分离，并随后使用生物传感器20来定量。如果所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子，则可以使用磁性分离器来清除所述“颗粒加靶”复合物(beads-plus-target complexes)(见以下有关磁性纳米粒子的进一步讨论)。
本系统的一个方面在于以所述交叉梳状阵列化微电极接触所述靶的机理，特别是在于连续流系统的使用。通过使用连续流系统，多个试样可以连续地通过生物传感器20，试样之间的停工时间达到最小限度。
本系统的另一个方面在于，所述亲和性部分不需要集成到所述交叉梳状阵列化微电极(称为“非标记”(label-free)生物传感器)，但在有些变更了的实施例中，所述亲和性部分可以作为流过材料的部分。由于这个特定，生物传感器20可以与许多不同亲和性部分重新使用，因此可以在不需要更换微电极的情况下，用于检测多种不同污染物。在其他的系统中，形成对照的是，所述亲和性部分(一般为抗体)偶联到所述微电极，而结果是所述特定微电极只能够用于检测一种污染物。此外，使用“非标记”(label-free)系统可以更迅速地分析试样，这是由于如果使用“非标记”(label-free)系统，就不需要在读取之间从所述生物传感器剥离或清除残余物，而使用“固定化”(immobilized)生物传感器，即附着有亲和性部分的生物传感器，却需要那样。
在将所述靶引入生物传感器20之后，可以施加一频率范围或一单一频率的振荡电压信号，并记录结果阻抗。当所述试样中的污染物与所述亲和性部分之间不存在正反应(positive reaction)时，所述亲和性部分将不会形成靶复合物，因此所述亲和性部分将在阻抗谱上有可测量的不同的外形。相反地，当存在正反应时，形成的亲和性部分加污染物的所述靶复合物将导致频率谱的某些部分的阻抗可测量的增加，造成产生特殊的标记。
在一典型的测量中，试样溶液被引入所述注射口100，并通过微通道132(图8)的入口软管104及入口152流入微流控单元108。包括所制作的交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片120及微通道132的微流控单元108用于采集所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)上的活性层中的污染物，并在阻抗测量进行时最小化试样中的微粒的干扰。所述活性层位于所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)的表面上几微米处，而且这里正是电场强度最大之处。在存在0.1M甘露醇溶液时，可以在10Hz至1MHz的频率范围内测量阻抗的大小及相角。可选择地，在存在其他溶液及浓度时，可以在不同频率测量所述大小及相角。在试样流经微通道132之后，试样通过微通道132的出口156及出口软管112离开微流控单元108。接着，试样流到废料储存室96，最后通过排放口116流出生物传感器20。
所述溶液的阻抗测量可以用上述阻抗生物传感器系统进行，或以传统阻抗检测器或分析器进行，例如以IM-6阻抗分析器(美国印地安那州西拉法叶市BioAnalytical Systems Inc.公司，West Lafayette，Indiana)进行，或使用传统软件，例如IM-6/THALES软件来进行。对于所有的阻抗测量，对所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)施加了100mV电压的正弦调制交流电，并为10Hz至1MHz频率范围测量阻抗的大小及相角。使用所试验的磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)，从取样到测量的检测总时间为35分钟。所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片的一个电极连接到测试探针及传感探针，而另一个电极则连接到所述阻抗分析器的参比电极及对电极(counter electrode)。
为了确定带附着磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)的试样溶液与对照组之间的阻抗测量差异最大时的频率，绘制了标准化阻抗变化(NIC)对频率的曲线图。标准化阻抗变化(NIC)的值已根据下列公式(1)求出 其中，Zcontrol为对照组的阻抗大小，而Zsample为试样溶液的阻抗大小。
在此描述的方法可以用于检测在抗原多样性、密度及体积方面的复杂程度不同的多种起始物料中的包括流感病毒的多种污染物的存在。除了用于以下实施例的起始物料之外，可以合理地了解可以检测多种食品、动物及环境及临床试样中的污染物，而且起始物料可以包括液体、固体或包含液体及固体混合物的材料。所述起始物料可以包括蔬菜、水果、碎肉、牛肉、家禽、海产、奶制品、水、空气、土壤、血液、尿液、粪便；取自皮肤表面、器官、气管或泄殖腔的拭子；或组织试样。食品试样可以是生试样或熟试样。例如，家禽产品可以包括屠宰后的畜体、来自畜体的洗水、去骨禽肉、碎禽肉或禽肉馅饼。所述方法也适合于食品或环境监察或临床诊断或监测。例如，所述方法可以在食品加工、储藏、经销或甚至是在市场售卖期间，用于监测食品。在用于所述方法之前，固体或半固体起始物料可能需经受均质化。
如以下所举的实施例中所述，许多类别的污染物可以用在此描述的方法检测或定量。在下列实施例中，已检测大肠杆菌O157:H7及禽流感H5N1。除了这些污染物之外，可以合理地了解本领域的普通技术人员可以对多种潜在污染物使用所述方法，包括但不限于诸如单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、假单胞变形杆菌(Pseudomonas mirabilis)、沙门氏菌(Salmonella)物种及肠球菌(Enterococcus)物种；真核细胞；多肽，包括朊蛋白(prions)、毒素及血液或尿液蛋白；病毒，比如流感病毒；或其他化学污染物，比如杀虫剂或除草剂。具有重大意义的是，活细胞和死细胞都可以以在此描述的方法检测。然而，可以预处理起始物料，以便杀除可能对执行在此描述的方法的技术员的健康造成威胁的任何活性污染物。
