专利名称：：Hivnc蛋白表达载体以及用其生产nc蛋白的方法
技术领域：
：本发明涉及一种HIVNC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法。更具体而言，本发明涉及其中分别在NC基因的上游和下游依次连接有内含子序列和mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法。
背景技术：
：HIV(人免疫缺陷症病毒)的核壳蛋白(下文称为'NC，)不仅在病毒组装中起到结构性作用，且在病毒生命周期中也起着功能性作用，其作用如下文所述。首先，NC蛋白参与病毒的基因组包装，这种功能是归功于由特征性Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys基序(CCHC基序)组成的两个锌指结构域。已知所述结构域在所有的逆转录病毒中均表现高保守性，并且在HIVRNA包装和感染性病毒的生产中是必需的。其次，已经知道NC蛋白在病毒的逆转录(reversetranscription,RT)过程中会促进tRNA引物的退火和链转移，由此可见NC蛋白在病毒复制中发挥重要的功能。第三，NC蛋白具有病毒生命周期中所必需的核酸伴侣蛋白的活性。另外，最近还有报道称在病毒DNA插入宿主染色体中时NC蛋白也起到特定作用。因此，可以说对NC蛋白的研究对于阐明NC蛋白在HIV生命周期中的生物功能以及开发对核心的HIV蛋白有效的抗病毒制剂有着重要的意义。了解NC蛋白的体内生物学功能的必需前提条件是开发出在动物细胞中表达NC蛋白的有效方法。但是因病毒的密码子使用与动物细胞的密码子使用不同，或者由于所述病毒基因中的一些内包含抑制序列(INS),从而使HIV的其他结构蛋白在动物细胞中的表达受限。问题是即便NC蛋白与HIV的其他结构蛋白不同，不包含INS,它也很难在动物细胞中表达。因此，大部分对NC蛋白的研究都是通过利用在大肠杆菌(Em//)中表达的重组NC蛋白或通过利用基因分析来进行的。同时，也有一些实例是通过将稀有密码子替换为宿主的优选密码子(密码子优化)来增强异源表达水平。例如，已有报道指出将BPV(牛乳头状瘤病毒)的晚期基因L1和L2针对哺乳动物的密码子使用模式(CodonUsagePattern)进行密码子优化，导致与野生型HPV的那些序列的表达水平相比水平，它们在哺乳动物细胞(Cos-l)培养物中的表达水平增加(Zhouet.al./.Wra/73,4972-4982,1999)。在上述研究中，将与在哺乳动物中相比在BPV中的出现频率超过2倍的每个BPV密码子(使用率>2)以及使用率超过1.5的大部分密码子保守性地替换为优先使用的哺乳动物密码子。在W097/3115号、WO97/48370号及WO98/34640号PCT申请(Merck&Co.,Inc.)中，已经证明通过对HIV基因或者其片段的密码子优化增加了蛋白质表达，并且当将所述密码子优化序列在宿主哺乳动物中用作DNA疫苗时提高了免疫性，针对所述宿主哺乳动物对该优化进行了调整。本发明的发明人已经着眼于这些问题，并且努力开发一种用于生产能够解决这些问题的HIVNC蛋白的方法。但是已经发现仅通过密码子优化尚不能表达野生型NC蛋白，而通过分别在NC基因的上游和下游额外连接内含子序列和mRNA稳定性元件和^f吏用这种RNA优化可表达出野生型的NC蛋白，并可显著提高其表达效率，从而完成了本发明。
发明内容技术问题鉴于上述问题，本发明旨在于提供一种其中额外连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体以及一种用其生产NC蛋白的方法。技术方案为了达到上述目的，本发明提供一种其中额外连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体。此外，本发明提供用所述载体转化的转化体。此外，本发明提供利用所述载体生产HIVNC蛋白的方法。4有益效果本发明的其中依次连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体，可在动物细胞中表达野生型NC蛋白，并且与现有技术相比具有提高表达效率的作用。