个体化治疗的处理方法

专利名称：：个体化治疗的处理方法
技术领域：
：本发明公开了一种用于同时测定两种或两种以上的化学(治疗)药物向病变组织和病原体处的配送的方法，在此过程中产生个体化的患者报告，用该报告选择基于个体的最佳化学药剂和剂量。
背景技术：
：化学疗法是用于癌症的临床治疗的有力工具。药物、药物组合、剂量以及治疗方案的选择常常是基于组的统计数据作出的。化学疗法中药剂剂量的选择非常难。例如，如果剂量太少，对肿瘤的治疗将会没有效果；而如果剂量太大，药剂的毒性(副作用)又会令患者无法忍受。这导致在大多数的治疗设定中形成详细的用药计划，从而在药物存在毒性时为正确决定和调整用药剂量提供指导。原则上在免疫疗法中药物的用量比在恶性疾病的治疗中要少。在大多数情形下，根据患者的体表面积、体重和(在数学上接近人体体积的)身高的综合衡量来调整药物的剂量。因此，可望在对个体患者肿瘤因子进行分析的基础上选择药物，从而在不增加毒性的基础上提高疗效。虽然化学疗法的剂量主要基于体表面积，但几乎没有数据实际支持这种方法的使用(参见文献Cancer-PrinciplesandPracticeofOncology,6thedition.335_344，2001)。这种方法的主要不利之处是体表面积与肝功能的关联度很低，而相当多的抑制细胞生长型癌症化疗药物是通过肝脏代谢的，于是这种方法就很成问题。此外，现在的剂量策略会导致曲线下面积(AUC)和通过多个因素中的一个因素进行的药物清除率方面的患者体内变异(参见文献J.Clin.Oncol.14:2590-2611，1996)。由于这些缺点，人们需要基于个体化肿瘤特征的更具预见性的工具，以用于药物和剂量的选择。乳腺癌的治疗对于患者和临床医生来说都是很具挑战性的，因为有许多种疗法都失败了。那些对所选药物不起反应的肿瘤也常常是这种结果。由于目前尚无一种方法能够始终在开始治疗之前对反应作出预测，因此一般采用反复试验法进行试验。目前基于几个一般参量例如肿瘤组织学、临床分期、受体和抗原地位等来选择乳腺癌化疗药物。这些预测因子导致有些患者接受到有毒而无疗效的药物。此外，识别有益的个性化方案所花费的时间进一步延迟了反应治疗。很多肿瘤如果发现得早、且治疗方案合适的话，是可以有效地治疗的。因此，需要更好的、关于个体患者对特定化疗化合物的肿瘤应答预测因子方面的信息。用于乳腺癌的化疗方案的疗效对于不同的患者变化很大。因此，有相当比例的患者受到有毒药物的治疗但又没有产生有益的疗效，而有些患者对于他们会得到最大收益的方案的获得被延迟了。精确预测化疗药物的早期应答对于确定乳腺癌患者的最佳临床管理极有价值。现有技术中已有一些试图解决前述问题的尝试，其中之一记载在文献"Silvermanetal.，Mol.ImagingBiol.8(1):36-42，2006"中用3'-氟[18F]-3'_脱氧胸苷进行正电子发射断层扫描(PET)，以期预测乳腺肿瘤对治疗的应答。特别地，该文献的作者得出结论使用氟化脱氧胸苷标记物的PET扫描对于预测患乳腺癌妇女的化疗方案的长期疗效是"有用的"，所述标记物在化疗第1疗程结束后两周获得。这种"有用的"结论难以直接回答如何为患者选择治疗方法或适当剂量的问题。这仅仅是一种测量肿瘤收縮的疗效监测工具。在Delgrorio等人的研究中，将单个化合物施加给动物和细胞株，化合物的用量为治疗水平剂量，并使用AMS(加速器质谱)来测量总的碳-14含量。用HPLC(高效液相色谱)没有测到任何代谢产物。美国专利4，037，100公开了一种装置，该装置可用于检测负电粒子，并提供粒子的元素组成数据。该装置包括可用于进行质量和元素分析的加速器质谱仪。加速器质谱(AMS)法是一种用于测定长寿命但稀少的宇生同位素的灵敏方法，所述宇生同位素的半衰期一般在103至2X107年之间。半衰期处在这一范围的同位素寿命太长，以至于用传统的衰变测量技术无法测出；但在地质年代表上这寿命又太短了，以至于没有在生物圈或岩石圈形成可评估的浓度。用AMS测量宇生同位素(例如、e，"C，26Al，"Ca，36Cl，以及1291)已经成为考古学、海洋学和地球科学领域的常用工具，但还没有广泛应用于生物学和临床医学领域。White和Brown(TrendsPharmacol.Sci.25:442-447,2004)提供了AMS用于药理学和毒物学领域的例子。对瑞典儿童给以"C-尿素，通过用AMS测量呼吸或尿液中的"C来检测幽门螺旋菌(Helicobacterpylori)。将14C_苯给送到小鼠体内、进入肝脏和骨髓，用AMS测量。此外，通过类似的微剂量研究测定DNA没有获得的药物。一篇参考文献表明，从熟肉中形成的致癌物质MeIQx能够到达结肠癌患者的正常组织和肿瘤组织(Mautheetal.，Int.J.Cancer80:539-545，1999)。在人的肿瘤组织和正常组织内也发现了类似的DNA损伤。将高剂量的"C-三苯氧胺给药给要进行子宫切除的妇女，以(通过AMS)检测子宫中的DNA损伤。研究表明，有一些DNA损伤被AMS探测到，但尚不足以引发瘤样病变。也可将将其它同位素(特别是钙和铝的同位素)导入人体，用AMS进行检测。但除了这些使用AMS的情形外，没有文献公开过施加在癌细胞或正常细胞上的两种或多种药物的不同效果。Brown等人(参见文献MassSpectrometryRev.25:127_145，2006)研究了用AMS检测施加了"C-致癌物质的测试对象中蛋白质和DNA内的变化。此外，还用力，、e,Al，tl，"Ca和129I同位素通过AMS进行了生物学研究。Wu等人(参见文献Int.J.Gynecol.Cancer12:409-423,2002)用二维凝胶、蛋白质芯片和其它方法进行了肿瘤研究中的蛋白质组学研究。用质谱(但不是AMS)溶解和测量来自生物样品中的有机小分子。文中提议用激光捕获显微切割(LCM)技术在显微镜下分离特定细胞，以用于后续研究。LCM也与质谱结合起来、从周围组织中捕获和除去细胞。Lee禾口Macgregor在论文ModernDrugDiscovery(July):45_49，2004中研究了由于在药物的吸收、代谢、消除以及其它过程中发生的变化而导致的癌细胞内的抗药性问题。DNA微阵列数据可用于检测化疗应答的生物标记物。例如，卵巢癌化疗复发患者的标记物CA125上升了70%。很多商业组织例如RationalTherapeutics、0ncotech，以及Genzyme等进行了患者癌细胞的抗药性和灵敏性的体外测试。没有证据证明这些测试的价值；且许多保险公司不对肿瘤细胞的体外测试承保。例如，0ncotech公司声称其EDR测定(将原代癌细胞暴露在软琼脂内的药物中5天)可以预报患者化疗中的抗药性(无效药识别精确度在99%以上，信息来自Oncotech公司网站)。但是，0ncotech公司的测试需要至少两克活的肿瘤组织；且患者在标本采集的三周内必须没有在接受化疗或放射治疗。类似地，Genzyme公司声称其对肿瘤的抗化疗性的预测精确度可达99%。但这些公司中没有一家说过其可以精确地预测哪种药将会有效，特别是两种或多种药结合起来同时施用时、预测其中一种药是否有效。最后，Sharma等人(参见文献CancerCellInternational5:26-45，2005)研究了用Na磁共振成像来监测大鼠乳腺癌的泰索帝治疗疗效。在良性和恶性的乳腺肿瘤内发现了升高的细胞内钠浓度。抗癌药的施用令细胞内钠浓度升高，但这些药引起的细胞凋亡又会导致钠的分配被中断，因此，文章作者得出结论可将Na磁共振作为体内药物浓度监测方法来估计肿瘤的泰索帝化疗疗效。不过，文章作者也认为，所述体内组织监测方法"增大了对肿瘤特征预报精确度的怀疑"。
发明内容本发明提供一种在细胞基础上同时测定输送至病变组织的两种或两种以上药物的量的方法。该方法产生针对特定患者的报告，该报告用于在个体化基础上选择将要输送至作用地点的最佳药物和剂量。特别地，本发明公开了一种用于确定个体化治疗方案的方法，包括(a)给测试对象服用测试混合物(cocktail)，其中，所述测试混合物包括两种或两种以上的不同治疗药物，这些药物的剂量为预计治疗剂量的二分之一以下；(b)获取有关病变组织的研究用活组织检查标本；以及(c)针对每种给药的治疗药物及其代谢产物来分析所述活组织检查标本。优选地，所述测试混合物的剂量为示踪剂量，其中一种示踪剂量低于治疗剂量的10%。优选地，所述分析步骤用加速器质谱(AMS)手段进行。优选地，所述方法还包括进行混合物给药后暂停约10分钟2小时，以便让测试混合物进行组织分配。优选地，所述活组织标本为选自离体肿瘤组织、血液、血液馏出物(fractionatedblood)、分离出来的感染了病菌的组织、以及它们的组合物的一块组织。特别地，所述方法还包括按照组成标本的细胞类型，对所述活组织检查标本进行分馏。更优选地，当所述活组织检查标本为血液时，该血液标本被分馏为白细胞型和红细胞型。