磁性纳米粒子 纳米粒子以前已经被描述。参看Varshney等人在2005年《食品保护期刊》(Journal of Food Protection)68期1804-1811发表的论著；Fritzsche及Taton在2003年《纳米技术》(Nanotechnology)14期R63-R73页发表的论著；Tan等人在2004年《医学研究评论》(MedicalResearch Review)24期621-638页发表的论著、Zhao等人在2004年《美国国家科学院院刊》(Proceedings of the National Academy of Sciences)101卷15027-15032页发表的论著、美国6,623,982号专利及美国6,645,731号专利，所有这些论著及专利的全部内容在此通过引用，被并入本专利。纳米粒子的直径介于1-300nm之间，合适地介于50-150nm直径之间。纳米粒子可以有磁性核，其磁性核可以包括不同金属，而且与微颗粒一样，所述磁性核可能是顺磁或超顺磁的。适合用于在此描述的方法的纳米粒子包括可以从美国俄勒冈州(Oregon)尤金市(Eugene)的“分子探针公司”(Molecular Probes，Inc.)购买的纳米粒子。
50-150nm的纳米粒子表现磁性流体的特性，而且保持为稳定胶体。这些纳米粒子在磁性单层中采集，这允许洗掉不必要的背景。与其他的分离技术，比如离心法、过滤，及微颗粒的使用比较，磁性纳米粒子提供对家禽试样中禽流感病毒的较高的俘获效率，这进而提高所述生物传感器的敏感度。一旦所述纳米粒子与所述起始物料接触及所述磁性靶形成，所述磁性靶可以用多种方式从所述起始物料分离。所述靶可以通过过滤或离心法或者通过产生磁场而分离。适合用于所述方法的磁性分离设备包括由美国纽约州(New York)萨克瑟斯湖市(Lake Success)的“戴诺公司”(Dynal，Inc.)提供的磁性粒子集中器(Magnetic Particle Concentrator，MPC)及在标题为“使用磁性纳米粒子的分离系统及污染物的有效俘获”(Separation System and EfficientCapture of Contaminants Using Magnetic Nanoparticles)的美国11/328,808号专利申请(U.S.Patent Application No.11/328,808)中描述的分离系统，所述美国专利的全部内容在此通过引用，被并入本专利(见图16B)。
所述纳米粒子可以直接地或间接地偶联到对污染物有亲和性的亲和性部分。通过多种化学反应偶联到亲和性部分的市场可得的纳米粒子已经制备，但纳米粒子也可以由最终用户制备。纳米粒子可以通过多种方法偶联到亲和性部分，这些方法包括但不限于预结合到链霉抗生物素蛋白(streptavidin)、抗生物素蛋白(avidin)、蛋白G或蛋白A；使用市场可得的成套用具，纳米粒子可以直接地通过共价键结合到抗体；表面暴露功能性羧基或氨基以用于偶联多种多肽的纳米粒子；或链接到能够结合抗体的Fc区，比如Fc受体或抗-Fc抗体，或能够结合所述抗体的非Fc区的多肽的纳米粒子。多肽可以以本领域的普通技术人员熟知的方法生物素化，而所述生物素可以形成桥接复合物，该桥接复合物通过结合到链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，将纳米粒子链接到亲和性部分。可以合理地了解，本领域的普通技术人员可以使用多种不同化学方法使所述抗体直接地或间接地偶联到所述纳米粒子。
所述磁性纳米粒子能够仰赖偶联到亲和性部分而结合到所述污染物。亲和性部分合适地是对所述污染物有亲和性的多肽，而且在被带靠近所述污染物时将结合到所述污染物。亲和性部分包括对所述污染物具有特异性的抗体、能够使受体结合所述污染物上的配位体、以及结合到所述污染物的受体。除了以下例示的对在此描述的方法有用的那些亲和性部分之外，可以合理地了解其他的不同的污染物有亲和性的亲和性部分将也合适。合适的抗体可以使用抗体源指南来鉴定，例如使用《Linscott免疫及生物试剂目录》(Linscott’s Directory ofImmunological and Biological Reagents)或《制造商规格及参考大纲-主要抗体目录》(MSRS Catalog of Primary Antibodies)来鉴定。用于产生单克隆及多克隆抗体的方法为本领域的普通技术人员所熟知。
所述方法的步骤可以以几个不同顺序完成。例如，所述抗体可以在接触所述起始物料之前偶联到所述磁性纳米粒子，或所述抗体可以在所述污染物-抗体靶形成之后添加。可选择地，所述抗体及所述磁性纳米粒子可以同时所述添加到起始物料。
生物传感器可以用于检测及定量所述起始物料中的所述污染物。合适的生物传感器包括但不限于阻抗生物传感器、石英晶体微天平生物传感器及粘弹性生物传感器，比如在标题为“检测物质中的未知污染物的浓度的方法”(Method for Detecting an Unknown ContaminantConcentration in a Substance)的美国11/329,009号专利申请(U.S.PatentApplication No.11/329,009)中描述者，所述专利的全部内容在此通过引用，被并入本专利。合适地，在此描述的生物传感器用于检测及定量所述起始物料中的所述污染物。
流感及新城疫病毒能够凝集红细胞，以形成病毒-红细胞复合物。发明人描述通过以红细胞接触起始物料来检测所述起始物料中的病毒的方法。所述起始物料中的所述病毒能够结合到所述红细胞，而所述红细胞-病毒复合物可以接着以生物传感器检测。合适地，阻抗生物传感器用于检测所述病毒-红细胞复合物，更合适地，在此描述的阻抗生物传感器用于检测所述病毒-红细胞复合物。所述病毒-红细胞复合物可以进一步与抗体接触，以便向所述生物传感器提供特异性。在用于在此描述的生物传感器时，所述抗体偶联到磁性纳米粒子。如以上所述，所述方法的步骤可以以不同顺序执行。例如，所述病毒可以结合到所述亲和性部分-纳米粒子复合物，然后以红细胞培养所述病毒或以所述病毒培养红细胞。在固定化的基于抗体的阻抗生物传感器中，所述病毒可以在添加到所述生物传感器之前与红细胞复合，或在所述病毒在所述生物传感器中被所述亲和性部分俘获之后与红细胞复合。
在图16A的一个特定实施例中，磁性纳米粒子被涂上病毒特异性抗体，以及用来将靶病毒从家禽拭子试样分离。作为生物标记的红细胞可以与所俘获的靶病毒混合而形成所述纳米粒子-病毒-红细胞复合物。微流控生物芯片设计及制作成流过设备，以便将所述复合物递送到嵌入的交叉梳状阵列化微电极，供作阻抗测量。所述纳米粒子-病毒-红细胞复合物的阻抗变化与原始试样中的禽流感病毒H5N1的浓度互相关联。
以下实施例的用意在于例示本发明，而不是意在限制本发明的专利权要求。
实施例 实施例1-物料及方法 在下列的所有实施例中，已经使用下述物料及方法，除非另有说明。