参照附图所举例说明的某些示例性实施方案详细地描述本发明的上述及其他特征，所述附图在下文中仅通过举例说明的方式给出，并且因此不是对本发明的限制，其中图1是示出了对HIVNC多核苷酸密码子优化前后的各密码子偏好的图2是示出了本发明的HIVNC蛋白表达载体pCMV(-HA)NC/RRE的制造过程的示意图3是示出了本发明HIVNC蛋白表达载体pCMV(-HA)/OptiNC的制造过程的示意图4是示出了本发明HIVNC蛋白表达栽体pCMV(-HA)OptiNC/RRE的制造过程的示意图5示出了蛋白质印迹的结果(A及C)以比较用本发明的HIVNC蛋白表达载体转化的细胞中NC蛋白的表达水平，以及示出了定量化的表达水平的数值的图(B和D);图6是蛋白质印迹的结果，其通过HIVNC蛋白表达载体中具有P-珠蛋白内含子的载体确定了NC蛋白表达水平。具体实施方式最佳模式下面参照实施例详细说明本发明。但是，这些实施例只是为了举例说明，并且并非意在通过这些实施例来限制本发明。实施例1OptiNC多核苷酸的合成为了增加HIV-1NC蛋白在哺乳动物细胞中的表达，可优化RNA的二级构造、GC含量及重复密码子。在本实施例中通过Upgene:AWeb國BasedDNACodonOptimizationAlgorhhm(WentaoGao，AlexisRzewski，HuijieSun，PaulD.RobbinsandAndreaGambotto)和GenScriptCorporation(www.genscript.con)的密码子频率表进行了NC密码子优化。首先，HIV-1NC的原始碱基序列是通过使用下表1所公开的Upgene和GenScript的密码子使用算法进行密码子优化的，并且将各个概率评分(probabilityscore)换算为Upgene的评分，这在下表2中示出。参照所述表1和表2，给出了4个经密码子优化的NC多核苷酸(Genscript01、Ge獄ript02、Genscript03、Upgene),其中选择了经密码子优化的NC多核苷酸序列GenScript01,并且在GenScript进行了合成。在所合成的密码子优化的NC多核苷酸(SEQ.IDNO.13)的5'末端和3'末端中额外插入H/m/in和限制性内切酶位点，以进行克隆。GenScript01、GenScript02和GenScript03分别由SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7表示，这些是通过使用GenScript的密码子使用算法进行密码子优化的NC多核苷酸，而通过使用Upgene的密码子使用算法进行密码子优化的NC多核苷酸则由SEQ.IDNO.5表示。表l评分频率氨基酸DNAUpgeneGenscriptALAGCT1718.6GCC5228.5GCA1416GCG177，6ARGCGT94.7CGC3910，9CGA76.3CGG1811.9AGA1011.5AGG1711.4ASNAAT2216.7AAC7819.5ASPGAT3222，3GAC6826CYSTGT319.9TGC6912，2GLjNCAA1211.8CAG8834.6GIjUGAA2429GAG7640.8GIjYGGT1010-8GGC5022.8GGA1216.3GGG2816.4HISCAT2210.4CAC7814.9工LEATT1815.77<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>KAAG828282CTGT31TGC6969FTTC808080NAAT22AAC7822CTGT31TGC6969GGGC505012KAAA18AAG8282EGAA24GAG7676GGGG28GGC5050HCAC7878781ATA6ATC7676AGCC5252get17KAAA18AAG8282NAAT22AAC7878CTGC696969RAGG17CGC39egg18AGCC525252PCCT19CCC4848RAGG17CGC39aga10KAAA18AAG8282KAAG828218GGGC505050CTGT31TGC6969WTGG100100100RAGA10CGC39aga10CTGT31TGC6969GGGA12GGC5050RAGG17CGC39aga1010<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>图1中示出上述合成的HIVNC多核苷酸(GenScripteOl)的密码子优化前(图1A)后(图IB)的各密码子偏好。图1示出了根据哺乳动物细胞中使用的密码子偏好，在野生型NC及密码子优化的NC序列中使用的密码子百分比。'实施例2HIVNC蛋白表达载体的构建2-1pCMV(-HA)NC/RRE载体的构建构建了其中依次连接有SV40SD/SA内含子序列、HIVNC基因及RRE的HIVNC蛋白表达载体。