膀胱癌诊断和/或预后方法

专利名称：膀胱癌诊断和/或预后方法
技术领域：
本发明的应用领域在保健领域内，主要在"肿瘤泌尿科学"和"分子生物学"领域
内。本发明特别地旨在膀胱癌诊断和预后方法。
背景技术：
膀胱癌(bladder cancer)或膀胱癌(vesical cancer)是前列腺癌之后的第二普 遍的泌尿生殖道月中瘤[Jemal A， Thomas A， Murray T， Th皿M. Cancer statistics, 2002. CACancer J Clin 2002;52:23-47]。在全球范围内，其在所有由于癌症死亡的男性和女 性中分别占3%和1 % 。在绝对值方面，这意味着每年约95， 000名男性和约35， 000名女 性由于该病理而死亡。发病与死亡之间的比率根据各国发展程度而异。作为极端实例， 可提及的是在北美洲区域该比率可能接近0.2，而在撒哈拉以南的非洲地区其可能增加至 0. 6[Edwards BK，Brown ML，Wingo PA et al. Annual report to the nation on thestatus of cancer，1975—2002， featuring population—based trends in cancertreatment. J Natl Cancer Inst 2005;97 :1407-27 ;Pisani P，Parkin DM，Bray F，Ferlay J. Estimates of the worldwide mortality from 25 cancers in 1990. Int JCancer 1999 ;83 :18-29]。
与其他肿瘤不同，实际上暂时并未查明家族遗传素质因素。相反，已查明若干与膀 胱肿瘤强烈相关的环境因素。最重要的因素之一是吸烟，不仅由于其关系到疾病，而且由于 其在人群中的发生率。已观察到吸烟者具有比非吸烟者高三倍的患膀胱癌的风险。事实上， 三分之一的膀胱肿瘤与烟草消费有关。令人遗憾地，存在于烟草中的致癌剂仍没有被清楚 鉴别[Burch JD， Rohan TE，Howe GR et al. Risk of bladder cancer by sourceand type of tobacco exposure :a case—control study. Int J Cancer 1989 ;44 :622—28 ;Zeegers MP，Kellen E，Buntinx F，van den Brandt PA. The association betweensmoking，beverage consumption,diet and bladder cancer :a systematic literaturereview. World J Urol 2004 ;21 :392-401]。 在膀胱中能在细胞水平发现不同类型的病症。其中，存在良性变化如上皮细胞增 生、尿道上皮化生和Von Bru皿巢。相反，发育异常相当于在大致介于正常上皮和癌之间的 病症。最后，在膀胱中发现不同类型的尿道上皮癌，其可分为腺癌、鳞状肿瘤和过渡型细胞 癌(TCC)。 超过90X的膀胱肿瘤是TCC。在它们诊断时，大约75%为浅表性肿瘤，20%为 侵入肌肉层(浸润性或侵入性TCC)和5%为已经转移的。浅表性情况中，大约20%通 过单一的外科手术治愈，然而手术后50至70%复发一次或多次，但绝不变为浸润性肿 瘤。这些浅表性肿瘤的10至30%变为浸润性肿瘤。这些肿瘤是侵入性的预后差的肿瘤， 5年后的死亡率为50%，在转移的情况下，2年后的死亡率为100% [Sanchez-Carbayo M， SocciND， Charytonowicz E et al. Molecular profiling of bladder cancer using cDNAmicroarrays :defining histogenesis and biological phenotypes.Cancer Res2002 ;62 :6973-80 ;Adshead JM， Kessling AM， 0gden CW. Genetic initiation, progression and prognostic markers in transitional cell carcinoma of thebladder :a summary of the structural and transcriptional changes, and the role ofdevelopmental genes. Br J Urol 1998 ;82 :503-12 ;Babaian RJ， Johnson 0F， Llamas L， Ayala AG. Metastases from transitional cell carcinoma of urinarybladder. Urology 1980 ;16 :142-44]。 