细菌的培养及表面接种(Culture and plating of bacteria) 冷藏贮备大肠杆菌O157:H7(ATCC 43888)在-70℃温度条件下在脑-心浸萃液态培养基(美国堪萨斯州勒那萨市Remel Inc.的脑-心浸萃液态培养基-BHI，Remel Inc.，Lenexa，Kansas)中维持。所述培养物在维持在37℃温度18至22小时之后的脑-心浸萃液态培养基(BHI)中采集。为了列举，纯培养物在0.01M，pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中系列稀释，并表面接种在已在37℃温度条件下培养20至22小时的山梨醇麦康凯琼脂(sorbitol MacConkey，SMAC agar)(美国Remel Inc.公司，Lenexa，Kansas)上。
禽流感病毒 禽流感病毒(H5N1)通过在鸡胚胎中培养及采集尿囊液而得，并由位于美国爱荷华州(Iowa)阿梅斯市(Ames)的美国国家兽医服务实验室(National Veterinary Services Laboratory)宰杀。所述病毒贮备溶液含有大约1×107蛋感染剂量(EID)每毫升(EID/ml)。
化学品及试剂 磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01M，pH 7.4)从Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯市-St.Louis，Missouri)获得。1.0％wt vol-1的牛血清蛋白(BSA)(美国新泽西州吉布斯汤市的EM Science公司-Gibbstown，New Jersey)在磷酸盐缓冲液(PBS)中制备成阻断缓冲液(PBS BSA)。蛋白A(得自金黄色葡萄球菌Cowan菌株细胞壁)从Sigma-Aldrich公司(美国密苏里州圣路易斯市-St.Louis，Missouri)获得。十分之一摩尔(0.1M)的置于去离子化水的甘露醇溶液(美国密苏里州圣路易斯市Sigma-Aldrich公司-St.Louis，Missouri)被用来洗涤及悬浮细菌及病毒，并被用来洗涤电极。所有的溶液皆以来自Millipore公司(美国马萨诸塞州贝德福德市-Bedford，MA)的去离子化水(Milli-Q，18.2 MΩ·cm)制备。
纳米粒子及抗体 与链霉抗生物素蛋白结合的磁性纳米粒子(平均直径为145nm，0.5mg Fe ml-1)从“分子探针公司”(Molecular Probes，Inc.)(美国俄勒冈州尤金市-Eugene，Oregon)获得。磁性纳米粒子含有超过85％的氧化物如四氧化三铁(Fe3O4)、大约80％wt wt-1的磁铁矿、及大约4×1011粒子每毫克(particles mg-1)的铁。
与生物素结合的、抵抗大肠杆菌的亲和纯化的多克隆抗体(对O及K抗原有特异性)从Biodesign International公司(美国缅因州萨科市-Saco，Maine)获得。生物素标记抗体的贮备溶液的浓度为4至5mg ml-1。在使用前，所述抗体按1∶10稀释比例在磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01M，pH 7.4)中稀释。
抵抗流感A H5N1红细胞凝集素(HA)的兔抗体(此后简称“抗红细胞凝集素(anti-HA)抗体”)购买自Biodesign International公司(美国缅因州萨科市-Saco，Maine)。在兔子身上培养这个亲和纯化的抗体，以对相应于红细胞凝集素蛋白的中区中的14种氨基酸对抗合成肽(Genbank接收号no.AAT76166)。
细菌的免疫磁性分离及浓缩 磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)在1.7ml无菌聚丙烯离心管中制备。生物素标记多克隆羊抗大肠杆菌抗体(7.5μl)与链霉抗生物素涂覆(coating)的磁性纳米粒子(15μl)在250μl的PBS BSA中在室温条件下、在变速转动器(美国马里兰州劳雷尔市ATR公司-Laurel，Maryland)上、以7rpm的转动速度连续地混合35分钟。在抗体固定化之后，磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)与150μl的生物素溶液(在PBS BSA中)混合15分钟，以便阻断存在于磁性纳米粒子表面上的未结合链霉抗生物素。多余的生物素以PBS-BSA冲洗，然后磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)在450μl的PBS BSA中悬浮。
大肠杆菌O157:H7的纯培养物从8.4×102到8.4×108CFU ml-1的系列稀释在磷酸盐缓冲液(PBS)(0.01M，pH 7.4)中进行。50μl等分部分的纯培养物与450μl的磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)混合，其免疫反应为时15分钟。在所述免疫反应之后，纳米粒子-细菌复合物以带间歇磁性分离的0.1M的甘露醇溶液洗涤三次，然后在100μl的甘露醇溶液中浓缩。最后，用注射泵以10μl/min的流率将附着到悬浮在甘露醇溶液中的纳米粒子抗体复合物(MNAC)的大肠杆菌O157:H7细胞注射到所述流单元。病毒检测也遵循相似的程序。
禽流感H5N1抗体的生物素化 根据生产商的说明，以“EZ-Link Sulfo-NHS Biotinylation Kit”(获得自美国伊利诺斯州罗克福德市(Rockford，Illinois)PIERCE公司)，执行禽流感H5N1抗体的生物素化。简要言之，将100μl的抗红细胞凝集素(anti-HA)抗体与3μl的磺酰-NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)-生物素(Sulfo-NHS-Biotin)溶液(10mM)混合到200μl的磷酸盐缓冲液(PBS)(10mM，pH 7.4)中，然后在室温条件下培养60分钟。接着，通过使用Slide-A-Lyzer透析卡(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes)将多余的生物素去除。以2-(4′-羟基偶氮苯)苯甲酸(2-(4′-Hydroxyazobenzene)Benzoic Acid，HABA)试验测量生物素结合的水平，测得为4至5摩尔生物素每摩尔抗体。
磁性纳米粒子与抗红细胞凝集素(anti-HA)抗体的结合 生物素标记禽流感H5N1抗体(抗红细胞凝集素(anti-HA)抗体；50μl)与链霉抗生物素涂覆的磁性纳米粒子(20μl)在50μl的磷酸盐缓冲液(PBS)中在室温条件下、在变速转动器(美国马里兰州劳雷尔市ATR公司-Laurel，Maryland)上、以15rpm的转动速度连续地混合40分钟。在抗体固定化之后，磁性纳米粒子与100μl的生物素溶液(1mg/ml，在磷酸盐缓冲液(PBS)中)混合20分钟，以便阻断存在于磁性纳米粒子表面上多余的链霉抗生物素。多余的生物素通过磁性分离洗除。