图1为描述癌症个体化治疗的一般工作流程的流程图；图2为高效液相色谱法分离环磷酰胺和紫杉醇的谱图；图3展示了一个个体化治疗模型，该模型可测定三名患者A、B和C服用测试混合物后，乳腺肿瘤活组织中的环磷酰胺和紫杉醇的含量；图4展示了如下方案利用高效液相色谱法、以一分钟的时间间隔产生各独立馏分，然后用加速器质谱(AMS)对每一馏分进行示踪量化，以在三名患者A、B和C服用测试混合物后，产生环磷酰胺和紫杉醇在乳腺肿瘤活组织中的分布数据；图5展示了对小鼠进行口服和静脉注射给药后、分布到组织5中的CVT337的量，其中，来自每一治疗组中的三只小鼠的标本被汇集和测量，用于通过加速器质谱测量14c的总放射性强度；图6展示了对小鼠进行静脉注射给药后24小时内组织中的CVT337含量，其中，来自每一治疗组中的三只小鼠的标本被汇集和测量，用于通过加速器质谱测量14c的总放射性强度；图7展示了用药后最初8天(上图)和200天(下图)时健康人体内红细胞中的"C-叶酸浓度，其中，"C-叶酸出现之前的3天延迟表示14C_叶酸溶入处在成熟过程中的骨髓的细胞中所需要的时间，误差棒表示AMS所测三份"C测量值的士l标准差；图8展示了在健康人体口服14C_叶酸后1小时时采集的血桨标本的HPLC-AMS色谱图，其中，在292nm处监测吸收(实线)，且用AMS测量14C浓度并表达为moderns值(虚线)，24分钟处的大峰来自加入到标本中、以保护标本免于氧化的抗坏血酸，参考标准量的叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸(5MTFA)在抽出血桨之前注入到血桨中，用于检查回收率和标记FA与5MTFA的停留时间；图9为描绘示踪剂的吸收和排出的简单模型；图IO展示了人体内叶酸分布的多室模型，该图示意性地展示了叶酸代谢过程中的主要代谢库，在实线所示的所有代谢库中测量示踪剂的含量，虚线所示的组织代谢库是唯一一个不用测量"C-叶酸浓度的代谢库，房室模型(compartmentalmodel)使得可用不同方法来测定组织代谢库中示踪剂的分布；图11展示了人体内叶酸动力学房室模型，其中，各个房室标号1至U11，传输系数表示为k(接收房室，供应房室)；图12展示了用不同萃取剂从组织匀浆中提取的5-FU(5-氟脲嘧啶)和PAC(紫杉醇)的回收率，该实验在实施例3中有描述；图13为展示小鼠组织匀浆提取物中5-FU和PAC的分离的色谱图，其中，UV谱线中的5-FU和PAC峰表示在分离之前渗入实验标本中的无标识参考标准量，以标记被示踪的5-FU和PAC的保留时间，所述5-FU和PAC和剂量浓度下不产生UV信号；每隔一分钟采集各馏分，再用AMS进一步分析与5-FU和PAC对应的馏分，以进行14C的量化；图14展示了接受5-FU、PAC或既含5_FU又含PAC的混合物2小时后，小鼠体内的HT-29人结肠癌细胞株和正常肺组织的肿瘤异种移植物、血浆内的总放射示踪信号；图15展示了小鼠通过静脉注射接受了5-FU或PAC或二者的混合物2小时后，在肿瘤、正常肺组织和血浆中5-FU和PAC的含量；图16展示了用5-FU或PAC处理后，肿瘤和肺组织提取物中5-FU和PAC的色谱分离和测量，其中，在添加小于1.ODPM的5-FU或不添加的情形下，对组织提取物进行色谱分离，该图对PAC进行了规格化处理。具体实施方式下面对使用的一些术语进行说明测试对象(TestSubject):患者、自愿接受研究的人、或者动物模型。测试混合物(TestCocktail):施加给测试对象的两种或两种以上化学药剂的合6剂。所述化学药剂可以混合在一起、并通过口服、静脉注射或其它方式同时给药；选择性地，每种化学药剂可用不同的给药方式给药；选择性地，每种化学药剂可在不同的时间给药。示踪剂量(TracerDose):施加给测试对象的低于治疗剂量的剂量，该剂量为痕量级，以降低化学暴露危害。靶组织(TargetTissue):要研究其药物吸收情况的器官、组织或细胞团。配送时间(DistributionTime):进行测试混合物给药和采集耙组织之间的时间。检测系统(DetectionSystem):用于评估耙组织中的每种示踪剂的量级的分析方法和仪器。测试报告(TestR印ort):对测试过程结果的总结。方法比较本发明提供了一种测试混合物，该测试混合物包括两种或两种以上的不同治疗剂，这些治疗剂的剂量为预计治疗剂量的二分之一以下。这种低剂量称为"示踪剂量"。示踪剂的放射性强度一般不大于约100nCi(毫微居里)。本发明还采用了几种不同的检测技术，包括AMS、质谱(MS)和用于分离的、与质谱联用的液相色谱(LC)。下表列出了现有技术方法与本发明方法的对比。状况方案目的调控化学剂量大小14C同位素检测方法现有技术微剂量研究探索性新药研究(E-IND)化学剂量<lOOuglOOnCiAMS现有技术治疗剂量研究新药研究(IND)化学剂量40-200mglOOnCiAMS本发明胃禾中g胃种以上药物为示踪剂量-研究-诊断-E-IND-用于体外诊断使用的上市前批准通常，每种药物的化学剂量均<10mg总共lOOnCiAMSLC/MS-MSPET以下过程采用示踪剂量的两种治疗剂(该两种治疗剂混合在一测试混合物中、并被施加给一测试对象)，以量化输送至肿瘤或正常组织中的每种治疗剂。这种微创操作程序与高灵敏度的分析方法和仪器相结合，提供用于选择最优治疗药物和最优个体化治疗剂量的个体化信息。特别地，本实施例提供乳腺癌的个体化治疗操作程序。评估两种化疗药物即环磷酰胺和紫杉醇向恶性乳腺组织的输送。环磷酰胺属于烷基化剂类药物，可减缓或停止体内癌细胞的生长。治疗时间的长短取决于身体对药物的反应以及癌症的类型。紫杉醇广泛用作治疗恶性肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌和肺癌的化疗药物。当要用穿剌活检术处理测试对象时，进行上述操作程序。穿剌活检术通常用于获取组织标本，以进行良性和恶性情形的病理判断。大约80%接受穿剌活检术的测试对象被7判断为具有良性情形。这种操作程序建立了很高的安全边际，特别是对于那80%后来查明是良性情形的测试对象而言。治疗剂量的化疗药物可能对所有测试对象均有毒。为了将对所有测试对象的危害降到最低，采用一种测试混合物，该测试混合物基本由示踪剂量的环磷酰胺和紫杉醇组成。在本实施例中，所述测试混合物中每种药物的量为相应治疗剂量的千分之一。在穿剌活检过程中检测示踪剂量的环磷酰胺和紫杉醇需要高灵敏度的分析方法和仪器。加速器质谱(AMS)是用于检测示踪剂量的、被示踪剂如放射性同位素(如140标记的化合物的非常灵敏的方法。由于AMS极端灵敏，故只需用极其少量的14C同位素来标记环磷酰胺和紫杉醇。这使得测试混合物对测试对象造成的辐射危害相当于环境中已存在的自然水平的辐射危害在一年中累积的量。此外，测试混合物与靶组织中极低的14c同位素示踪剂含量排除了特殊处理程序或预防措施的采用，使得本发明的操作程序与标准的伦理、环境、医学和实验室习惯做法相兼容。因此在本实施例中，AMS是一种理想的检测系统。下表概括了前述的方案设计。测试对象体重60kg、身高5英尺6英寸的女性示踪剂量w环磷酰胺2.4mg紫杉醇0.292mg耙组织乳腺肿瘤活组织测试混合物单用静脉注射；灌注10分钟配送时间3小时检测系统加速器质谱(AMS)14c同位素示踪剂放射性强度分别为50nCi的环磷酰胺和紫杉醇，或者总放射性强度为100nCi的环磷酰胺和紫杉醇测试报告施用的药物或其代谢产物在靶组织中所占的百分含量耙组织中药物或其代谢产物的量/mg*环磷酰胺的治疗剂量为2，400mg，紫杉醇的治疗剂量为292.25mg。环磷酰胺环磷酰胺是烷基化剂类药物，其可减缓或停止体内癌细胞的生长。治疗时间的长短取决于身体对药物的反应，以及癌症的类型。这种药物可通过口服药片或者静脉注射方式服用。为了发生作用，环磷酰胺首先被肝脏转化为两种化学物质即丙烯醛和磷酰胺。丙烯醛和磷酰胺为活性化合物，它们可通过干扰癌细胞内脱氧核糖核酸(DNA)的活动来减缓癌细胞的生长。因此，环磷酰胺为细胞毒素类药物。不幸的是，正常细胞也会受到影响，这会导致严重的副作用。环磷酰胺还会抑制免疫系统，因此也是免疫抑制类药物。用于成年人和儿童的治疗的首次剂量为4050mg/kg，在35天内分几次注射到人体内。通常口服剂量为每天l5mg/kg。根据肿瘤对治疗的反应和副作用来调节后续维持剂量。用于体重60kg的测试对象的静脉注射制剂包含40mg/kgX60kg=2，400mg的环磷酰胺。环磷酰胺主要在肝脏内通过微粒体混合功能氧化酶系统转化为活性烷基化代谢产物。这些代谢产物可干扰容易迅速增殖的恶性细胞的生长。口服给药后，环磷酰胺可被很好地吸收，生物利用度大于75%。原形药物(unchangeddrug)的消除半衰期为312个小时。所服药物主要消除为代谢产物，但用药剂量的525%以原形药物形式被排泄到尿中。在尿和血浆中已识别出若干种细胞毒性和非细胞毒性代谢产物。静脉注射药物后23小时，血浆中代谢产物浓度达到最大值。原形药物的血浆蛋白结合率很低，但一些代谢产物的结合率大于60%。没有证据表明任何一种代谢产物起到了环磷酰胺的治疗作用或毒副作用。虽然已在肾功能衰竭患者体内观察到了升高的代谢产物含量，但没有在这类患者体内观察到临床毒性的增强。纖酉先転踪齐l慮i愤分子式C7H15N2C1202P分子量261.085g/mol、给药方法单用静脉注射给药测试对象体重60kg的个人用药剂量0.04mg/kg示踪剂量:0.04mg/kgX60kg=2.4mg14C同位素的放射性强度50nCi比放射性强度(Specificactivity)摩尔当量(2.4mg环磷酰胺)X(lmmol/261.085mg)=0.009192,1=9.192umol14C同位素示踪剂的放射性强度50nCi比放射性强度为50nCi/9.192umol=5.43nCi/umol原料美国密苏里州圣路易斯的AmericanRadiolabeledChemicals公司出品的环磷酰胺，其放射性强度10yCi，分子量261.085，比放射性强度50-lOOmCi/mmol被稀释至紫杉醇紫杉醇广泛用作治疗多种恶性肿瘤包括乳腺癌、卵巢癌和肺癌的化疗药物。