浅表性和侵入性TCC的遗传途径尽管有关，不过看来明显不同。浅表性肿瘤最常 见的发展似乎是增生、非典型性和最后低级别乳头状TCC。在侵入性肿瘤中，最常见这样 发展从非典型性到发育异常，然后转化为原位肿瘤(Tis)，最终至浸润性肿瘤[Knowles MA. What we could do now :molecular pathology of bladder cancer Mol Pathol 2001 ; 54 :215-21]。 目前的诊断系统基于尿细胞学(由尿中的鳞状上皮细胞)和通过膀胱镜直接观 察膀胱的组合。后者实际上是肿瘤的主要诊断和跟踪技术。其通过尿道进行，因此其对 于患者是侵入性的并相当令人厌烦。相信该技术的灵敏性和特异性相当高，尽管实际技术 中的改进(荧光膀胱镜检查法)表明可能并非如此而且浅表性肿瘤中观察到的部分复发 可归因于其不可见部分中的不完全切除[Jones JS. DNA-based molecular cytology for bladder cancersurveillance. Urology 2006 ;67 :35-45]。尿细胞学反之是对于高级别 肿瘤具有高灵敏性和特异性的非侵入性诊断技术。然而，该技术显示检测低级别肿瘤的 局限性[Bastacky S， Ibrahim S， Wilczynski SP， Murphy丽.The accuracy of urinary cytology in dailypractice. Cancer 1999;87:118-28]。而且，细胞学的解释高度依赖观 察者，因此它们可能是观察者间不同的，特别是在低级肿瘤方面。 所有这些局限已导致对更可靠的非侵入性膀胱癌标记物的研究。发现对膀胱 TCC具有高灵敏性和特异性的非侵入性标记物会非常有助于临床实践。事实上，若干研 究描述了尿中新的肿瘤标记物，如对膀胱肿瘤抗原醒P22[Wiener HG， Mian C， Haitel A， PychaA， Schatzl G， Marberger M. Can尿bound diagnostic tests replace cystoscopy inthe management of bladder cancer J Urol 1998 ;159 :1876—80 ;Soloway MS， Briggman V， Carpinito GA et al. Use of a new tumor marker, urinary NMP22, in thedetection of occult or rapidly recurring transitional cell carcinoma of the urinarytract foliowing surgical treatment. J Urol 1996 ;156 :363-67]、纤维蛋白降 角率产物[Schmetter BS，Habicht KK，Lamm DL et al.A multicenter trial evaluation of thefibrin/fibrinogen degradation products test for detection and monitoring of bladdercancer. J Urol 1997 ;158 :801-5，]、端粒酶[Takihana Y， Tsuchida T， Fukasawa M，Araki I，Tanabe N，Takeda M. Real—time quantitative analysis for humantelomerase reverse transcriptase mRNA and human telomerase RNA componentmRNA expressions as markers for clinicopathologic parameters in urinary bladdercancer. Int J Urol 2006 ;13 :401-8]的试验，基于荧光原位杂交的试验[Hailing KC， KingW， Sokolova IA et al.A comparison of BTA stat，hemoglobin dipstick,telomeraseand Vysis Uro Vysion assays for the detection of urothelial carcinoma carcinomain urine. J Urol 2002; 167 :2001-6]或流式细胞术[Takahashi C， Miyagawa I， K丽noS， 0shimura M. Detection of telomerase activity in prostate cancer by needlebiopsy. Eur Urol 1997 ;32 : 494—98 ;Trott PA，Edwards L. Comparison of bladderwashings and urine cytology in