用于禽流感病毒的分离及浓缩的磁性纳米粒子抗体结合物 使与十倍系列稀释度(10-2、10-3、10-4及10-5)的失活禽流感H5N1病毒(原始滴度为1×107±1log EID50/ml)混合、来自家禽的泄殖腔拭子试样悬浮在500μl的缓冲液(带肝磷脂的等渗右旋糖60g右旋糖每公升蒸馏水)中，而且使用无病毒的泄殖腔拭子试样作为对照。接着，所述500μl的拭子试样与抗体涂覆的纳米粒子(以所述抗红细胞凝集素(anti-HA)抗体涂覆)混合，其免疫反应为时30分钟。在所述免疫反应之后，纳米粒子-病毒复合物以带间歇磁性分离的300μl、0.1M的甘露醇溶液洗涤，然后在150μl、0.1 M的甘露醇溶液中悬浮，以进行阻抗测量。除非另外说明，拭子试样都是以含有10^5 EID50/ml滴度病毒的溶液制备。
拭子试样的制备 来自家禽的泄殖腔及气管的拭子试样与十倍系列稀释度(10-2、10-3、10-4及10-5)的失活禽流感H5N1病毒(原始滴度为1×107±1 logEID50/ml)混合。所述拭子被悬浮在2ml的缓冲液(等渗右旋糖)中，而且使用不带病毒的泄殖腔或气管的拭子作为对照。
固定化程序 对于一些实验，有必要使用下述程序，以抵抗禽流感H5N1病毒的抗体来预涂所述微电极，以便在所述微电极上使病毒固定化，以供随后进行分析。首先，将蛋白A(1mg/ml，在10mM，pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中)注射到所述生物传感器，然后在室温条件下培养大约1.5-2小时。接着，进一步以抵抗禽流感H5N1病毒的抗体(在室温条件下培养2.5小时)来调节所述微电极。在以牛血清蛋白(BSA)(1％，在10mM，pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在室温条件下培养30分钟)阻断之后，所述芯片可供进行拭子试样测试。在每个固定化步骤之后，以0.1M的甘露醇溶液洗涤所述电极，然后执行阻抗测量。
阻抗测量 以带有IM-6/THALES软件的IM-6阻抗分析器(美国印地安那州西拉法叶市Bioanalytical Systems Inc.公司-West Lafayette，Indiana)执行阻抗测量。对于所有的阻抗测量，对所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)施加了100mV电压的正弦调制交流电，并为10Hz至1MHz频率范围测量阻抗的大小及相角。使用所试验的磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)，从取样到测量的检测总时间为35分钟(用于免疫反应、洗涤及测量的时间分别为15、10、10分钟)。
在有些实施例(包括相应于图28A及29A中显示的数据的实验)中，使用便携式手持设备，比如上述的阻抗生物传感器20，来采集数据。在特定实施例中，所述手持设备在单一频率而不是连续范围的频率采集数据。所述单一频率在1Hz至1MHz之间为合适，在100Hz至10kHz之间更为合适，而在1kHz至10kHz之间尤其合适。
所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)芯片的一个电极连接到测试探针及传感探针，而另一个电极则连接到所述阻抗分析器的参比电极及对电极。在每个测试结束时，所述流单元以0.1M的氢氧化钠溶液洗涤1小时、以去离子化水洗涤30分钟、以0.1M的盐酸洗涤1小时及最后以去离子化水冲洗1小时。洗涤期间使用的流率为10μl/min。含有磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)但不含大肠杆菌O157:H7的甘露醇溶液在所有的测试中作为对照使用。
为了确定带附着磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)的细菌细胞试样与对照组之间的阻抗测量最大差异时的频率，绘制了标准化阻抗变化(NIC)对频率的曲线图。标准化阻抗变化(NIC)的值已根据下列公式(1)求出 Zsample-Zcontrol 其中Zcontrol为对照组的阻抗大小，而Zsample为含有大肠杆菌O157:H7的试样的阻抗大小。也为其他包括病毒试样的试样执行同意义的计算。
碎牛肉试样的制备 碎牛肉从本地超市购得。使用实验室拍打式匀浆器Stomacher 400(英国诺福克郡Seward公司-Norfolk，UK)，在Whirl-pak塑料袋中以225ml的0.1％缓冲蛋白胨水均质化25g重的碎牛肉试样，为时2分钟。在匀浆之后，用离心机以250×g将所述试样离心过滤15分钟，共两次，以便分离碎牛肉匀浆水中存在的较大粒子。所述食品试样的上清层以十倍稀释的介于7.9×102至7.9×108CFUml-1之间的大肠杆菌O157:H7培养物接种。
实施例2-大肠杆菌O157:H7的阻抗测量 图17为波特图，其图解相应于附着有磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)的8.4×107CFU ml-1的大肠杆菌O157:H7以及对照(对照只带磁性纳米粒子抗体复合物(MNAC)但不带细菌)的测得阻抗。将试样注射到包含用于测量阻抗的非标记生物传感器的微流控单元。在0.1M的甘露醇中进行阻抗测量。阻抗差异(以图18的标准化阻抗变化，NIC，表示)显示，在53Hz至16kHz的频率区中表现上升趋势(从0.22％至61％)，接着在16kHz至1MHz的频率区中表现下降趋势(61％至6％)。阻抗测量值的最大差异发生在显得大的中值电阻区(1kHz至50kHz)，并在16kHz达到顶点(如图18中所示)。
实施例3-检测阻抗生物传感器的、涉及纯培养物及碎牛肉试样中的大肠杆菌O157:H7的检测的检测极限 图19A、19B、19C及19D显示存在于纯培养物及碎牛肉试样中的、介于101至107CFUml-1之间的所有浓度的大肠杆菌O157:H7的测得阻抗(使用非标记生物传感器测量)。实验发现，由细菌导致的阻抗随着所述试样中的细胞数目线性地增加。细菌对所述生物传感器的表面的极化及绝缘作用只是在纯培养物的浓度为105CFUml-1或更高时及在与碎牛肉混合的试样的浓度为106CFUml-1或更高时，才开始改变阻抗。图19B及19D显示在频率为16kHz时的阻抗的快照，并实证在纯培养物的浓度在105至107CFUml-1之间及碎牛肉试样的浓度在106至107CFUml-1之间时，所述对照试样与纯培养物及碎牛肉试样之间的确存在可检测的、具有统计意义的阻抗差异。