紫杉醇是一种天然存在的脂溶性药物，最初是从太平洋紫杉树即"短叶红豆杉"(Taxusbrevifolia)中提取出来的。该药物可干扰微管功能、并导致平滑肌细胞在最初和有丝分裂Gl期后的阻滞，从而在不诱导细胞凋亡或死亡的前提下，抑制这些细胞的增殖。对于淋巴结阳性乳腺癌的辅助治疗，推荐的用药方案是以175mg/m2的剂量静脉注射紫杉醇3小时以上，每3周l个疗程，共4个疗程。对体重60kg的测试对象的静脉注射制剂含有175mg/m2X1.67m2=292.25mg紫杉醇。紫杉醇在注射之前必须稀释，建议将其浓度稀释至0.31.2mg/mL。在室温(大约25°C)和室内光照条件下，紫杉醇溶液最多可保持物理和化学稳定27小时。低匕柳玩踪齐l慮i愤本方案中的示踪剂量是指给体重60kg、身高5英尺6英寸的测试对象静脉注射的剂量。用莫斯代勒公式(Mostellerformula)计算出的用于定量给药的体表面积为1.67m2。分子式C47H51N014分子量853.906g/mol<formula>formulaseeoriginaldocumentpage10</formula>给药方法单用静脉注射给药测试对象体表面积1.67m2、体重60kg的个人用药剂量0.175mg/m2示踪剂量:0.175mg/maX1.67m2=0.292mg14C同位素的放射性强度50nCi比放射性强度摩尔当量(0.292mg紫杉醇)X(lmmol/853.906mg)=0.000342,1=0.342umol14C同位素示踪剂的放射性强度50nCi比放射性强度为50nCi/0.342umol=146.lnCi/翻l原料美国密苏里州圣路易斯的AmericanRadiolabeledChemicals公司出品的紫杉醇(商品名"Taxol"，英文名"2-benzoylring-14C(U)")，其放射性强度为10yCi，分子量853.9，比放射性强度50-100mCi/mmol被稀释至0.lmCi/ml。本实施例中的靶组织为在恶性肿瘤的初步诊断过程中采集的乳腺组织。一旦乳房X光检查发现异常后推荐进行乳腺活组织检查，测试对象将接受代替外科手术的微创手术，这种微创手术被称为穿剌活检。活检过程需要几分钟，不需缝线。进行乳腺活组织检查时，先取出一个乳腺组织标本，然后病理学家在显微镜下观察该组织标本，以确定是否存在恶性肿瘤。目前存在几种乳腺活检方法，对于某一患者而言最合适的活检方法由多种因素决定，这些因素包括乳腺异常的大小、位置、外观和特性。这些方法可提供足够量的靶组织，用于供病理学家作进一步的病例分析和进行示踪剂量的量化。在本方案中，获得耙组织，进行核芯针穿剌活检。核芯针穿剌活检为经皮穿剌(percutaneousprocedure)，其包括用空心的"核芯"针取出小块的乳腺组织标本。获得足够的组织标本需要3到6次针剌。通常，每次针剌可取出长度约0.75英寸(约2.0厘米)、直径约0.0625英寸(约O.16厘米)的标本。每次针剌所取出的标本的体积约为0.04cm3、质量约为40mg;这40mg靶组织可供5项独立的分析测试使用。将1次针剌所采集到的标本放入液氮中速冻、并保持冷冻直到下一次分析。把采集到的其余标本送入病理实验室，以确定乳腺肿瘤是癌症(恶性肿瘤)还是非癌症(良性肿瘤)。单次针剌所获得的标本体积=2.0XJi(0.16/2)2=0.04cm3单次针剌所获得的标本重量=约40mg靶组织40mg靶组织=至少5次独立的分析测试对每种示踪剂及其在靶组织内的活性代谢产物的检测过程分两个步骤(1)用高效液相色谱(HPLC)将示踪剂和代谢产物分离为不同馏分，(2)用加速器质谱(AMS)测定每一馏分中"C同位素示踪剂的量。当需要极度灵敏的测试方法时，加速器质谱(AMS)是一种选择。在本例中，用具有attomole(原子摩尔，lattomole等于10—18mol)灵敏度的AMS来量化靶组织内被放射标记的示踪剂的量。AMS利用测试对象体内极低的辐射(<100毫微居里)来追踪低剂量的化合物。取得合适的标本后，吸收、代谢、分配、结合、以及消除等均可以精确计量。(1)用HPLC讲行分馏紫杉醇在人血浆内的主要代谢产物为6a-羟基紫杉醇；3'p-羟基紫杉醇；6a，3'p-二羟基紫杉醇；7-表紫杉醇。环磷酰胺在人血浆内的主要代谢产物为4-羟基磷酰胺(OH-CP)和甲酰乙基磷酰胺(CEPM)。在人尿内还发现了一些不同的代谢产物环磷酰胺、N-二氯磷酰胺(DCL-CP)、4-酮环磷酰胺(4KetoCP)、以及羧基环磷酰胺(CarboxyCP)。个体化的方案允许紫杉醇和环磷酰胺的母体和/或代谢产物的分离。参见下述用于分离紫杉醇和环磷酰胺的母体化合物的例子(参考文献J.Pharm.Biomed.Anal.1;39(1-2):170-6,2005)。操作过禾呈a)从冰柜中取出靶组织，让其解冻。从靶组织中分出重量为20-30mg的一部分，并记录其湿重。将该部分靶组织与牛血清白蛋白(BSA，40g/L)水溶液混合，制成质量体积比(w/v)浓度为20%的匀浆。b)用乙酸乙酯(lmL)萃取匀浆(0.lmL);c)利用由乙腈-去离子水组成的梯度方案(gradientprotocol)、用ODS柱(十八烷基硅烷柱)和高效液相色谱(HPLC)分离各馏分(参见文献J.Pharm.Biomed.Anal.S印1;39(1-2):170-6,2005)。d)采集各独立馏分，并用AMS进行进一步分析。(2)用加谏器质谱(AMS)讲行柃测l加速器质谱(AMS)非常灵敏，是用于检测非常微小的标本中的含量极低的放射性碳("C)的基本工具。在20ul人血浆或5mg组织中自然存在的14C含量约为105X10—18摩尔(即105attomole)"C，这表示每小时14C进行1次以下衰减。14C的自然含量用其它仪器检测不到，但如果用AMS仪器检测的话，不到1分钟就能很容易地以优于1%的精度实现量化。即使14C的含量更低，AMS也能异常灵敏和精确地予以量化。AMS对14C的量限(limitofquantification,L0Q)是20u1人血桨或5mg组织中<200z印tomole(z印tomole艮卩10—21mol)(参见:BioTechniques38:S25-S29)。AMS是一种串联同位素比质谱仪，其中，对低能(数万电子伏)的负原子离子和小分子离子束进行质谱分析，分辨率为lamu(例如，质量为14)。接着这些离子被吸入具有非常高的正电位(0.5-10兆伏)的气体或固体箔碰撞室。通过所述箔或气体时，所述原子或分子离子被撞击而解离出两个或两个以上的电子，自身变为带正电。然后这些正离子加速离开所述正电位处、移向第二质谱分析器，该处被选为富电荷状态(解离电压为7mV时电荷为4+)。在碰撞室中失去4个或更多电子(使离子变为3价正离子)将破坏所有的分子，只除了能量非常高(20-100MeV)的原子核，这些原子核可通过其几种性质与检测器的交感作用、个别且唯一地予以识别。AMS识别原子核的"窍门"是通过分子离解除去分子的同量异位素，并通过离子识别来辨别核同量异位素。在AMS的这两项基本特性之外，针对每种元素的唯一专门方法也已被开发出来。在这种情形下，在离子源中将"N从"C中分离出来，因为氮不能形成负离子。AMS的灵敏性和专用性使其能够对施加到测试对象的耙组织的14C标记化学药物的示踪剂剂量进行药代动力学和分布状态研究。任何超过已知剂量的"C同位素剂量和可测量的初始剂量均构成示踪剂及其代谢产物的剂量。AMS的灵敏度大大降低了化学剂暴露量，使其低于治疗水平100-1000倍，并使"C同位素示踪剂暴露量小于100nCi量级。操作过程a)将每一HPLC馏分放入单独的石英管中。加入lmg作为碳载体的库存三丁酸甘油酯，用于高效石墨化。将石英管放入离心分离机中，在真空下干燥石英管内的内容物。用标准计算方法纠正通过所述碳载体传入的信号。所有标本个别燃烧成C02，而C02在合适的催化剂如铁的作用下变成石墨(参见Anal.Chem.75，2192-2196，2003)。b)对石墨进行AMS测量(参见:Nucl.Inst進.MethodsB40/41.705-708，1989;和Nucl.Instrum.MethodsB40/41.727-730，1989)。c)对照组——在施加测试混合物之前采集血浆标本，以确保测试对象不具有高于自然含量的14C同位素示踪剂。用放射性强度是1950年碳的14C放射性强度的1.508倍的蔗糖(ANUsucrose)作为分析标准。测试报告分析AMS测试的解析结果，作出测试报告，在报告中，根据测得的靶组织中的量，排列测试混合物中每种化学药物的配送。该测试报告可以做成几种不同的形式。MC示踪同位素计算AMS可直接测定HPLC馏分中的"C,C比率。该14C/12C比率被称为FM值(FractionModern,馏分现代值)。该FM值被用于计算每一HPLC馏分中的14C同位素示踪剂含量。下面是用于计算方案中用到的示踪剂剂量的一系列计算过程。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>0121]14CHPLCVattomol=0122](FM)X(97.9"C/attomol)X(C载体/mg+Chplc馏分/mg)-(14C载体/attomol)C总/mg0123]歩骤2-由于HPLC流动相由真空离心过程中析出的所有挥发性成分组成，因此HPLC馏分基本无碳。所以，C,^/mg被视为零，而上述方程式简化为0124]14CHPLCW。