图2显示的是载体的构建过程。首先，为了扩增RRE，以pLPl载体(Invitrogen)为模板并且利用正向引物(5'-GCGCTCGAGAGGAGCTTTGTTCCTTGGG-3';SEQ.IDNO.1)和反向引物(5'-TAAGGTACCAGGAGCTGTTGATCCTTTA-3';SEQ.IDNO.2)进行了PCR。设计所述正向引物和反向引物以使其分别具有ATiol和K/ml限制性内切酶位点。将扩增的RRE用AT^I和进行处理。将用所述限制性内切酶处理的片段用已经用A%oI和J[/ml处理过的pCMV(-HA)NC栽体(韩国专利第0553154号)克隆，并将所得的产物命名为pCMV(-HA)NC/RRE。2-2pCMV(-HA)/OptiNC载体的构建构建了其中依次连接有SV40SD/SA内含子序列及密码子优化的HIVNC(OptimizedHIVNC)基因的HIVNC蛋白表达栽体。图3示出所述载体的构建过程。将在实施例1中合成的OptiNC基因(SEQ.IDNO.5)用五c0RI/H/m/in限制性内切酶处理，然后将用所述限制性内切酶处理的片段用已经用五"RI/^i'm/ni处理的pUC57载体(Genescript公司)克隆，并将所得的产物命名为pUC57/OptiNC。将所述pUC57/OptiNC和pcDNA4/TO(Invitrogen)用H/"^/III和五oRI消化之后连接，以获得pcDNA4/TO/OptiNC。将上述pcDNA4/TO/OptiNC用及/m/ni和iVwl处理，然后将所述经消化的DNA用克伦诺(Klenow)片段处理。将pCMV(-HA)载体(ClontechLaboratories,Inc.)用JFcoRI和iVWl处理，然后将所迷经消^匕的DNA用克伦诺(Klenow)片段处理。将上述经克伦诺(Klenow)片段处理的两个片段连接，并将所得的产物命名为pCMV(-HA)/OptiNC。2-3pCMV(-HA)OptiNC/RRE栽体的构建构建了其中依次连接有SV40SD/SA内含子序列、密码子优化的HIVNC基因及RRE的HIVNC蛋白表达载体。图4示出栽体的构建过程。首先，pLP/OptiNC载体通过下面的方法制备将pLPl栽体(Invitrogen)用尸附/IA4wIT/5印EI处理，并且剪切出GAG-POL基因。将上述实施例2-2中制造的pCMV(-HA)/OptiNC栽体用A>I/￡^RI处理以获得OptiNC基因。将上述pLPl栽体和获得的OptiNC基因用克伦诺片段处理以进行平头末端连接，并将所得的产物命名为pLPOptiNC/RRE载体。将所述获得的pLPOptiNC/RRE载体用A7miIASVic77处理以获得其中连接有OptiNC的基因片段，然后将所获得的片段用已经用X附fllASflci7处理的pCMV(-HA)/OptiNC载体克隆。将所得的产物命名为pCMV(-HA)OptiNC/RRE。2-4pCMV(-HA)/FLAGNC载体的构建pCMV(-HA)/FLAGNC载体通过如下方法制造将通过用限制性内切酶Bgll和Pstl处理pJCl(HIVNucleocapsidProtein;ExpressioninE.coli，Puri打cationandCharacterization.J.Biol.Chem.268，16519画16527，1993)获得的NC基因片段插入到经过BamHl和Pstl处理的pCMVTag2B载体(Stratagene，USA)中，从而制得pCMVFLAGNC载体。然后，将pCMV(-HA)载体与通过用限制性内切酶Sall、Klenow片段和Xhol依次处理pCMVFLAGNC栽体获得的FLAGNC基因片段连接起来，从而制得pCMV(-HA)FLAGNC载体。实施例3HIVNC蛋白的表达3-1细胞的转化在包含1%链霉素/青霉素和10%(v/v)牛胚血清(FBS)的DMEM(DulbeccomodifiedEagle'smedium)中培养293T细胞。在转化的前一天，将培养的细胞以1乂106个细胞/孔的密度接种在12孔板中，并且培养至约60-80%汇合。将在实施例2中制得的pCMV(國HA)NC/RRE、pCMV(-HA)/OpdNC和pCMV(-HA)OptiNC/RRE各取1將，并且分别与2jil的jetPEI制剂(Polyplus-transfectionInc.)混合，并且在室温下在200pl的无血清培养液反应了20分钟。