6the diagnosis of bladder cancer. J Uroll973 ;110 :664-66]，但是尽管其中大多数具 有比尿细胞学更高的灵敏性，后者也仍然是最特异性的[Bassi P， De M， V， De Lisa A et al. Non_diagnostic tests tests for bladdercancer :a review of the literature. Urol Int 2005 ;75 :193-200]。 已知在尿道上皮肿瘤中发现许多变化很大的遗传性病症，因此目前的趋势是搜索 能表明癌存在于分析样品中的遗传性标记物(在DNA、RNA或蛋白质水平)。此外，能用同 样的标记物辨别患者肿瘤的侵入性是非常引人入胜的，因为这会提供更个性化和有效的治 疗。最后，一些该标记物可能是开发抗癌新药的治疗靶点。 直至最近，分析基因表达模式的能力限于每次试验少数几种基因。新技术例如DNA 芯片已完全改变该情形。现在可以在单次试验中分析数千基因[Duggan DJ， Bittner M， Chen Y，Meltzer P，Trent JM. Expression profiling using cDNA microarrays. NatGenet 1999 ;21 :10_14 ;Granjeaud S， Bertucci F， Jordan BR.Expression profiling :DNA arrays in many guises. Bioessays 1999;21:781-90]。因此，包括膀胱肿瘤的所有肿瘤 类型的大量表达结果已开始发表于文献中[Sanchez-Carbayo M，Socci ND，Charytonowicz Eet al. Molecular profiling of bladder cancer using cDNAmicroarrays :defining histogenesis and biological phenotypes. Cancer Res2002 ;62 :6973—80 ;Ramaswamy S， Tamayo P， Rifkin Ret al. Multiclass cancerdiagnosis using tumor gene expression signatures. Proc Natl Acad Sci USA2001. 98 :15149-54 ;Sanchez-Carbayo M， Socci ND， Lozano JJet al. Genediscovery in bladder cancer progression using cDNA microarrays. Am J Patho12003 ;163 :505_16 ;Sanchez—Carbayo M， Capodieci P， Cordon-Cardo C. Tumorsuppressor role of KiSS-l in bladder cancer :loss of KiSS-l expression isassociated with bladder cancer progression and clinical outcome. Am J Patho12003 ;162 :609-17 ;Dyrskjot L，Thykjaer T，Kruhoffer Met al. Identifying distinctclasses of bladder carcinoma using microarrays. Nat Genet 2003 ;33 : 90-96]，尽管大部分结果没有全部公开。尽管如此，迄今，用特定的膀胱癌标记物进行的 研究集中于一种或很少的几种基因[Olsburgh J， Harnden P， Weeks Ret al. Uroplakin geneexpression in normal human tissues and locally advanced bladder cancer. JPathol 2003 ;199 :41-49 ;Fichera E，Liang S，Xu Z，Guo N，Mineo R，Fujita-Yamaguchi Y. A quantitative reverse transcription and polymerase chain reactionassay for human IGF—II allows direct comparison of IGF—II mRNA levels incancerous breast,bladder, and prostate tissues. Growth Horm IGF Res2000 ;10 :61—70 ;Simoneau M， Aboulkassim T0， LaRue H， Rousseau F， Fradet Y. Four tumor suppressor loci on chromosome 9qin bladder cancer :e vidence fortwo novel candidate regions at 9q22. 