[，(FM)X(97.914C/attomolX(C载体/mg)-(14C载体/attomol)0125」C总/mg0126]^Ml-常用的碳载体为三丁酸甘油酯(80uL，20mg/mL)。作为载体加入的碳的总质〖为0.9536mg。FM值等于O.1014c0127]0128]0129]0130]0131]0132]0133]0134]0135]0136]0137]C载体/attomol=(0.1014)X(97,914C/attomoDX(0.9536C载体/mg)C载体/mg4〇载体=9.466attomole，即三丁酸甘油酯载体中含有9.466原子摩尔的^。歩骤4-在本例中，加入了碳载体的HPLC馏分的FM值为0.2345，那么14Ghplc溜分/attomol=(0.2345)x(97.9"C/attomol)x(0,9536C载体/mg)-(9.46614C载体/attomol)C载体/mg"C肌c馏分二12.426attomole，即HPLC馏分中含有12.426attomole的MCC歩骤5-将以attomole为单位的"C含量转化为fCi14CcfCi140^馏分=(12.426attomole14C)X(6.llfCi)=(97.9attomole)fCiCjjpLc馏分二0-"7"755fCi—C歩骤6(a)-如果该HPLC馏分含有环磷酰胺，则利用施加的MC-环磷酰胺示踪剂的比放射性强度来计算所述HPLC馏分中14C-环磷酰胺的]0138]"C-环磷酰胺/pmo卜(0.7755fCi14C)x(1nCi)xaumol)x(106pmol)」(106fCi)(5.43nCi)(1umol)01恥]14C-环磷酰胺/pmo1=0.1428咖。1MC-环磷酰胺0141]HPLC馏分中的"C-环磷酰胺所占的百分比/%=13「，HPLC馏分中含有的0.1428pmol"C-环磷酰胺所施加的药剂中含有的9.192umol14C-环磷酰胺HPLC馏分中的14C_环磷酰胺所占的百分比/%=0.00000155%歩骤6(b)-如果所述HPLC馏分中含有紫杉醇，那么利用所施加的14c-紫杉醇示踪剂的比放射性强度来计算HPLC馏分中所含14C-紫杉醇的]"C-紫杉醇/pmo1(0.7755fCi14C)x(1nCi)x(1umol)x(109fmol)(106fCi)(146.1nCi)(1誦1)14C_紫杉醇/pmol=5.308fmolMC_紫杉醇[OH8]HPLC馏分中的MC-紫杉醇所占的百分比/%-「0149lHPLC馏分中含有的5.308finol"C-紫杉醇所施加的药物中含有的0.342umol"C-紫杉醇HPLC馏分中的14C-紫杉醇所占的百分比/%=0.00000155%上述计算过程可应用于通过HPLC采集到的所有馏分。用母体分子的比放射性强度来计算每种馏分中存在的代谢产物的量。为简便起见，使用术语"相当于"(equivalent)来表示，母体分子的比放射性强度被用于计算代谢产物的量。紫杉醇环磷酰胺相当于6a-羟基紫杉醇相当于4-羟基磷酰胺甲酰乙基磷酰胺相当于3'p-羟基紫杉醇相当于甲酰乙基磷酰胺药代动力学和化疗药物的代谢产物中存在大量的个体变异。个体在被施加固定剂量的紫杉醇后，其血浆可能获得不同的紫杉醇浓度。据文献"J.Clin.Oncol.15:317-29，1997"记载，被施加固定剂量的紫杉醇后，浓度-时间曲线(AUC)下方的紫杉醇面积有45倍的差异。靶组织引导的化疗药物选择和建立在个体化基础上的剂量优化有助于获得理想的治疗效果。上述过程使得人们可以针对不同的个体来确定治疗剂的配送。例如，提供施加到靶组织的两种化疗药物——环磷酰胺和紫杉醇——的数据。共同加入在测试混合物中的环磷酰胺和紫杉醇示踪剂的定量分配可用于预测这些通常有毒的药物向乳腺肿瘤的配送。由于个体之间的极大变异性，这种预测通常难以做出。但是，分配测量提高了预测的精确度，从而可以预测每种化疗药物的药效。药物代谢的改变对于癌症患者而言特别重要，因为这些患者通常受到多种药物的治疗和/或可能由于药物毒性或肝转移而患有肝病。在这些情形下，一些代谢酶可能向上或向下调节。此外，有几个因素可以影响药物代谢结果，所述因素包括，例如，遗传因素、疾病状态、年龄、饮食、生理状态。实施例1本实施例阐释了通过加速器质谱(AMS)对分配到小鼠多个组织内的"C-CPT377的测量、量化。在过去的十年中，对II型糖尿病及糖尿病并发症的诊断已在全球范围内上升至流行病的程度。据估计，目前世界上有超过1.5亿人患有II型糖尿病，其特点是周边组织中的胰岛素抵抗、高血糖、胰腺B细胞功能障碍。虽然目前有一些市售的治疗剂，但大多具有严重的副作用，或者对受到其治疗的患者没有疗效。此外，随着疾病的进展，需要更多的干预治疗和补充胰岛素治疗。因此，人们仍在继续做出相当大的努力，以开发具有新的作用机制的治疗药物，希望减少这种使人衰弱的疾病的发生、发展和并发症。其中一种办法是通过直接以胰岛素信号途径为靶点、更特别地是通过蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)，获得有效的胰岛素增敏剂。PTP1B是一种泛表达、非受体酶，其在体内负性调节胰岛素和瘦素信号。剔除了？118。118-/-)的小鼠是健康的，并表现出胰岛素敏感性上升、糖耐量增加的特点，还有，当被喂以高脂肪饮食时，具有抵抗体重增加的特性。此外，对PTP1B的组织特异性衰减的研究揭示了这种酶在某些胰岛素敏感性组织中所起的作用。因此，这种验证良好的靶标的小分子可逆的竞争性抑制剂将可对II型糖尿病产生积极治疗效果。人们发现，选自一系列特别用于抑制PTP1B的化学药物的早期高效领导分子，在治疗糖尿病和肥胖(C57B1/6Job/ob)的小鼠模型时很有效。每天一次口服这种化合物(CPT377)，35天之后发现，日常血糖水平降低，并在标准的葡萄糖耐量试验中产生了积极影响。传统的药代动力学分析表明，当血清半衰期为1.5小时时，分子的口服生物利用度很低(<6%)。基于已公开的PTP1B在周边胰岛素敏感性组织中所起的作用，计划用AMS来研究是否这种化合物的积极疗效是由于该化合物在特定组织内的停留时间引起的。这一信息将有助于确定组织接触和疗效之间的潜在关联。因此进行了一个实验，实验中，通过口服或静脉注射的方式施加由少量示踪剂标记的14C-CPT377(小分子)。比放射性强度为0.12mCi/mmo1，贮存条件为28°C，口服剂量为20mg/kg，静脉注射剂量为4mg/kg，采用38只雄性CD-1品系小鼠(白化瑞士种小鼠，美国加利福尼亚州霍利斯特查尔斯河实验室)，每只小鼠重约20g。动物们被个别安置在室温下、相对湿度为50±20%的室中，至少有10个室中的空气每小时都发生变化，给小鼠喂以实验室啮齿动物饲料，并不限量喂水。光照周期为昼夜交替，12小时光明、12小时黑暗，动物们的首次适应时间为4天。通过心脏穿剌采血，总采血量约为lmL。通过离心分离法使血浆和红细胞分离，离心分离时，在4°C以大约2800RPM的转速旋转15分钟。取出血浆并储藏在Fisher牌带螺纹玻璃小瓶中。通过手术从各个不同器官处切下组织标本，并记录其湿重，放入浓度20mM、pH值7.4的磷酸二氢钾(KH2P04)溶液中制成质量/体积比(w/v)为20%的匀浆。标本中的总碳浓度的测量通过以下步骤进行将每个标本(75-100iiL)置于单独的Costech锡囊(美国加州文图拉生产)中、放入液氮中冰冻，然后花一夜时间冻干；接着将每个锡囊放入第二锡囊内，巻成一个球，用Carlo-Erba碳分析仪分析总碳浓度(参见Pella，Am.Lab.22:116_25，1990)。计算过程基于小数点后保留四位的标本重量进行。组织标本质量(ug)碳浓度(%)血桨l2.146563.75血桨22.236794.10血桨32.341213.31血桨48.133134.80血桨58.227245.72血桨68.331696.60血桨711.146674.23血桨811.226105.21血桨911.341964.79血桨1014.146644.42血桨1114.356173.87血桨1217.150133.32血桨1317.254034.02血桨1417.338864.27血浆中的平均碳浓度/%4.46脑髓l42.129725.13脑髓242.369753.11脑髓中的平均碳浓度/%4.12肝脏l48.152933.0516组织标本质量(ug)碳浓度(%)肝脏248.270292.74肝脏中的平均碳浓度/%2.90脂肪l80.146540.76脂肪280.233240.98脂肪中的平均碳浓度/%0.87肌肉189.151062.32肌肉289.248212.88肌肉389.363662.74肌肉中的平均碳浓度/%2.65将大约20uL组织匀浆放入单独的石英管中，并使之石墨化(参见Anal.Chem.75:2192-2196,2003)。在这个过程中，所有标本燃烧成0)2、然后C02在合适的催化剂比如铁的作用下变成石墨。放射性碳标木=FM值x97.9amo访文射性碳:碳标本、标本mg碳AMS测量方法如前所述(参见Davis，Nucl.Instrum.Methods.B40/41.705-708，1989and;Proctor，Nucl.Instrum.Methods.B40/41.727-730，1989)。从一只小鼠中采集初始剂量的血浆和尿，以确保动物不具有超过自然水平的"C浓度。另外再采集6个标本用于"C对照测量。