之后，将装有要转化的细胞的孔分为3组，然后将细胞培养液用1ml的无血清培养液替换。将上述载体和jetPEI制剂的混合液添加到无血清培养液中的各细胞中，并且将其在二氧化碳细胞培养箱中继续培养4小时。继续培养后，将细胞培养液替换为含10%(v/v)FBS的DMEM培养液，然后继续培养2天。然后收集细胞。3-2用于确认NC蛋白表达的蛋白质印迹为确认NC蛋白在上述转化的细胞中的表达，进行了蛋白质印迹。首先，为了从所获得的细胞中提取蛋白质，将各细胞用裂解溶液(50mMTris誦HCL(pH7.4)、150mMNaCl、1mMEDTA、1%TyitonX國lOO、1%脱氧胆酸钠、1%SDS、蛋白酶抑制剂混合物)溶解，然后在15000rpm下离心20分钟。收集上清液，然后进行15。/。SDS-PAGE。然后，釆用抗NC单克隆抗体进行蛋白质印迹分析，并将表达水平用数值表示(图5)。结果，如图5中所示，在用包含mRNA稳定性元件的pCMV(-HA)NC/RRE栽体转化的细胞、用包含编码优化的NC蛋白的序列的pCMV(-HA)/OptiNC载体转化的细胞和用同时包含编码mRNA稳定性元件和优化的NC蛋白的序列的pCMV(-HA)OptiNC/RRE载体转化的细胞中，表达水平分别显示为116.28IOD、267.88IOD和557.66IOD,这表明与包含野生型NC基因的pCMV(-HA)NC相比，在含有密码子优化的NC基因的pCMV(-HA)OptiNC中，表达水平明显得到提高(图5C中的泳道2和泳道3)。由此可以看出当用密码子优化的NC多核苷酸替换野生型NC基因时可以高产量表达NC蛋白。此外，发现比起其中未在NC基因下游插入RRE序列的pCMV(-HA)NC,在包含mRNA稳定性元件的pCMV(-HA)OptiNC/RRE中，表达明显提高(图5C中的泳道2和泳道4)。由此可以看出RRE对NC蛋白的表达有影响，这说明通过在内含子序列下游连接OptiNC和RRE序列的组合可以提高NC蛋白的表达。另外，可以看出通过使用本发明的载体可表达野生型NC蛋白，所述载体与其中在NC多核苷酸上游进一步连接有FLAG基因的pCMV(-HA)FlagNC相似。实施例4利用pLPOptiNC/RRE载体生产NC蛋白为了确认在使用P-珠蛋白内含子序列而非SV4019smRNA内含子序列及经修饰的SV4016SmRNA内含子序列作为内含子序列的情况下，提高NC蛋白表达效率的作用，将上述实施例2-3中制造的pLPOptiNC/RRE载体按照与上述实施例3-1相同的方法转化293T细胞，然后培养。随后，为确认NC蛋白质的表达，按照与实施例3-2相同的方式进行了蛋白质印迹分析。结果，如图6所示，发现在使用p-珠蛋白内含子序列的情况下，可以表达野生型NC蛋白，并且NC蛋白的表达水平与其中在NC多核苷酸上游进一步连接有FLAG基因的pCMV(-HA)FlagNC相似(图6中的泳3和泳道5)。本发明的模式下面详细说明本发明。HIV核壳(NC)蛋白的生产对于开发有效的抗病毒制剂非常重要，但仍然难以在动物细胞内表达HIVNC蛋白。本发明的发明人已经进行了研究以改善这一问题，并且发现通过利用其中额外连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体可显著提高HIVNC蛋白的表达。由此，本发明提供了其中依次连接有内含子序列、HIVNC基因及mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达栽体。更具体而言，本发明提供了其中依次连接有a)选自SV4019smRNA内含子序列、经修饰的SV4016SmRNA内含子序列以及P-珠蛋白内含子序列的任一个序列，b)HIVNC基因，及c)mRNA稳定元件的HIVNC蛋白表达载体。术语"HIVNC蛋白"是指引起AIDS(获得性免疫功能丧失综合征)的HIV(人免疫缺陷型病毒)的核壳蛋白，上述蛋白质与病毒基因组RNA强烈结合以形成核糖核蛋白核心复合物。在本发明一个实施方案中所表达的HIVNC蛋白序列来源自ARVW/SF，并且祐乂>开为GenBankNo.P03349的第380~434位氨基酸序列。另外，在本发明的一个实施方案中使用的NC基因序列源自pJCl载体(HIVNucleocapsidProtein;Expressionin￡".co//，PurificationandCharacterization,/.5!》/.Ore附.268,16519-16527,1993)。本发明所使用的术语"表达"是指蛋白质或核酸在细胞中的生产。