3and 9q31. Oncogene 1999 ;18 :157-63]。 已知这些肿瘤的性质是非常异质的，看来用单一标记物鉴别所有或大多数癌是不 大可能的。因此为了表征大多数肿瘤，看来有必要组合几种最好的标记物至某些类型的程度。 此外，尽管尿道上皮组织的直接分析对于发展常规诊断方法是最舒服的选择对 象，如上所述，所述方法为非侵入性的也会是非常有益的，这是因为后者降低患者生活质量并代表高得多的保健经济负担。 看来与全部膀胱上皮接触并因此具有肿瘤块的膀胱液(bladder f luid)(尿或膀 胱洗液(bladder washing))是良好的用于检测肿瘤标记物的选择对象，因为它们代表获得 要分析样品的容易的非侵入性途径。因此，在搜索膀胱TCC的非侵入性诊断方法中，大量 工作已集中于尿中肿瘤标记物的研究。实际上，具有该目的的不同试验已出现于市场上(N MP22， UroVysion， I匪noCyt， Accu-Dx等)。 仍未出现于市场上的一个选择对象是通过确定膀胱癌标记物的基因表达检测 尿样中的膀胱TCC。实际上，存在一些建议该方法的有用性的研究，尽管它们用一种或 少数几禾中标记物基因进行研究[Parekattil SJ， Fisher HA， Kogan BA. Neural network usingcombined urine nuclear matrix protein—22， monocyte chemoattractant protein—land urinary intercellular adhesion molecule-l to detect bladder cancer. J Urol2003 ;169 :917-20 ;Eissa S， Ke丽y G， Swellam M， EI Fadle AA， Abd EI—Aal AA， EIAhmady 0. Comparison of cytokeratin 20 RNA and angiogenin in voided urinesamples as diagnosis tools for bladder carcinoma. Clin Biochem 2004 ;37 :803-10 ;Larsson PC， Beheshti B， Sampson HA， Jewett MA， Shipman R. Allelic deletionfingerprinting of urine cellsediments in bladder cancer. Mol Diagn 2001 ;6 :181-88]。 适应这些需求，本发明人在重要的研究工作之后已鉴别出14种膀胱肿瘤标记物 基因，由此他们已开发膀胱癌诊断和预后方法，该方法基于通过从膀胱液提取的RNA的定 量实时PCR的这些基因的基因表达的检测和定量，以及他们随后通过"报警系统"的计算机组合。 附图简述

图1 (A-J):用膀胱洗液的完整RNA(BW0)(图1A)和部分降解RNA(BW1、 BW2、 BW3) (图1B、1C、1D)、膀胱肿瘤(T0、T1、T2、T3)(图1E、1F、1G、1H)和对照样品池(C)(图11)的 样品的Agilent 2100生物分析仪获得的电泳图谱，以及具有各分析样品的核糖体RNA带 (28S和18S)的凝胶(图1J)。对于具有可比较品质的RNA样品，数字0、1、2和3指定为降 解增加次序的样品。 图2 : (a)在各阵列(array)中100个最不同表达基因的阵列对(pairs of array) 之间比较的半矩阵。半矩阵的上下灰色阴影部分显示膀胱洗液(BW)阵列对之间和肿瘤 (T)阵列对之间的用不同降解度RNA杂交的共同基因的差异性表达百分数。半矩阵的非 阴影部分对应于膀胱洗液和肿瘤阵列对之间共同基因的差异性表达百分数。(b)芯片 (microarray)中含有的所有克隆的无监督聚类，包括具有染色交换(DS)的复制物。