用放射性强度是1950年碳的14C放射性强度的1.508倍的蔗糖(ANUsucrose)作为分析标准。施药时间为T。。随后的时间点，以分钟为单位，称为"施药后？分钟"。14C的计算被"modern"为精度3%、计算至小数点后4位的数值。"modern"值可以理解为量度14C/12C比率的值。利用不同标本类型中的总碳(12C)参考数、根据所述modern值，计算"C浓度。确定了"C浓度后，就可以利用所施加的药物的比放射性强度计算出"C标记的药物的浓度。血浆，尿，胆汁fmol"C标记的药物/uL组织fmol"C标记的药物/g组织13.56dpm6.11fCi97.9amol放射性碳1modern=~^-=-^-=--g碳mg碳mg嫉lmol14C=14g14CfCi"C标记的药物二lfmol"C标记的药物g14C=lg"C标记的药物通过静脉注射给药的药物在25分钟内就被快速地从血浆中清除掉，95%以上在给药的3小时内被清除。口服给药时，Cmax达到约1.52小时。口服和静注给药的Cmax值相差有约100倍。在脑髓中很少或不进行口服或静注(即静脉注射)给药。对心脏组织进行静注给药时，浓度在给药25分钟后快速下降，并在约6小时后恢复到接近基线。口服给药时，可在25分钟内看到非常快的浓度下降和回到基线过程。静注和口服两种路线之间的最大浓度差在心脏中不太明显。在肝脏/肾脏/睾丸/骨中，(静注给药)观察到的最大信号出现在给药后5分钟时，25分钟内药物浓度快速下降，给药后6小时药物浓度回到基线。口服给药时，浓度快速下降并在6小时内恢复到靠近基线的水平。对肌肉进行静注给药时，观察结果显示，最大信号出现在给药后5分钟时，且药物浓度的下降速度比注射到其它组织时要慢。给药后6小时，药物浓度回到基线。口服给药时的浓度下降速度也比其它组织慢，并在给药后6小时，药物浓度回到基线。应当注意的是，在这种情况下，静注和口服给药的药物浓度之间很少或没有差别。在脂肪组织中，静注给药的最大信号出现在给药后5分钟时，药物浓度在25分钟内快速下降，并在给药后6小时回到基线。类似地，口服给药时，浓度在6小时内快速降落和恢复到靠近基线。在一系列有效且性能优异PTP1B抑制剂中，化合物CPT377是一种早期的先导化合物。该化合物在患有糖尿病的ob/ob肥胖小鼠体内表现出一致的口服疗效。对使用CPT377的传统大鼠药代动力学研究结果表明，这种化合物的药代动力学表现不佳，生物利用度很低(<6%)。为了进一步理解CPT377疗效和生物利用度之间不相关，以及为了确定是否所述化合物(CPT377)在胰岛素敏感性组织中有足够的停留时间以提供疗效，必须要有一种超灵敏的分析方法，以分析所述化合物在低水平时的分布情况。可以在大大节省成本和时间的条件下、容易地用"C标记CPT377，并将被标记的该化合物通过口服或静注方式向小鼠给药，标本在24小时内的不同时间点采集。来自AMS研究的组织分布情况和生物利用度测定情况为寻找替代化学修饰提供了需要的信息，进行所述替代化学修饰为为了受益于药效、避免快速消除，以及寻找感兴趣的特定靶组织。这项研究是利用AMS作为超灵敏检测工具来量化药物动力学和药物在小动物体内的分布。AMS分析方法不需要再进行另外的其它方法，包括用于特定化学结构的色谱或质谱优化法。这使得AMS更适合用于药物开发的早期阶段，此时分析资源或方法可能不易获得，或者早期临床前特征可帮助人们在一系列相似化合物中选择最合适的候选者。这样，基于AMS的方案使得人们可在最低的生物分析投入和巨大灵敏性前提下，于新药开发之前估计该新药的药代动力学和ADME特征。实施例2本实施例展示了对"C标记的叶酸在血红细胞中的分布的量化，以及更特别地，展18示了只通过口服方式对人体对象进行给药后，对血红细胞中"C标记叶酸的分布进行量化和建立房室模型。质谱的最新进展和稳定同位素标记化合物的可获得性为人们进行营养成分的动力学追踪、理解营养成分在人体内的新陈代谢提供了有力的工具。由于标本制备和分析过程中的原因，这些研究所产生的数据质量在很大程度上受到限制。加速器质谱(AMS)提供了一种研究示踪动力学的替代方法，该方法通过测量人体标本内浓度为原子摩尔级的14c标记物来进行。叶酸在许多疾病的病因中扮演着重要角色。这种关系包括发生在疾病发生过程的不同阶段的多器官病理情况(参见Wadsworth，CanadianJournalOfPublicHealth-RevueCanadienneDeSantePublique88:304-304,1997)。这为研究人员确定许多这些病症的机制增加了难度。叶酸之体内平衡和新陈代谢的协调过程中包括许多生物过程。叶酸的平衡也极大地受到环境因素如饮食射入的影响。决定于基因水平(基因型)的生物调控，和环境因素之间的相互作用，产生了生物体的可观察到的状态(表型)。动力学模型可以确定生物体的代谢表型。接着可以确定那些对观察到的表型有影响的基因和/或环境因素。这将有助于确定与叶酸有关的疾病的病因和制定合理的治疗方法。目前还没有开发出可靠的、建立叶酸在人类生理条件下的动力学模型的方法。在这项研究中，加速器质谱的极端灵敏性使得人们首次可以建立叶酸在健康成年男性体内的动力学模型。这一工具(AMS)将可被科学家用作生物医学研究工具，还可被临床医生用作诊断工具。虽然加速器质谱(AMS)在过去早已用于环境、地质和考古学研究中，但仅仅只到最近才被应用到生物医学领域。动物和人类毒理学研究有了新进展，研究了大分子和毒物之间的相互作用(参见Creek，Carcinogenesis18:2421-2427,1997;Kautiainen，Chemico-BiologicalInteractions106:109-121，1997;Turteltaub，MutationResearch-FundamentalandMolecularMechanismsOfMutagenesis376:243-252，1997;White,Chemico-Biologicallnteractions106，149-160，1997)。最近的一项研究表明，摄入40nCi"C标记的三油酸甘油酯后，人类呼气中的"C02为飞摩尔(femtomole)量级(参见Stenstrom，Appl.Radiat.Isot.Apr.;47(4):417-22,1996)。我们没有发现具有符合要求的采样密度和测量精度的生物医学AMS研究。这些实验方案建立在目前了解的叶酸人体动力学基础上。有计划地设定重要参数例如剂量水平和取样时间表，以帮助对数据进行数学建模。本项研究中用至IJ的材料包括L-谷氨酸-"C(U)(250mCi/mmol，MoravekBiochemicals公司生产)，叶酸，5-甲基四氢叶酸和标准亚叶酸(Sigma公司生产)，乙腈和去离子水(Fisher公司的0PTIMA级)。蝶酰谷氨酸(叶酸)_14C(U)根据文献"Plante，MethodsinEnzymology66，533—5，1980"和"Clifford，Adv.Exp.Med.Biol.445:239-51，1998"中记载的方法合成(后一文献对前一文献中的方法作了一些修正)。通过HPLC进行反相分离后，用紫外_可见光谱测量浓度。用闪烁计数法测定放射能，算得的比放射性强度为1.24mCi/mmol。由于用无标记谷氨酸进行稀释，因此最终产品的比放射性强度低于14c标记的谷氨酸的比放射性强度。将14C-叶酸给药给体重85kg的健康男性志愿者，给药方式为早晨给志愿者口服50mL含有35yg14C_叶酸(80nmol，比放射性强度为1.24mCi/mmol)的水，然后让志愿者吃少量早餐。用大约lOOmL水冲洗容器中残留的药物，并让志愿者咽下。所有程序均经加州大学戴维斯分校和劳伦斯利弗莫尔国家实验室的伦理审查委员会批准。AMS测量所需的少量标本使得可在研究的最初24小时内进行频繁的血液采样。给药后间隔10分钟时采集8mL血，用于确定叶酸吸收和分布的早期动力学进程。1小时后，采样频率降至20分钟间隔；3小时后，降至30分钟间隔。在最初24小时内共采集24个标本。在接下来的200天里，继续隔周至隔月进行24mL的血液采样。血红细胞的分离通过采集整体血液进行，采集方式为在口服给药之前采集、给药之后第一周用导管采集、第一周之后通过静脉穿剌采集。采集了整体血液之后1小时内，用离心分离法使血红细胞从整体血液中分离出来，离心机以3，500RPM的转速运转5分钟。然后取出血浆，丢弃血块黄层，用大约等体积的等渗缓冲液(150mM的氯化钠，lOmM的磷酸钾，pH7.2，0.05mM的EDTA，2X的抗坏血酸)将红细胞冲洗4次。将血浆和红细胞贮藏在_20°C条件下，以用于AMS、叶酸和碳测量。标本中的总碳浓度的测量通过以下步骤进行将每个标本(75-100iiL)置于单独的Costech锡囊(美国加州文图拉生产)中、放入液氮中冰冻，然后花一夜时间冻干；接着将每个锡囊放入第二锡囊内，巻成一个球，用Carlo-Erba碳分析仪分析总碳浓度(Pella，1990)。计算过程基于小数点后保留四位的标本重量进行。血液中的碳浓度、尿和粪内的碳流失，证明对象处于稳定状态。用修改方案测量每个标本中的碳浓度，所述修改方案简化了分析之前标本的采集和包装。结果展示在下表3中，表中数据证明，在超过200天的研究期间内，一直维持着碳的体内平衡。表3.