实施例4-使用其上的抗体被固定化的阻抗生物传感器进行禽流感病毒的检测 通过浸沾可能含有禽流感病毒(50-100nm直径)、非禽流感病毒及其他分子的拭子到等渗右旋糖缓冲液，制备家禽拭子试样。接着，将1ml的0.5％红细胞悬浮液添加到所述拭子试样溶液，并混合1-5分钟，以形成红细胞-病毒复合物。流感病毒以及新城疫病毒能够凝集红细胞，形成病毒-红细胞复合物。
将带有所述复合物的拭子试样送入微流控通道(深40μm、宽100μm、长10mm)。将交叉梳状阵列化微电极(电极指宽度及电极指之间的间隙皆为15μm)嵌入所述微流控通道，然后将与蛋白A结合的禽流感病毒多克隆抗体涂上所述交叉梳状阵列化微电极，产生在此描述的“固定化”生物传感器。在通过所述微流控通道时，所述禽流感病毒-红细胞复合物被所述固定化的禽流感病毒抗体(抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体)俘获，导致阻抗改变。施加0.1M的甘露醇溶液，以便在测量阻抗之前将松散地附着的非禽流感分子洗掉。
使用阻抗分析器，在1Hz及1MHz之间的频率测量阻抗。测量结果在图20中描绘，测量结果证明所述病毒-红细胞复合物导致可观的阻抗增加。图21证明禽流感病毒并未独自地造成可观的阻抗变化，但在添加所述病毒之后将红细胞添加到所述生物传感器导致可观的阻抗变化。
实施例5-使用磁性纳米粒子抗体复合物、以阻抗生物传感器检测禽流感病毒 将磁性纳米粒子(MNACs)偶联到对禽流感病毒有特异性的多克隆抗体(抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体)。在所述自动磁性试样中使用所述纳米粒子-抗体复合物，以便从家禽拭子试样中分离及浓缩靶病毒。如在此描述的那样，将当作生物标记来使用的红细胞与所俘获的靶病毒混合，形成亲和性部分-涂覆纳米粒子-病毒-红细胞复合物。如以上所述，接着将所述复合物递送到非标记、通过的阻抗生物传感器，以进行阻抗测量。测量所述亲和性部分-涂覆纳米粒子-病毒-红细胞复合物的阻抗变化。
如图22中所示，使用结合到禽流感病毒H5N1的、其上偶联有血细胞凝聚素特异性(HA-specific)的多克隆抗体的磁性纳米粒子(MNACs)，检测禽流感病毒H5N1。在所述附图中，“甘露醇”单指缓冲液，而“病毒”指带有所述纳米粒子-亲和性部分-病毒复合物的试样。
实施例6-对禽流感的特异性 将新城疫病毒及传染性支气管炎病毒的组合物与禽流感病毒H5N1以1∶1的比率混合。接着，可选地以红细胞培养所述病毒混合物，然后在带有嵌入交叉梳状阵列化微电极(所述特异性抗体已经在其上固定化)的微流控通道中测量阻抗。使用带有IL-6/THALES软件的IM-6阻抗分析器(固定化抗体阻抗生物传感器)(美国印地安那州西拉法叶市Bioanalytical Systems Inc.公司-West Lafayette，Indiana)进行阻抗测量。
如以上所述，在用试剂涂覆所述生物传感器来固定化抗体的不同阶段，进行阻抗测量。在图23A及23B中，“裸金(bare)”表示所述空生物传感器的阻抗，“蛋白A”表示在添加蛋白A之后的阻抗，“抗血细胞凝聚素(anti-HA)”表示所述生物传感器涂上所述抗体时的阻抗测量值，“牛血清蛋白(BSA)”表示在以PBS-BSA阻断缓冲液洗涤之后的阻抗，“新城疫病/传染性支气管炎+H5N1+红细胞(NCD/IB+H5N1+RBC)”表示在添加所述病毒混合物和红细胞之后的阻抗(图23A)，“新城疫病/传染性支气管炎+H5N1(NCD/IB+H5N1)”表示在添加所述病毒混合物之后但在添加红细胞之前的阻抗(图23A)，而“红细胞(RBC)”表示在已经添加所述病毒之后再添加红细胞之后的阻抗。
在图23A中，以红细胞预培养所述病毒混合物，然后使所述病毒混合物通过所述阻抗生物传感器。结果显示，即使是在存在污染病毒的情况下，所述混合物能够产生可观的阻抗变化。
在图23B中，在添加红细胞之前使所述病毒混合物通过所述阻抗生物传感器，然后在所述生物传感器俘获所述病毒之后添加红细胞。图23B证明，所述固定化生物传感器能够检测混合病毒试样中的禽流感病毒，而且红细胞的添加扩大了阻抗变化。显著地，即使是在添加红细胞之后，没有监测到新城疫病毒或传染性支气管炎病毒的信号。实施例7-经过离心分离后的气管拭子中的病毒的检测 使用标准程序，从雏鸡获得气管拭子，并按上述方法制备气管拭子试样。将所述拭子冲洗到2ml的等渗右旋糖缓冲液中，并以2000rpm的旋转速度离心过滤30分钟。接着以1ml的0.5％红细胞悬浮液(带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液)，在4℃温度条件下培养来自所述洗剂的上清层40分钟，然后进行另一轮为时10分钟的转动速度为1500rpm的离心过滤。沉积物悬浮在0.5ml的等渗右旋糖缓冲液中，用于阻抗分析。
通过以蛋白A涂上生物传感器表面，接着以抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体涂上生物传感器表面，然后以PBS-BSA阻断，对所述固定化阻抗生物传感器进行准备。结果在图25A及25B中显示。图25A显示在没有添加病毒到所述气管拭子时的阻抗。图25B显示添加病毒到所述气管拭子时的阻抗。所述拭子中的病毒的存在有效地增加了阻抗。
实施例8-经过磁性分离后的气管拭子中的病毒的检测 使用标准程序，从雏鸡获得气管拭子，并按上述方法制备气管拭子试样。将所述拭子冲洗到2ml带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液中。接着，以用上述方法产生的纳米粒子连接的抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体复合物培养“对照”试样。以H5N1病毒附加到“气管拭子+H5N1”试样。将所述气管拭子浸入105EID50/ml的禽流感病毒溶液，然后冲洗到2ml的等渗右旋糖缓冲液中。最终的病毒浓度估计为104-105EID50/ml。接着用已经叙述过的方法将合成的病毒-纳米粒子-抗体复合物磁性地分离。所述非标记阻抗生物传感器的结果在图26中描绘。所述结果表明，与对照拭子试样比较，在所述气管拭子试样中存在禽流感病毒H5N1时，阻抗明显增加。