本发明所使用的术语"表达载体"是指能够在适当的宿主细胞中表达目标蛋白或目标RNA的载体，并且是指包含必需调节元件的基因构建体，基因插入物以可表达的方式与所述必需调节元件可操作地连接。在本发明的表达载体中，启动子(promoter)与其中依次连接有本发明的内含子序列、HIVNC基因及mRNA稳定性元件的结构基因可操作地连接以表达HIVNC蛋白。上述"启动子"是指在特定宿主细胞中，调节与其可操作地连接的核酸序列表达的DNA序列，并且可使用在所有时间段都能连续地诱导目标基因表达的组成型启动子，也可以使用在特定位置和时间诱导目标基因表达的诱导型启动子。本发明使用的术语"可操作地连接，，是指核酸表达调节序列与编码目标蛋白或RNA的核酸序列之间以可执行一般性功能的方式的功能性连接。例如，启动子可与编码蛋白或者RNA的核酸可操作地连接，并且可以影响所述编码核酸序列的表达。与重组载体的可操作地连接可通过本领域中所公知的基因重组技术来实现，位点-特异性DNA切现。，。，、，^本发明的载体的实例包括但不限于质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体和病毒载体。优选的表达载体可包括基因表达的调节元件，如启动子、操纵子、起始密码子、终止密码子、多腺苷化信号及增强子，并可根据不同目标制备各种载体。本发明中的栽体可优选地为图2或图4中所记栽的pCMV(-HA)NC/RRE载体或pCMV(-HA)OptiNC/RRE栽体。在本发明中，可以使用相关领域中已知的内含子序列，例如SV4019smRNA内含子序列、经修饰的SV4016SmRNA内含子序列及P-珠蛋白内含子序列。优选地使用由SEQ.IDNO.8所表示的SV4019smRNA内含子序列、SEQ.IDNO.9所表示的经修饰的SV4016smRNA内含子序列及SEQ.IDNO.10所表示的P-珠蛋白内含子序列。本发明的一个实施方案中所用的内含子序列源自pCMV-HA载体(ClontechLaboratories,Inc.)的内含子序列(SV40剪接供体/剪接受体；以下简称'SV40SD/SA，)。上述载体序列的第672~702位是16SV4019SmRNA内含子序列，上述载体序列的第672~768位是经修饰的SV4016SmRNA内含子序列。同时，可以使用编码HIVNC蛋白的任何HIVNC基因，只要它能够表达具有氨基酸序列SEQ.IDNO.4的HIVNC蛋白，并且可以是具有选自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任何核苷酸序列或野生型HIVNC基因。优选地，对本发明的HIVNC基因进行密码子优化以在哺乳动物细胞中高度表达。更具体而言，所述基因具有选自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任何核苷酸序列。本发明所使用的术语"密码子优化"是指用于转化各种宿主的核酸分子的编码区域或基因，并且还指改变所述核酸分子编码区域或基因内的密码子以反映所述宿主生物的典型密码子使用，同时不改变由该DNA编码的多肽。在本发明的上下文中，为了在哺乳动物细胞中达到最佳表达，利用表1和表2对基因及DNA编码区域进行密码子优化。密码子优化可合成全部(或部分)的DNA，以去除可能存在于所述转录的mRNA中的二级结构的任何去稳定序列或区域；也可以合成全部(或部分)的DNA，以将碱基组成(basecomposition)改变为所需宿主细胞中更优选的那些。在本发明中，使用Upgene:AWeb-BasedDNACodonOptimizationAlgorithm(WentaoGao，AlexisRzewski，HuijieS叫PaulD.RobbinsandAndreaGambotto)和GenscriptCorporation(www.genscrit.con)的密码子频率表优化NC密码子，籍此获得以SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7来表示的HIV-NC多核苷酸序列，所述HIV-NC多核苷酸序列经过密码子优化以在哺乳动物细胞中高度表达(参照实施例1)。本文中所使用的"mRNA稳定性元件，，是指结合在mRNA的3'末端以增加稳定性的稳定性元件，并且优选地可能是选自RRE(Rev反应元件)、WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)及P肌动蛋白3，UTR(非翻译区)及RSV稳定性元件(劳斯氏肉瘤病毒稳定性元件)的任一元件。