图3 :在36种另外的肿瘤膀胱洗液样品中，通过在cDNA芯片和与膀胱癌相关的 4种差异性表达基因(KRT20、 GSN、 IGF2和CCL2)的定量实时RT-PCR(qRT-PCR)的生效。 正值表示与对照相关的肿瘤膀胱洗液中的过表达。样品依赖于根据肿瘤阶段和级别的 1og2ratio在图表中分组低级别浅表性肿瘤(8pTa和3pTl)，高级别浅表性肿瘤(5pTa、 5pTl和4pTis)和侵入性肿瘤(9pT2和2pT4)。 图4 :通过无监督球形聚类(global cluster)(欧几里得(Euclidean)距离和 UPGMA)的样品分类。pT2j、pT2—2和pT2—3 (浸润性肿瘤)；PTlHG_l、pTlHG_2和PT1HG_3 (高级别浅表性肿瘤)；pTlLG_l、 PT1LG_2、 PT1LG_3 (低级别浅表性肿瘤)。
图5 :池和其中含有的单个样品的定量实时PCR(qRT-PCR)结果。表分为池(左部) 和单个样品(右侧)。池的栏表示池编号(No.)、在芯片中观察到的表达水平(i! arrays) 和通过qRT-PCR定量的水平(qRT-PCR)。单个样品的第一栏对应于在以下栏(1_5)中指出 的池中含有的单个样品的表达的算数平均值(mean)。各行对应于一个基因(TCN1、S0RBS1、 MYHll、 SRPX、 CRH、 KRT14、 RRM2、 F0SB、 CEACAM6、 CES1)，其对于各池具有不同的表达水平。
图6 :60种单独的膀胱液样品通过384种基因的无监督球形聚类的分类(欧几里 得距离和UPGMA)。样品的命名遵循如下规则如果样品以字母"B"开始，其称为肿瘤膀胱洗 液样品；如果以"CB"开始，其称为对照膀胱液样品；如果首字母"RV"出现在样品编号之后， 其称为膀胱洗液样品；另一方面，如果首字母"O"出现，其称为尿样，肿瘤级别和肿瘤样品 的病理状况在下划线后指出。箭头指出样品的不良分类，它们表明与确立的种类TJ1G(高 级别肿瘤);T_LG(低级别肿瘤)和C(对照)相关。 图7(A和B) :140种单独的膀胱液样品通过96种基因的无监督球形聚类的分类 (欧几里得距离和UPGMA)。箭头指出样品的不良分类，它们表明与确立的种类(C，对照；图 7A以及T，肿瘤样品；图7B)相关。样品的命名遵循以下规则如果样品以字母"B"开始，其 称为肿瘤膀胱液样品；如果以"CB"开始，其称为对照膀胱液样品；如果首字母"R"出现的样 品编号之后，其称为膀胱洗液样品；另一方面，如果首字母"O"出现，其称为尿样。
图8 (A-T):膀胱癌用的384种诊断、预后和内源性对照基因列表。该列表已由通过 具有不同阶段和肿瘤级别的膀胱肿瘤组织样品与对照膀胱粘膜样品的池的Affymetrix芯 片的分析获得。 图9 (A-D):膀胱癌用的96种诊断、预后和内源性对照基因列表。该列表已通过在 含有图8的384种基因的微流体卡中的60种膀胱液样品的分析获得。指出了选择来用于 TaqMan Low Density Array微流体卡的基因符号禾口 TaqMan Gene Expression Assay的名 称。 图10(A和B):膀胱癌用的48种诊断、预后和内源性对照基因列表。该列表已通 过在含有图9的96种基因的微流体卡中的140种膀胱液样品的分析获得。指出了选择来 用于Taq Man Low Density Array微流体卡的基因符号禾口Taq Man Gene ExpressionAssay 的名称。 发明目的 本发明的目的涉及体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法，其基于在作为所述
疾病遗传标记物的某些基因和/或其组合的基因表达的膀胱液中的检测和定量。 同样，所述基因作为膀胱癌诊断和/或预后遗传标记物的用途也是本发明的目的。 最后，本发明的另一目的涉及膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，其基于所述基因作
为该疾病遗传标记物的的用途。 发明描述 本发明的主要目的是开发体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法，其基于作为 所述疾病的遗传标记物的某些基因的检测和定量。 为了实施该方法，起始点是由对其进行某些基因和/或其组合的表达模式的检测和定量的受试者获得的膀胱液样品。将所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考值相比， 由此确立诊断和/或预后。 本发明中所用术语"受试者"涉及人类。 从受试者获得的膀胱液样品可以是尿或膀胱洗液样品，其能通过任何常规方法获 得。 在本发明中，理解膀胱癌诊断方法为其使得检测和定量化肿瘤和对照样品(来自 健康个体)之间的差异性表达基因(诊断基因)。 预后方法涉及那些使得检测不同种类的肿瘤中的差异性表达基因(预后基因)， 其使得在各情况下根据侵入性和个性化治疗分类肿瘤。 不同种类的过渡型细胞癌(TCC)的肿瘤分类目前基于病理解剖实验室中的宏观 和微观观察。它们的分类通过基于肿瘤深度和细胞微观外表的大致标准化观察决定。近来 的分子研究看来表明实际上存在主要区分浅表性类型肿瘤和浸润性肿瘤的两种不同的基 因谱(genetic profile)。 因此，浅表性膀胱肿瘤称为Ta、Tis和Tl。 Ta癌是外植癌，其是非侵入性的或限于