在超过200天的期间内采集的标本中的碳浓度标本平均值±标准差血浆(n=59)4.42±0.14g/dL血红细胞(n=59)0.60±0.04g/g血红蛋白尿(n=63)9.68±1.9g/day粪(n=39)9.09±1.5g/dayAMS测量过程如前文所述(参考文献Davis，Nucl.Instrum.MethodsB40/41:705-708，1989;以及Proctor，Nucl.Instrum.MethodsB40/41:727-730，1989)。简单地说，通过用5keV的Cs+离子轰击石墨标本的冷的镀铯表面来产生碳离子束。由Cs+离子束轰击所述标本而产生的C—离子束被加速、聚焦和质量分析，分析质量为14和13amu(amu即atomicmassunit，原子质量单位)的离子束。当这些离子束通过质量分析仪时，它们的能量连续改变，使这些离子束被加速到很高的能量，这使它们可沿正确的轨道进入1.5SDH-1Pelletron加速器。能量改变程控装置被调节到每秒约改变10次，以使约千分之一的质量数为13的离子束、以及99.9%的质量数为14的离子束进入加速器，进入时，保持平均加速和很低的离子束负载电流，且高能离子直接或间接引起的X射线也非常弱。负离子束到达氩气压力相对较高的区域时的能量为约500keV，剥离通道(strippercanal)位于1.5SDH-1Pelletron加速器的高压端子中。当通过所述剥离通道时，快速移动的负离子失去电子、主要变成C+离子。对于AMS测试过程来说关键的一点是，分子负离子如CH—andCH2—在氩气作用下化学键断裂、形成C"+和H+离子。这消除了后来计算系统中的"C+离子数量时、分子离子可能造成的干扰。1价正离子从所述高压端子向地面加速，获得另外的0.5MeV能量，总能量变为约1MeV。接着，所述离子在分析磁体作用下发生偏转，并聚焦于9(T处，从而使得"C+离子流与"C+离子流分离、并在法拉第笼中被测量。接着，所述14C+离子与位于所述端子内、由分子崩裂产生的少量12c+或13C+离子(在加速管内的恰当位置，这些12C+或13C+离子的价态已发生改变，这使它们的能量足够大到超过了要被输送到所述90。磁体周围的"C+离子的能量)进入90°球形静电分析器(ESA)，该ESA使速度更快的12C+和13C+离子偏离所述14C+离子束路径。所述ESA还提供最终聚焦，从而使14C+离子被送至固态探测器、在该探测器处被计数。随着已知和未知标本的溅射，通过记录13C流和14C数目，可以很高精度地确定标本中存在的14c的量。14C-叶酸药物的比放射性强度为1.24mCi/mmol。确切地说，用作药物的441.L合成制剂具有放射性强度222，000DPM(5.028DPM/yL)。这对应于放射性强度100nCi和叶酸80.6nmo1。这一量值(35.6yg)约相当于当前叶酸的RDA(推荐每日摄入量)值的六分之一。将所述叶酸药物与150mL水混合，在早晨7:12服下；10分钟后，提取第1个血液标本，其它标本的提取时间记录为服药后多少分钟提取，并用天数表达(服药后多少天)。服药前24小时采集尿标本，服药后6小时采集第一天的标本，然后隔24小时再采集一次。所有数值均表示为每次采集的终点数值。在服药前24小时采集服药前粪标本。记录每次采集的时间，记录的数值表示为该采集时间点的值。每个标本的modern值由加速器质谱测定3次、取平均值，用该平均值来计算"C-叶酸的浓度。用每一标本的modern值、碳浓度、以及药物的比放射性强度来计算每一标本中14C-叶酸的浓度。由于叶酸分子的同一性没有确定，因此这个数值(即"C-叶酸的浓度)用摩尔量表示，以消除由分子量不同导致的不同叶酸分子之间的不确定性。用同样的方式表达尿和粪中的"C-叶酸浓度。这些标本中包含叶酸的代谢产物，但由于1摩尔代谢产物正好由1摩尔"C-叶酸生成，因此浓度仍表示为14C-叶酸的摩尔数。用于计算14C-叶酸浓度的等式如下所示。lmol14C=14g14C1modern=13.56dpm6.11fCig碳m■g碳97.9amol放射性碳mg碳1.24fCi14C-叶酸=lfmol14C-叶酸6.2741X10—4g14C=lg14C-叶酸i十算举例血浆(PI)(1.4180moderns)-(l.0986moderns)=0.3194moderns(调整)(0.3194moderns)X(97.9amol14C/mgC)=31.2692amol14C/mgC(31.2692amol14C/mgC)X(44.38mgC/mL血桨)=l，387.7amol14C/mL血桨(387.7amol14C/mL血桨)X(14ag14C/amol14C)=19,428.2ag14C/mL血桨(19，428.2ag14C/mL)X(lag14C_叶酸/6.2741X10—4ag14C)=3.0965X107ag14C-叶酸/mL21(3.0965X107ag14C_叶酸/mL)X(lamol14C_叶酸/441.4ag14C_叶酸)红细胞中的"C-叶酸浓度用AMS测定，其数值表示为fmo114C_叶酸/g血红蛋白。这种表示方法通过将叶酸值除以血红蛋白质量来表示浓度，消除了用缓冲液冲洗之后细胞稀释产生的差异。最初8天和整个研究期间的数据分别表示在图7的上图和下图中。在最初24小时内采集的标本含有很少量的位于基线之上的14C。但给药36小时后，曲线回到基线处，并在接下来的时间里直到第3天末，保持低值。第4天后采集的标本中，红细胞内"C-叶酸的浓度快速上升，并在第19天达到最大值，即1650fmol14C_叶酸/g血红蛋白。利用对象的血红蛋白浓度和总血量参考值，估计出循环中的血红蛋白总量为6.6g(13.3g血红蛋白/dL，5L血液)。第19天时红细胞内的14C_叶酸总量约为10.9pmol14C-叶酸或者约为所服药丸的0.014%。这个数值相当于2.18fmol14C_叶酸/mL血液，大大高于AMS的最低检测限。图7展示了服药后最初8天(上图)禾口200天(下图)中，红细胞内"C-叶酸的浓度。14C-叶酸出现之前的3天延迟代表14C-叶酸结合到成熟过程中的骨髓内的细胞中所需要的时间。误差棒代表用AMS测得的3个值之间的±1个标准差。用C18型固相萃取管和叶酸结合蛋白亲和色谱从血浆中提取叶酸。用反相HPLC对提取的叶酸分子进行分离纯化，检测波长292nm。从100yL血浆中提取的叶酸不能产生可探测信号，因为该内源性叶酸浓度低于最低检测限。在提取之前将标准叶酸加入血浆中作为内部标准，以检查回收率，并标记HPLC条件下叶酸的停留时间。加入标准的叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸(5MTFA)，这是因为血桨中的叶酸形式为5MTFA，而所给药物中的叶酸形式为FA。标准叶酸、提取缓冲液和HPLC溶剂都过一遍AMS，以确保再无"C污染。馏分在每一分钟收集、冻干，并在AMS检测之前加入碳载体。图8展示了服用14C-叶酸1小时后采集的血浆标本的HPLC-AMS色谱图。在292nm处监测吸收(实现)，用AMS测量"C浓度、并用modern值表示(虚线)。图中大的早期峰是由加入到标本中起防氧化作用的抗坏血酸引起的。在提取之前将标准叶酸(FA)和5-甲基四氢叶酸(5MTFA)加入血浆中，以检查回收率，并标记叶酸的停留时间。房室模型通过将身体分成离散的房室，确定身体房室之间的传输速率。这些房室可能或不能代表具有生物联系的实际器官。图9简单、示意性地描绘了所述房室模型。最简单的模型由单个身体房室组成，该房室具有示踪剂输入口和排泄物输出口。施加的示踪剂的量是必须知道的。但是示踪剂的生物利用度使实际上早已进入所述身体房室的示踪剂量的测量变得复杂。图9展示了一个描绘示踪剂的摄入和损失的简单模型。这个问题在传统上是这样解决的静脉注射第二示踪剂，以测定生物利用度并作相应的调整。而本发明的研究中，示踪剂的生物利用度可直接测量，因此不必进行所述调整。示踪剂一旦被吸收，就会分布到各个不同的组织中，最终从身体内排泄出来、存在于尿和粪中。如果所述示踪剂可以通过肺排出，那么呼气也包括在排泄途径之内，必须同时收集呼出的气体。对于某些化合物而言，皮肤也是一种排泄途径。在本发明的研究中，认为尿和粪是叶酸排出身体的主要途径(参见Krumdieck，AmericanJournalofClinicalNutrition31:88—93,1978)。22血液是人体内容易访问的房室。全部血液被频繁地采样并分离为血浆和血红细胞，该血浆和血红细胞各自代表分离的房室。红细胞代表可以容易地采样的组织房室(tissuecompartment)。模型的主要组成部分如图10所示，该模型用于说明人体内的叶酸分配；这个图IO示意性地描绘了与叶酸代谢过程有关的主要房室。在用实线绘成的各房室中，测量示踪剂的量。而用虚线绘成的组织房室是唯一一个其14c-叶酸浓度没有被测量的房室。房室模型使得分配到这个房室内的示踪剂的量可通过简单比较差异来确定。被测量的房室用实线表示，而不可测量的组织房室用虚线表示。确定了模型的主要组成部分后，再添加相关的生物学组成部分；这些部分是基于人体和动物体内叶酸代谢的现有知识添加的。例如，肠内的14c-叶酸在进入血浆之前必须通过肠细胞，因此在模型中加入肠房室。已知骨髓中的成熟红细胞在进入血液循环之前，已与叶酸结合(参见Bills，Blood79:2273-80，1992)。代表骨髓的房室被加入模型中，同时加入的还有延迟元素，该延迟元素提供实验中观察到的、必要的延迟(参见Strumia，MedicalTimes96:1113-24,1968)。由于红细胞叶酸动力学受细胞在循环中的寿命支配，因此加入延迟元素，以用于这一生物学过程。物料通过胃肠道的24小时传输时间也使将延迟元素加入到模型中成为必要。