实施例9-经过离心分离后的泄殖腔拭子中的病毒的检测 使用标准程序，从雏鸡获得泄殖腔拭子，并按上述方法制备泄殖腔拭子试样。将带或不带病毒的所述拭子冲洗到2ml的等渗右旋糖缓冲液中，并以2000rpm的旋转速度离心过滤30分钟。对于那些添加病毒的试样，泄殖腔拭子被浸入105EID50/ml的禽流感病毒溶液，然后冲洗到2ml的等渗右旋糖缓冲液中。接着以1ml的0.5％红细胞(在带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液中)，在4℃温度条件下培养来自所述洗剂的上清层40分钟，然后进行另一轮为时10分钟的转动速度为1500rpm的离心过滤。沉积物重悬在0.5ml的等渗右旋糖缓冲液中，用于阻抗分析。
如以上所述，通过以蛋白A涂上生物传感器表面，接着以抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体涂上生物传感器表面，最后以PBS-BSA阻断，对所述固定化阻抗生物传感器进行准备。结果在图27中显示，而且与使用气管拭子获得结果相似。图27A显示在没有添加病毒到所述泄殖腔拭子时的阻抗。图27B显示添加病毒到所述泄殖腔拭子时的阻抗。所述拭子中的病毒的存在显著地增加了阻抗。
实施例10-固定化阻抗生物传感器的敏感度 使用标准程序，从雏鸡获得泄殖腔拭子，并通过使所述拭子暴露于不同浓度的禽流感病毒H5N1制备泄殖腔拭子试样。将所述泄殖腔拭子浸入一系列十倍稀释度的禽流感病毒溶液，然后将所述泄殖腔拭子冲洗到2ml的等渗右旋糖缓冲液。将所述拭子冲洗到2ml的带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液中，然后用离心机以2000rpm的旋转速度离心过滤30分钟。接着以1ml的0.5％红细胞(在带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液中)，在4℃温度条件下培养来自所述洗剂的上清层40分钟，然后进行另一轮为时10分钟的转动速度为1500rpm的离心过滤。沉积物悬浮在0.2ml的带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液中，用于阻抗分析。
如以上所述，通过以蛋白A涂上生物传感器表面，接着以抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体涂上生物传感器表面，然后以PBS-BSA阻断，对所述固定化阻抗生物传感器进行准备。结果在图28中显示。图28A显示频率为10,400Hz时测得的阻抗数据的条形图。所述数据显示，随着病毒稀释度从1/100,000降到1/10,000时，或大约103EID50/ml，阻抗明显增加。这个敏感度足以用于受感染家禽的现场测试。图28B则显示在一定的频率范围测试时的不同稀释度的病毒的阻抗变化。
实施例11-非标记阻抗生物传感器的敏感度 使用标准程序，从雏鸡获得泄殖腔拭子，并通过使所述拭子暴露于不同浓度的禽流感病毒H5N1制备泄殖腔拭子试样。将所述泄殖腔拭子浸入一系列十倍稀释度，在1/100、1/1000、1/10000及1/100000的最终浓度的禽流感病毒溶液，然后将所述泄殖腔拭子冲洗到2ml的等渗右旋糖缓冲液。接着，以用上述方法产生的纳米粒子连接的抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体复合物培养所述拭子。接着以1ml的0.5％红细胞悬浮液(在带肝磷脂的等渗右旋糖缓冲液中)培养所述合成的病毒-纳米粒子-抗体复合物，然后用上述方法将所述合成的病毒-纳米粒子-抗体复合物磁性地分离。
所述非标记阻抗生物传感器的检测结果在图29A及29B中描绘。图29A显示频率为4,150Hz时测得的阻抗数据的条形图。所述数据显示，随着病毒稀释到1/100,000时，或大约102 EID50/ml时，阻抗明显增加。这个敏感度足以用于受感染家禽的现场测试。图29B则显示在一定的频率范围测试时的不同稀释度的病毒的阻抗变化。
实施例12-使用非标记阻抗生物传感器检测禽流感病毒 也使用在此描述的磁性纳米粒子-抗体复合物及非标记阻抗生物传感器来检测禽流感H5N1。简要言之，将链霉抗生物素涂覆的纳米粒子链接到生物素化的抗血细胞凝聚素(anti-HA)抗体，然后将禽流感病毒H5N1或新城疫病毒及传染性支气管炎病毒的混合物添加到所述纳米粒子-抗体复合物。使所述复合物通过所述阻抗生物传感器。结果在图24中描绘，结果显示其能够明确地检测H5N1病毒。所述结果也显示，阻抗不受非靶病毒的存在的影响。
如图30中所示，在泄殖腔拭子试样中的禽流感病毒H5N1的浓度等于或超过100EID50/mL时，获得指示所述病毒的存在的正信号。图24显示，在频率为10kHz时，与(无病毒的)对照组或含有新城疫病毒及传染性支气管炎病毒的试样比较，含有禽流感病毒H5N1的试样的阻抗明显增加。所述结果显示，敏感度比现有的抗原俘获酶联免疫吸附试验(ELISA)敏感100倍。100至800kΩ的最大阻抗变化发生于1kHz至100kHz的频率范围。
实施例13-使用磁性纳米粒子及以使用非商业化抗体的固定化阻抗生物传感器检测禽流感病毒 使用在兔子身上产生的非商业化多克隆抗-H5抗体，进行另一组病毒检测实验。使用标准实验方案，对重组H5多肽(获得自美国康涅狄格州Protein Science Inc.公司-Meriden，Connecticut；A/Vietnam/1203/2004)培养所述抗体。来自所述兔子的抗-H5抗体通过硫酸铵沉淀纯化，对乙酸盐缓冲液及磷酸盐缓冲液透析，然后供生物传感器用。
在有些实验中(参看图31A-31D中所示的结果)，所述抗体链接到已经与禽流感H5N1病毒粒子结合的磁性纳米粒子。使所述抗体标记纳米粒子与不同浓度的H5N1病毒结合(或只与缓冲液结合，作为对照)，然后在应用到非标记生物传感器之前进一步处理。在其他的实验中(结果见图31E)，以所述抗体涂上位于微流控室中的所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)生物传感器，产生“固定化”生物传感器。
生物素化所述H5型抗体，以便附着到链霉抗生物素涂覆的纳米粒子。根据生产商的说明，以“EZ-Link Sulfo-NHS Biotinylation Kit”执行抗-H5抗体的生物素化。简要言之，将100μl的抗红细胞凝集素(anti-HA)抗体(4.9mg/ml)与3μl的磺酰-N羟基琥珀酰亚胺-生物素(Sulfo-NHS-Biotin)溶液(10mM)混合到200μl的磷酸盐缓冲液(PBS)(10mM，pH 7.4)中，然后在室温条件下培养60分钟。接着，通过使用Slide-A-Lyzer透析卡(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes)将多余的生物素去除。以HABA(2-(4′-羟基偶氮苯)苯甲酸)试验测量生物素结合的水平，测得为4至5摩尔生物素每摩尔抗体。