上述mRNA稳定性元件中RRE是指Rev反应元件(RRE)。RRE是存在于HIV-1RNA的env基因内的顺式作用元件，并且与Rev蛋白17直接结合。WPRE是指源于土拨鼠肝炎病毒的转录后调控元件(PRE)，并且是指在转录后水平(post-transcriptionallevel)以顺式(cis)起作用和调节自细胞核到细胞质的外排以增加基因转录物在细胞质内蓄积的病毒序列。P肌动蛋白3，UTR及RSV稳定性元件都是调节自细胞核到细胞质的输送或者抑制分解以增加基因转录物在细胞质内蓄积的序列。在本发明的一个实施方案中，使用RRE碱基序列作为mRNA稳定性元件，上述RRE源自HIVHXB2林系并且以GenBankAccessionNo.K03455为人所知。在上述序列中，与RRE对应的第7769~8002位的序列表示为SEQ.IDNO.11。同时，使用源自土拨鼠肝炎病毒的WHV8林系的序列(JournalofVirologyApr.l999，p.2886-2892)作为WPRE，并且将上面所示的序列中，对应于WPRE的第1093~1684位的序列表示为SEQ.IDNO.12。此外，可使用下述文献中记载的序列作为P肌动蛋白3，UTR及RSV稳定元件性(The3'-endofthehumanbeta-actingeneenhancesactivityofthebeta-actinexpressionvectorsystem-constructionofimprovedvector"JournalofBiochemical&BiophysicalMethods.36(l):63誦72，1997:A3'UTRsequencestabilizesterminationcodonsintheunsplicedRNAofRoussarcomavirus.，RNA-APublicationoftheRNASociety"12(l):102-10,2006.)。另外，在本发明的一个实施方案中，构建了其中依次连接有SV40SD/SA内含子序列、HIVNC基因及RRE的HIVNC蛋白表达载体，并且确认NC蛋白在用所述载体转化的转化体中高度表达(参照实施例3-2)。本发明中使用的标准重组DNA及分子克隆技术是相关领域所广为人知的，并且在以下出版物中有记栽(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.andManiatis，T.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1989);bySilhavy,T.J.，Bennan，M丄.andEnquist,L.W"ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor，NY(1984);andbyAusubel，F.M.etal"CurrentProtocolsinMolecularBiology,publishedbyGreenePublishingAssoc.andWiley-Interscience(1987))。此外，本发明提供了一种用所述HIVNC蛋白表达栽体转化的细胞。HIVNC蛋白表达载体的转染可使用常规的转染方法来进行，例如DEAE-dextran介导的转染、磷酸钧转染、显微注射、含DNA的脂质体和lipofectamine-DNA复合体，这些方法在相关领域中是已知的。根据宿主细胞选择适合的标准技术(MolecularCloning,ColdSpringHarbor,NewYork,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))。对于用本发明中的栽体转化的细胞没有特别的规定，但优选COS-7、293T、HEK293T、CHO及HeLa细胞，并且更优选COS國7细胞和293T细胞。此外，本发明提供了一种用于生产HIVNC蛋白的方法，包括培养用所述载体转化的细胞的步骤。在本发明的一个实施方案中，使用本领域已知的方法培养了利用本发明的HIVNC蛋白表达栽体转化的293T细胞。结果确认了表达野生型HIVNC蛋白(实施例3-2)。转化体中表达的蛋白可通过各种常用方法来纯化，所述方法可以单独或组合使用，例如盐析(例如，硫酸铵沉淀、磷酸钠沉淀等)、溶剂沉淀(例如利用丙酮、乙醇等的蛋白质分级沉淀法)、透析、凝胶过滤、色谦法(如离子交换、反相色语)及超滤(Maniatisetal，MolecularCloning:ALaboratoryManual,CIodSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor，N.Y.