房室模型作了一些关于房室之间的示踪剂通量的假设。最初，所述模型假定所有通量均由一阶过程控制，数学表达式为flux(2，1)=k(2，1)*ql，其中1是供应房室，2是接收房室，k(2，1)是两个房室之间的传输系数，ql是示踪剂浓度。因此，所述通量flux(2，1)随房室l内示踪剂浓度的变化而变化。在大多数情形下，假定通量受一阶过程控制是恰当的，但上述方程也可改变以满足系统需要。模型建立中的另一个假设是示踪剂与被研究的内源性药物的行为相平行。用同位素标记叶酸使得示踪剂与内源性叶酸区别开来。这一假设认为生物学过程，如吸收、蛋白结合及酶法转化为代谢产物，不受同位素标记的影响。在本发明的研究中，用"C标记叶酸可确保同位素影响最少或没有。在前面的营养动力学模型中，用标记和未标记营养物的比率推出示踪剂的比放射性强度。然后用该强度值建立各不同房室之间的营养动力学模型，因为比放射性强度是衡量房室内示踪剂浓度的一把标尺。本发明中，在14c-叶酸动力学表现为普通叶酸动力学这一假设的基础上，单用14c-叶酸浓度来建立房室模型。由于模型将身体各部分当做房室，利用循环中的血浆量和血红蛋白总克数的参考值，将血浆和红细胞中的浓度数据转化为每一房室内的14c-叶酸总量。这些量值，以及排泄在尿和粪中的累积"C-叶酸量，均与模型中它们各自的房室相关联。用飞摩尔(fmol)为单位表示的所有"C-叶酸量值均被分配了0.025的部分标准差，以体现AMS测量的不确定性。每个标本的采集时间被转化为服用丸药后的小时数。在时间为0时，肠房室接收了一颗含有8.0Xl(ffmo1"C-叶酸的丸药。大肠房室接收经实验测量的、未被吸收的含9.39X106fmol"C-叶酸的丸药部分。从大肠到粪便的传输包含24小时的延迟元素。从骨髓到红细胞的传输包含100小时的延迟元素，而降解延迟为1小时。代表组织叶酸分配的房室由快、慢速周转房室组成。快速周转组织包含20小时的延迟元素。用SAAMII软件包(由华盛顿大学SAAM研究所开发)生成所述模型。图11所示的模型前几个基本模型的扩展版。总共含有80nmo114C_叶酸的药丸在时间为0时进入肠房室。实验测定表明，9.39nmo1的14C_叶酸损失到大肠房室中，表示这部分药丸没有被吸收。剩下的药丸进入小肠房室，这表示小肠细胞吸收叶酸、使其减少和甲基化并送入血桨中(参见-Whitehead,BritishJournalofHaematology13:679-86,1972)。血桨房室将叶酸分配到尿和大肠中排泄出去，也将叶酸送入组织中储存。代表组织存储的两个房室为快速周转组织房室和慢速周转组织房室。红细胞房室通过骨髓房室接收示踪剂，所述骨髓房室代表叶酸进入循环之前与成熟白细胞结合的过程(参见Bills，Blood79:2273-80，1992)。在最佳猜测基础上，给每个参数指定初始系数。同时用软件包中的算法解微分方程。所述算法通过每次迭代调整这些系数，以尽可能地减小在四个可获得数据的房室中、预测值与实验值之间的误差平方和。最终根据传输系数可以令人满意地预测实验测定值。我们早些时候的假设——即房室模型内的通量由一阶过程驱动——不能应用于示踪剂向红细胞和尿房室的传输。为简便起见，假设14c-叶酸以不连续的脉冲方式进入红细胞房室中。通过强制性地将24小时后从血浆到骨髓的传输系数k(9，3)设定为0，将这一假设结合到所述模型中。这使得14C_叶酸通过用于最初24小时的一阶过程进入骨髓房室。在这段时间内，传输系数0.030hr—1使得骨髓房室的14C-叶酸摄入量(该摄入量反映了红细胞房室的14c-叶酸流入通量)可以用实验测定。由于流出红细胞房室的通量由循环中红细胞的寿命决定，因此红细胞房室在房室模型中表现出特别的情况。一旦叶酸进入该红细胞房室，就会由于聚谷氨酸盐化(polyglutamation)而变得难以除去，直到这些红细胞本身被排除出循环(参见Rothenberg，Blood43:437-43，1974;Ward，J.Nutr.120:476-84，1990;Brown，Presentk丽ledgeinnutrition,6thedition,1990)。可为佐证的一点是红细胞房室内"C-叶酸的存在时间大约为IOO天，非常接近已知的红细胞寿命。通过调整流出红细胞房室的通量的传输系数，将这一过程结合到所述模型中。在2300小时时，该传输系数从4X10—5hr—1变为0.00072hr—、老的红细胞在巨噬细胞介导过程作用下被排除出循环，所述巨噬细胞吞噬老的红细胞并将其送入脾脏和肝脏中降解(参见Rosse，JournalofClinicalInvestigation45:749-57,1966)。降解房室，q10，代表这一介导过程。虽然这些细胞中的14C_叶酸能够再循环，但将它们排出到死端降解房室不会影响所述模型，因为红细胞房室中的14c-叶酸总量只占所服药丸中叶酸总量的0.014%。"C-叶酸通过尿排出的过程不是一阶过程。实验数据表明，在超过42天的期间内，示踪剂被连续排出到尿中。由于在最初24小时血浆中的14C-叶酸为高动态，进入尿房室中的通量不依赖于血浆浓度。"c-叶酸作为代谢产物或代谢副产物的排出由来自肾小球的选择性过程驱动。这包括逆浓度梯度浓縮"C-叶酸的活性传输机制(参见Das，Br.J.Haematol.19:203-21，1970;Henderson，J.Membr.Biol.101:247-58，1988;禾口Pristoupilova，FoliaHaematol.Int.Mag.Klin.Morphol.Blutforsch113:759-65，1986)。因此，使用一阶通量方程来描述"C-叶酸从血浆到尿的传输是不合理的。相反，可用描述14c-叶酸在尿中的累积排泄的线性回归模型来数学模拟14C-叶酸进入尿房室的通用表4所示的传输系数可以成功地预测各房室中的14C_叶酸含量。图11展示了人类志愿者体内的叶酸动力学房室模型。各房室从1到11编号，传输系数用k(接收房室，供应房室)表示。表4.从供应房室到接收房室的传输系数参数从到传输系数，hr-1k(S,l)肠大肠0扁2k(2'l)肠小肠3細k(3,2)小肠血浆0.094k(4,3)血浆快速组织2.300k(3,4)1快速组织血浆0.059k(5,3)血桨慢速组织l細k(3,5)慢速组织血浆0.0022k(9,3)血浆骨髓0細3k(10,9)1骨髓红细胞0.2104k(ll,10)'红细胞降解0細045k(6'3)血浆尿0.0266k(8,3)血浆大肠0細k(7，8)1大肠粪1.3001经延迟元素向接收房室传输2传输由药物的生物利用度决定324小时后强制设定为0458小时后强制设定为0~0.2152300小时后强制设定为0.000726用于描述向尿房室的传输的强制功能(见文中所述)_实施例3本实施例描述一种用于治疗癌症的药物——氟脲嘧啶(5FU)，它属于抗代谢类药物，是一种嘧啶类似物。5FU，已作为抗癌药使用了约40年，其起作用的途径有多种，但主要是作为胸苷酸合成酶抑制剂、干扰作为胸腺嘧啶合成的关键因素的酶的活动。5FU主要用于治疗大肠癌和胰腺癌，在这些领域已作为既定的化疗形式使用了几十年。作为一种嘧啶类似物，5FU在细胞内转化为不同的细胞毒性代谢产物，接着这些代谢产物结合到DNA和RNA中，最终通过抑制细胞的DNA合成能力而诱导细胞周期阻滞和凋亡。卡培他滨(Capecitabine)是一种前体药物，可在组织中转化为5FU，可以口服。紫杉醇(PAC)是一种有丝分裂抑制剂，用于癌症化疗。PAC目前用于治疗肺癌、卵25巢癌、乳腺癌、头颈部癌，以及晚期卡波西肉瘤(Kaposi'ssarcoma)。PAC通过干扰细胞分裂过程中的正常微管生长和破坏细胞以灵活方式利用其细胞骨架的能力来工作。特别地，PAC与微管蛋白的13亚基结合。虽然非癌细胞也会受到不利影响，但是由于癌细胞的分裂比非癌细胞快得多，因此癌细胞远较非癌细胞更易受PAC的影响。—些对人类固体肿瘤细胞株的体外研究已经证明PAC和5FU的积极和顺序依赖性的相互作用(参见Kanoetal.，Br.J.Cancer1996,74:704-710;Smorenburgetal.，Eur.J.Cancer2001，37:2310-2323;Johnsonetal.，AnticancerResearch2002,22:3197-3204)。只有当肿瘤细胞先接触PAC后接触抗代谢药物时，才能获得一种协同作用。相反地，同时接触两种药物或者先接触5FU会比单独使用PAC杀死的细胞少。PAC较大的分子量和化学结构可延迟腹膜清除、增加在腹腔内的暴露时间，因此可以用于治疗胃癌。此夕卜，PAC还可通过其不同于5FU的机制发挥细胞毒性作用，因此与5FU没有交叉耐药现象。在肿瘤细胞株中，PAC和5FU的结合表现出相加的细胞毒性，特别是连续接触时。最近以单独或结合的形式，推出了许多用于治疗实体肿瘤的新药。PAC是一种新开发的抗癌药，有望治疗胃癌，特别是治疗晚期和难治性腹膜转移。虽然许多临床试验检验了PAC的单独疗效，但大多数报告显示，治疗有效率只有大约25%，且没有生存优势。因此，一些团体已经开始进行临床试验、研究PAC与其它化疗药物的一些新的组合方案。Casci皿等人报告了其第一阶段的研究，即每周一次5FU加上每三周一次PAC，治疗用现有方案(5FU，醛氢叶酸，顺铂，表阿霉素)难以治疗的晚期胃癌患者。Bokemeyer等人进行了第二阶段的研究每周一次5FU/醛氢叶酸加上每三周一次PAC，对晚期胃癌的治疗有效率为32%。