生物素标记抗-H5抗体(50μl)与链霉抗生物素涂覆的磁性纳米粒子(20μl)在50μl的磷酸盐缓冲液(PBS)中在室温条件下、在变速转动器(美国马里兰州劳雷尔市ATR公司-Laurel，Maryland)上、以15rpm的转动速度连续地混合40分钟。在抗体固定化之后，磁性纳米粒子与100μl的生物素溶液(1mg/ml，在磷酸盐缓冲液(PBS)中)混合20分钟，以便阻断存在于磁性纳米粒子表面上多余的链霉抗生物素。多余的生物素通过磁性分离洗除。
使十倍系列稀释(10-2、10-3、10-4、10-5及10-6)的失活禽流感H5N1病毒(其原始滴度为1×107±1log EID50/ml的溶液的稀释物)悬浮在500μl的缓冲液(等渗右旋糖)中，而且使用不含病毒的缓冲液作为对照。接着，所述500μl的试样与抗体涂覆的纳米粒子混合，其免疫反应为时30分钟。在所述免疫反应之后，纳米粒子-病毒复合物以带间歇磁性分离的300μl、0.1M的甘露醇溶液洗涤，然后在150μl、0.1M的甘露醇溶液中悬浮，以进行阻抗测量。
使用蛋白A，使所述抗体附着到所述生物传感器。首先，将蛋白A(1mg/ml，在10mM，pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中)注射到所述微流控室，然后在室温条件下培养1.5-2小时。接着，进一步以抗-H5抗体(245μg/ml)(在室温条件下培养2.5小时)来调节所述微电极。在以牛血清蛋白(BSA)(1％，在10mM，pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在室温条件下培养30分钟)阻断之后，所述芯片可供进行试样测试。在每个固定化步骤之后，以0.1M的甘露醇溶液洗涤所述电极，然后执行阻抗测量。
以带有IM-6/THALES软件的IM-6阻抗分析器(美国印地安那州西拉法叶市Bioanalytical Systems Inc.公司-West Lafayette，Indiana)执行阻抗测量。对于所有的阻抗测量，对所述交叉梳状阵列化微电极(IDAM)施加了100mV电压的正弦调制交流电，并为10Hz至1MHz频率范围测量阻抗的大小及相角。
阻抗测量的结果在图31A-31E中显示。图31A-31C显示对试样的三个独立的测量，这些测量比较105EID50/ml病毒(“H5N1”)、洗涤液(“甘露醇”)或只含等渗右旋糖缓冲液的对照试样(“对照”)的阻抗。图31D显示使用以上述病毒稀释系列制备的试样(标记“10^1EID50/ml”到“10^5EID50/ml”)及所述无病毒等渗右旋糖缓冲液(“对照”)测得的阻抗的比较。图31E显示在所述抗体标记程序的每个步骤之后、在不使用纳米粒子的情况下在固定化生物传感器上进行的阻抗测量。
权利要求
1、一种用于检测起始物料中的污染物的阻抗生物传感器，所述生物传感器包括
座板；
输入设备，所述输入设备由所述座板支持；
输出设备，所述输出设备由所述座板支持；
微流控单元，所述微流控单元由所述座板支持，所述起始物料能够与所述微流控单元接合；以及
阻抗分析器，所述阻抗分析器由所述座板支持，而且能够操作来测量所述起始物料的阻抗，以便检测污染物的存在。
2、如权利要求1中所述的阻抗生物传感器，进一步包括交叉梳状阵列化微电极，所述交叉梳状阵列化微电极连接到所述阻抗分析器。
3、如权利要求2中所述的阻抗生物传感器，其中所述交叉梳状阵列化微电极配置于所述微流控单元中。
4、如权利要求1中所述的阻抗生物传感器，其中所述阻抗生物传感器是便携式设备。
5、如权利要求1中所述的阻抗生物传感器，其中所述阻抗生物传感器是手持式设备。
6、如权利要求1中所述的阻抗生物传感器，进一步包括注射口，所述注射口与所述微流控单元流动地接合，所述起始物料可以通过所述微流控单元引入所述生物传感器。
7、如权利要求6中所述的阻抗生物传感器，进一步包括废料储存室以存储已用起始物料，所述废料储存室与所述微流控单元流动地接合，所述起始物料从所述微流控单元流到所述废料储存室。
8、一种用于检测及定量起始物料中的污染物的阻抗生物传感器，所述生物传感器包括
注射口，所述起始物料可以通过所述注射口引入所述生物传感器；
微流控单元，所述微流控单元包括
入口，
出口，
微通道，所述微通道在所述入口及所述出口之间延伸并包括检测室，及
多个微电极，所述多个微电极位于所述检测室内，
其中所述起始物料通过所述入口引入所述微流控单元，并从所述入口流经所述微通道及所述检测室，然后通过所述出口流出所述微流控单元；
废料储存室，用于储存已使用起始物料，所述起始物料从所述微流控单元的出口流到废料储存室；
排放口，所述排放口流动地接合到所述废料储存室，所述已使用起始物料从所述废料储存室通过所述排放口排放；以及
阻抗分析器，能够操作所述阻抗分析器来测量所述检测室中的所述起始物料的阻抗，以便检测所述起始物料中的污染物的存在及定量所述起始物料中的污染物的量。
9、一种用于检测及定量起始物料中的污染物的便携式阻抗生物传感器，所述生物传感器包括
座板，所述座板包括第一部分及第二部分，所述第一部分及所述第二部分可移动地连接在一起，以便在连接在一起时确定座板空腔；
键区，所述键区由所述座板的所述第一部分支持；
显示器，所述显示器由所述座板的所述第一部分支持；
电池插座，所述电池插座限定在所述座板的所述第二部分；
盖子，所述盖子在位置上能够移动地连接到所述座板的所述第二部分，以便覆盖所述电池插座；
注射口，所述注射口限定在所述座板，可以通过所述注射口将所述起始物料引入所述生物传感器；
微流控单元，所述微流控单元在空腔中通过座板支撑，包括
入口，
出口，
微通道，所述微通道在所述入口及所述出口之间延伸并包括检测室，及
多个微电极，所述多个微电极位于所述检测室内，
其中所述起始物料通过所述入口引入所述微流控单元，并从所述入口流经所述微通道及所述检测室，然后通过所述出口流出所述微流控单元；
废料储存室，所述废料储存室由座板限定，用于储存已使用起始物料，所述起始物料从所述微流控单元的出口流到废料储存室；
排放口，所述排放口由所述座板限定，而且流动地接合到所述废料储存室，所述已使用起始物料从所述废料储存室通过所述排放口排放；以及
阻抗分析器，所述阻抗分析器由所述座板支持在空腔中，而且能够操作来测量所述检测室中的所述起始物料的阻抗，以便检测所述起始物料中的污染物的存在及定量所述起始物料中的污染物的量。
10、一种用于检测起始物料中的污染物的方法，所述方法包括
a)以能够结合到所述污染物的亲和性部分接触所述起始物料以形成靶，其中所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子；以及