(1982);Sambrooketal，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2dED.，ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989);Deutscher，M.，GuidetoProteinPurificationMethodsEnzymology，vol.l82.AcademicPress.Inc.，SanDiego，CA(1990))。本发明还提供了一种编码HIVNC蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸经过密码子优化以在哺乳动物细胞中高度表达。更具体地说，本发明的多核苷酸由选自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDN0.5、SEQ.IDNO.6及SEQ.IDNO.7的任一个碱基序列组成。工业实用性如上所述，其中在NC基因的下游中依次连接有内含子序列和mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体可在动物细胞中表达野生型NC蛋白，且与现有技术相比具有提高表达效率的作用。已经参照优选的实施方案详细地描述了本发明。然是，本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的原则和精神的情况下可以对这些实施方案进行改变，本发明的范围是在所附权利要求及其等效内容中限定的。权利要求1.一种HIVNC蛋白表达载体，其中在所述载体中依次连接有a)选自SV4019smRNA内含子序列、经修饰的SV4016smRNA内含子序列以及β-珠蛋白内含子序列的任一序列，b)编码SEQ.IDNO.4的HIVNC(核壳)蛋白的基因；及c)mRNA稳定性元件。2.根据权利要求1所述的HIVNC蛋白表达载体，其中所述SV4019smRNA内含子序列具有由SEQ.IDNO.8组成的核苷酸序列，所述经修饰的SV4016smRNA内含子序列具有由SEQ.IDNO.9组成的核苷酸序列，并且所述P-珠蛋白内含子序列具有由SEQ.IDNO.10组成的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的HIVNC蛋白表达载体，其中所述基因具有选自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任一核苷酸序列。4.根据权利要求1所述的HIVNC蛋白表达载体，其中所述mRNA稳定性元件为选自RRE(Rev反应元件)、WPRE(土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件)、p-肌动蛋白3，UTR(非翻译区)及RSV稳定性元件(劳斯氏肉瘤病毒稳定性元件)的任一元件。5.根据权利要求1所述的载体，其中所述HIVNC蛋白表达载体具有图2或图4所示的酶切图。6.—种利用权利要求l-5任一项中所述的载体转化的细胞。7.#据权利要求6所述的转化细胞，其中所述细胞是COS-7或者293T细胞。8.—种用于HIVNC蛋白的方法，包括培养权利要求6所述的转化细胞的步骤。9.一种用于在哺乳动物细胞中高度表达的经密码子优化的HIVNC多核苷酸，包括由选自SEQ.IDNO.3、SEQ.IDNO.5、SEQ.IDNO.6和SEQ.IDNO.7的任一核苷酸序列表示的核苷酸序列。全文摘要本发明涉及HIVNC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法。更具体而言，本发明涉及其中在NC基因下游依次连接有内含子序列和mRNA稳定性元件的HIVNC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法。本发明的HIVNC蛋白表达载体——其中在NC基因下游依次连接有内含子序列和mRNA稳定性元件——可以在动物细胞中表达野生型NC蛋白，且与现有技术相比具有提高表达效率的作用。文档编号C12N15/09GK101578369SQ200780049710公开日2009年11月11日申请日期2007年12月20日优先权日2006年12月20日发明者柳志昌申请人:柳志昌;艾维克西根有限公司