尽管前述研究提供了一些预示前景光明的证据，但也留下来一种需求，那就是需要进行更多的第一阶段研究，以调查每周一次PAC与别种化疗药物的其它组合方式的疗效。药理学数据表明，每周一次剂量在60到90mg/m2之间的PAC给药使血桨中的PAC水平在给药l小时后保持在0.01mmo1/1以上，至少保持24小时；且据观察，90mg/m2AUC(曲线下面积)给药的情形类似于105mg/m2给药满3小时后的情形。延长暴露于低浓度即O.Olmmol/1的PAC已显示出会诱导一些不同的细胞株凋亡。结果表明，PAC确实可以安全地逐步增高到每周90mg/m2，伴以5FU以固定剂量5天连续给药，在血液和肝的毒性限制下进一步扩大剂量。总之，这一方案被充分容忍长达8周，且毒性作用很温和。虽然在这一方案中，与5FU结合使用的PAC的最大耐受量(MTD)为每周90mg/m2，每4周给药3次，但是用于未来第二阶段试验的建议剂量水平更低。年龄为67周的雌性无胸腺裸小鼠从Taconic实验室获得(Germantown，NJ)。所述小鼠被笼养在微隔离箱中，自由地供应食物和水，在研究开始之前隔离4天。本研究中采用HT-29人结肠癌细胞株(美国典型培养物保藏中心，ATCC)。HT-29细胞分别保存在加有10X的胎牛血清的DMEM培养基和McCoy's5A培养基中。所有细胞的培养条件为37°C、95%空气/5%0)2、湿度100%。细胞每3天馈料一次，每周检查一次。当细胞汇合度达到80%时，用25X的胰岛素/EDTA溶液收集细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)将收集到的细胞冲洗一次，使细胞以1Xl(f个细胞/100iU的密度重新悬浮在PBS中。将lOOiU细胞悬浮液皮下注射到每只小鼠的右侧腹部。将癌细胞植入动物体内后，每天观察其肿瘤的发展情况。当肿瘤达到约100咖3时，将小鼠等分为3组，静脉注射14C-PAC、14C_5-氟脲嘧啶，或者同时注射这两种物质。PAC溶解在50%的Cremopho1^EL(聚氧乙烯蓖麻油)、50%的无水乙醇溶液中，并用5%的葡萄糖稀释，制成静脉注射剂。氟脲嘧啶溶解在水中，并用5%的葡萄糖稀释，制成静脉注射剂。接受单种药物的动物给以5nCi的放射性标记，而接受一种以上药物的动物给以总共10nCi的放射性标记。给药剂量最高达5mg/(kg体重)，体积为单种药50微升，混合给药40微升。在给药0.5、2或4小时后杀死小鼠，立即取出其血桨和器官标本并冰冻储藏，直到传输至分析实验室。将组织放置在单独的一次性组织匀浆管(Fisher式)中，加水(2:lv/w)并搅拌2分钟，以形成匀浆。向匀浆中加入甲醇(甲醇体积/匀浆体积=3:l)，旋转30秒。接着将匀浆管放入离心分离机、以一次脱水容量2，000克分离IO分钟，取出上清液作进一步分析。颗粒保留起来用于进一步分析未被提取的放射性标记信号。用真空离心机将组织提取物(300uL)离心干燥约2小时，并使其悬浮于流动相A(25mM的磷酸铵，pH6.08)中。将未标记的参考标准量的PAC和5FU加入溶液中，以标记紫外线追踪中PAC和5FU的停留时间。将50100uL的混合物注入Luna苯己基C18色谱柱(Phenomenex色谱柱)，粒径为5um，4.60mmX250mm。色谱系统由具有自动取样器的ShimadzuProminence高效液相色谱、紫外探测器和馏分收集器组成。梯度系统由流动相A(25mM的磷酸铵，pH6.08)和流动性B(100%乙腈)组成。该单元被编程为提供0%的流动相B03分钟，升至提供90X的流动相B19分钟，并保持90X的流动相B，直到色谱分析结束，此时流动速率为1.OmL/分钟。在整个色谱分析期间，以1分钟的间隔一个个地收集馏分。用加速器质谱(AMS)测量馏分中的放射性标记信号。图12展示了用不同萃取剂从组织匀浆中提取的5FU和PAC的回收率。用100%的甲醇，按照3体积甲醇溶剂对1体积组织匀浆的比率，可将游离(未结合)的5FU和PAC完全回收。图13展示了小鼠组织匀浆提取物中5FU和PAC的分离色谱图。图中的5FU和PAC峰表示未标记的参考标准物，该参考标准物在分离之前被注入实验标本中，以标示有放射性标记的5FU和PAC的停留时间，该有放射性标记的5FU和PAC在给药剂量浓度时不产生紫外信号。围绕5FU和PAC收集一分钟馏分(One-mi皿tefractions)，并进一步用AMS分析测定放射性标记信号。5FU周围的峰表示小鼠的内源性化合物，该内源性化合物未被放射性标记，不会干扰下步将要进行的AMS对5FU的测定过程。图14展示了在接受5FU、PAC或5FU与PAC的混合物给药后2小时时，小鼠的血浆、HT-29人结肠癌细胞株的移植肿瘤、和正常肺组织内的总放射性标记信号。接受5FU给药的小鼠的总血浆信号(DPM/mL血浆)比得上接受PAC的组。这是我们想要的结果，因为每一组接受5nCi的放射性剂量，确定血浆中PAC的半衰期为0.34小时，5FU的为0.250.30小时。当5FU和PAC混合起来联合给药时(放射性强度总共10nCi)，总血浆信号有近20倍的增长，这表明两种药物之间具有协同作用效果。其他研究人员也在一些特定细胞株中发现了这种附加效应(参见Kano，BritishJournalofCancer74(5):704-10,1996)并在临床试验中采用结合疗法，取得了PAC的改进的药理学效果(参见Kondo，JapaneseJournalofClinicalOncology,35(6)332-337，2005)。在本实施例中的小鼠肿瘤和正常肺细胞(总DPM/mL提取物)也表现出这种附加效应。在此情形下，当5FU和PAC混合起来联合用药时，总信号有约IO倍的增长。特别地，上述甲醇提取过程被设计为回收PAC和游离、未标记的5FU。结合到RNA和DNA中的5FU被回收到颗粒中，并分别测量。这些图中的结果始终如一地表明低的5FU信号表示5FU已几乎完全结合到RNA和DNA中。为了进一步描绘每种类型标本中的信号源，用高效液相色谱分离PAC和5FU，然后用加速器质谱进行测量。图15展示了小鼠接受5FU或PAC或二者的混合物静注给药后2小时时，其肿瘤、正常肺组织和血浆中的5FU和PAC的量。此外，对组织匀浆的甲醇提取物进行色谱分析，以获取游离、未结合的5FU的数据。最低检测限如图中虚线所示，该最低检测限是基于过程中添加到每个标本中的载体碳的背景信号计算而得的。PAC治疗组在肿瘤、肺和血桨中表现出与PAC(而不是5FU)相应的信号。5FU治疗组在肿瘤、肺和血桨中表现出与5FU(而不是PAC)相应的信号。如果在组织匀浆的甲醇提取物中没有检测到游离的5FU，则表示游离的5FU已基本完全结合到RNA和DNA中，对甲醇提取物进行离心过滤后，将结合有5FU的RNA和DNA回收到颗粒(pellet)中。在5FU治疗组动物中，对颗粒组分总放射性强度的测量结果是肿瘤为1.103DPM，肺组织为0.914DPM。将这个数据与PAC治疗组动物的甲醇提取组分中的肿瘤和肺组织各自的放射性强度0.468DPM和0.927DPM相比较。此夕卜，在认为5FU只能以游离态存在的血浆中，在接受了5FU给药或混合给药的小鼠的甲醇提取物中清楚地检测到了5FU。将组织匀浆分离成溶剂型上清液和颗粒使得我们不仅可以追踪分配到组织中的5FU，而且可以区别游离的5FU和DNA、RNA中结合的5FU。图16展示了用5FU或PAC治疗后、肿瘤和肺组织提取物中5FU和PAC的色谱分离和测量。按上文所述的过程对组织提取物进行色谱分离，添加了1.ODPM的5FU后，再分离一次。该图对PAC是标准的，添加5FU后，5FU信号显示了期待的上升，这进一步加强了本实施例中采用的稳定的色谱分析方法。权利要求用于确定个体化治疗的方法，包括(a)对测试对象进行测试混合物给药，其中所述测试混合物包括两种或两种以上的不同治疗药物，这些药物的剂量为预计治疗剂量的二分之一以下；(b)获取有关病变组织的活组织检查标本，用于研究；以及(c)针对每种给药的治疗药物及其代谢产物来分析所述活组织检查标本。2.根据权利要求1所述的用于确定个体化治疗的方法，其特征在于所述测试混合物的给药剂量为示踪剂量，其中一种示踪剂量为治疗剂量的10%以下。3.根据权利要求1所述的用于确定个体化治疗的方法，其特征在于用加速器质谱(AMS)仪来进行所述分析步骤。4.根据权利要求1所述的用于确定个体化治疗的方法，其特征在于，所述方法还包括进行测试混合物给药后，暂停约10分钟至2小时，以便所述测试混合物进行组织分配。5.根据权利要求1所述的用于确定个体化治疗的方法，其特征在于所述活组织检查标本是一块组织，该组织选自离体肿瘤组织、血液、血液馏出物、分离出来的感染了病菌的组织、以及它们的组合物。6.根据权利要求5所述的用于确定个体化治疗的方法，其特征在于所述活组织检查标本为血液，该血液标本被分馏为白细胞型和红细胞型。7.根据权利要求1所述的用于确定个体化治疗的方法，其特征在于所述方法还包括按照组成标本的细胞类型，对所述活组织检查标本进行分馏。全文摘要本发明公开了一种用于同时确定两种或两种以上化学(治疗)药物对病变组织的配送的方法。过程中产生患者特异性报告，该报告可用于在个体化基础上选择最佳化疗药物和剂量。文档编号C12Q1/02GK101702921SQ200780050039公开日2010年5月5日申请日期2007年11月17日优先权日2006年11月17日发明者格林·卡瓦萨琪,艾力·阿尔佐曼,迈克尔·钱斯勒申请人:阿斯尤姆生物科技有限公司