b)以权利要求1中所述的生物传感器检测所述靶，其中所述靶的检测可指示所述起始物料中的污染物的存在。
11、如权利要求10中所述的方法，进一步包括在步骤b)之前将所述靶从所述起始物料磁性分离。
12、如权利要求10中所述的方法，进一步包括在步骤b)之前将所述靶从所述起始物料离心分离。
13、如权利要求10中所述的方法，进一步包括在步骤b)之前通过过滤将所述靶从所述起始物料分离。
14、如权利要求10中所述的方法，其中所述亲和性部分通过偶联到所述磁性纳米粒子的、而且能够结合所述亲和性部分的接头，附着到所述磁性纳米粒子。
15、如权利要求14中所述的方法，其中所述接头选择自包括蛋白A、蛋白G、Fc受体及抗-Fc抗体的组。
16、如权利要求10中所述的方法，其中所述亲和性部分通过选择自包括生物素-链霉抗生物素蛋白、生物素-抗生物素蛋白及IgG-抗-IgG的组的桥接复合物，附着到所述磁性纳米粒子，其中所述桥接复合物的一部分偶联到所述磁性纳米粒子及所述桥接复合物的第二部分偶联到所述亲和性部分。
17、如权利要求10中所述的方法，其中所述起始物料选择自包括食品、动物、环境试样及临床试样的组。
18、如权利要求17中所述的方法，其中所述食品选择自包括水果、蔬菜、未经加工食物、熟食品、牛肉产品、猪肉产品、家禽产品、海鲜产品及奶制品的组。
19、如权利要求18中所述的方法，其中所述家禽产品选择自包括畜体、畜体冲洗水试样、去骨鸡、碎家禽肉试样及家禽馅饼的组。
20、如权利要求17中所述的方法，其中所述环境试样选择自包括水试样、空气试样及土壤试样的组。
21、如权利要求17中所述的方法，其中所述临床试样选择自包括尿试样、血液试样、排泄物试样、来自皮肤表面的拭子、来自器官表面的拭子、泄殖腔拭子、气管拭子及组织试样的组。
22、如权利要求10中所述的方法，其中所述污染物选择自包括原核生物、真核生物、病毒及多肽的组。
23、如权利要求22中所述的方法，其中所述原核生物选择自包括大肠杆菌、大肠杆菌O157:H7、沙门菌及单核细胞增多利斯特菌的组。
24、如权利要求22中所述的方法，其中所述病毒选择自包括流感病毒、禽流感H5N1、新城疫病毒及传染性支气管炎的所有亚类或菌株的组。
25、如权利要求22中所述的方法，其中所述多肽选择自包括毒素及朊病毒的组。
26、如权利要求10中所述的方法，进一步包括确定所述起始物料中的所述污染物的数量。
27、一种用于检测起始物料中的病毒的方法，所述方法包括
a)以红细胞接触所述起始物料，其中所述病毒能够结合到所述红细胞以形成复合物；以及
b)以生物传感器检测所述复合物，其中所述复合物的检测可指示所述起始物料中的所述病毒的存在。
28、如权利要求27中所述的方法，进一步包括以能够结合到所述病毒的亲和性部分接触所述起始物料，其中所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子，以形成磁性靶。
29、如权利要求27中所述的方法，其中所述病毒选择自包括流感、禽流感H5N1及新城疫病毒的组。
30、如权利要求27中所述的方法，其中所述起始物料选择自包括食品、动物、环境试样及临床试样的组。
31、如权利要求27中所述的方法，其中用于检测所述靶的所述生物传感器是阻抗生物传感器。
32、如权利要求31中所述的方法，其中所述阻抗生物传感器是权利要求1中所述的生物传感器。
33、如权利要求27中所述的方法，进一步包括确定所述起始物料中的所述病毒的数量。
34、一种用于检测起始物料中的污染物的方法，所述方法包括
a)以能够结合到所述污染物的亲和性部分接触所述起始物料以形成靶，其中所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子；以及
b)以阻抗生物传感器检测所述靶，其中所述靶的检测可指示所述起始物料中的污染物的存在。
35、如权利要求34中所述的方法，其中所述亲和性部分是红细胞。
36、如权利要求34中所述的方法，其中所述亲和性部分是抗体。
37、如权利要求34中所述的方法，其中所述阻抗生物传感器包括交叉梳状阵列化微电极。
38、如权利要求37中所述的方法，其中所述交叉梳状阵列化微电极配置在微流控单元中，而检测所述靶的步骤进一步包括将所述试样递送到所述微流控单元。
39、如权利要求34中所述的方法，进一步包括在步骤b)之前将所述靶从所述起始物料磁性分离。
40、如权利要求34中所述的方法，进一步包括在步骤b)之前将所述靶从所述起始物料离心分离。
41、如权利要求34中所述的方法，进一步包括在步骤b)之前通过过滤将所述靶从所述起始物料分离。
42、如权利要求34中所述的方法，其中所述污染物是细菌或病毒。
43、如权利要求34中所述的方法，其中所述污染物是禽流感病毒H5N1。
44、如权利要求34中所述的方法，其中所述生物传感器有附着到其上的亲和性部分。
45、如权利要求34中所述的方法，其中所述亲和性部分并没有附着到所述交叉梳状阵列化微电极生物传感器。
46、一种用于检测起始物料中的污染物的方法，所述方法包括
a)以能够结合到所述污染物的亲和性部分接触所述起始物料以形成靶，其中所述亲和性部分偶联到磁性纳米粒子；
b)将所述靶从所述起始物料分离；
c)将所述靶递送到微流控单元，所述微流控单元中配置有交叉梳状阵列化微电极生物传感器；以及
d)以所述交叉梳状阵列化微电极生物传感器检测所述靶，其中所述靶的检测指示所述起始物料中的污染物的存在。
47、如权利要求46中所述的方法，其中将所述靶从所述起始物料分离的步骤包括将所述靶从所述起始物料磁性分离。
48、如权利要求46中所述的方法，其中步骤a)进一步包括以红细胞接触所述起始物料。
49、如权利要求46中所述的方法，进一步包括在步骤c)之前以红细胞接触所述靶。
50、如权利要求46中所述的方法，进一步包括在步骤d)之前将红细胞递送到所述微流控单元。
51、如权利要求46中所述的方法，其中所述交叉梳状阵列化微电极生物传感器有附着到其上的亲和性部分。
52、如权利要求51中所述的方法，其中所述亲和性部分是抗体。
全文摘要
一种用于检测起始物料中的污染物的阻抗生物传感器，所述生物传感器包括座板；输入设备，所述输入设备由所述座板支持；输出设备，所述输出设备由所述座板支持；微流控单元，所述微流控单元由所述座板支持，所述起始物料能够与所述微流控单元接合；以及阻抗分析器，所述阻抗分析器由所述座板支持，而且能够操作来测量所述起始物料的阻抗，以便检测污染物的存在。
文档编号C12Q1/04GK101528942SQ200780040178
公开日2009年9月9日 申请日期2007年8月31日 优先权日2006年9月1日
发明者Y·李, B·哈吉斯, S·邓, L·贝里曼, W·伯特杰, R·王, Z·叶, M·瓦什尼, B·斯里尼瓦桑 申请人:阿肯色大学评议会