上皮。Tis是原位癌(扁平浅表性肿瘤)，T1是侵入皮下结缔组织或侵入固有层的肿瘤。 在本发明中，縮写HG用于确定高级别肿瘤而LG用于确定低级别肿瘤。 Ta和Tl癌能通过经尿道切除(TUR)根治。尽管高级别(HG) Tis和Tl是限于粘膜
的浅表性癌，但是因为它们是高级别肿瘤，也已用分子生物学技术和通过临床经验证明它
们具有高度恶性和侵入潜能。 此外，浸润性膀胱癌分为T2、T3和T4。因此，T2涉及侵入肌肉膀胱层的肿瘤。该 种类依次分为侵入浅表性肌肉层或内半部的T2a，和侵入深肌肉层或外半部的T2b。 T3涉及 侵入肌肉层以外或侵入膀胱周脂肪的肿瘤。该种类依次分为具有微观侵入的T3a，和具有宏 观侵入的T3b。最后，T4涉及侵入临近膀胱的结构，其依次分为具有前列腺、子宫或阴道侵 入的T4a和具有骨盆壁或腹壁侵入的T4b。 基因的基因表达的检测和定量能通过任何适于本发明目的的非侵入性分子生物 学技术例如表达芯片、定量实时PCR、 northern印记、常规PCR等进行。
具体地，使用DNA阵列允许获得很大量基因的表达结果，使得在各试验中测试数 千基因。使用该技术要求大量具有良好品质的RNA(非降解的)。 定量实时PCR技术(qRT-PCR)优选用于本发明中检测和定量诊断基因和/或预后 基因。除了可允许使用具有相当降解度的RNA而不影响最终结果之外，该技术还更精确。同 样，其使得定量化感兴趣基因的具体RNA。在特定实施方案中，使用的杂交探针是T叫man探 针。 将在膀胱液样品中基因表达的检测和定量中获得的结果与来自健康受试者的样 品中所述基因的常规参考值比较。标记物基因水平的提高或降低通常通过将由对应于试验 受试者的样品分析获得的结果与平行分析的对照样品的结果比较来评价。各样品分类的最 终决定通过基于标记物基因表达值的"报警系统"作出，因此，如果任何观察到的值相对于 对照样品中预期的值显示非常明显的偏离，则最终分类为肿瘤分类的可能性大大增加，而 与"给出报警"的基因无关。 更具体地，在本发明的主要方面，非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法包括从
10受试者收集膀胱液样品，以在所述样品中进行ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、MAGEA3、P0STN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAM和MCM10基因组合表达模式的检测和 定量。将所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。 膀胱液样品优选为尿，因为其获得要容易得多。然而，偶尔以常规方式得到膀胱洗 液，获得具有更好品质的RNA。 位于4q32. 3的ANXA 10 (膜联蛋白A10)基因(也称为ANX14)参与细胞分裂调控 和不同的信号转导途径，但是它们的精确作用仍未确定。 C14orf78(染色体14开放读码框78)基因(也称为AHNAK2或KIAA2019)位于 14q32.33。其作用仍未确定。 位于lq31的CTSE(组织蛋白酶E)基因(也称为CATE)编码胞内蛋白酶。 位于8ql3的CRH(促肾上腺皮质素释放激素)基因(也称为CRF)编码在下丘脑
响应应激分泌的促肾上腺皮质素释放激素。 位于11pl5.5的IGF2(胰岛素样生长因子2(促生长因子A))基因(也称为
11orf43、FLJ22066、FLJ44734、 INSIGF)编码胰岛素样生长因子。 KLF9 (Kru卯el样因子9)基因(也称为BTEB1)编码转录因子。位于17q21. 2的KRT20 (角蛋白20)基因(也称为K20 ;CK20 ;KRT21 ;MGC35423)
编码负责赋予上皮细胞结构和完整性的中间丝(intermediate filament)的蛋白质形成部分。 MAGEA3 (黑色素瘤抗原家族A，3)基因(也称为HIP8 ;HYPD ;MAGE3 ;MAGEA6 ; MGC14613)位于Xq28。其作用未知。 POSTN(periostin，成骨细胞特异性因子)基因(也称为PN ;0SF-2 ;PDLPOSTN ;MGC 119510 ;MGC119511 ;periostin ;RP11-412K4. 1)位于13ql3. 3，具有与细胞运动性相关的作 用。PPP1R14D(蛋白质磷酸酶l，调节(抑制剂)亚单位14D)基因(也称为GBPI-1 ;
FLJ20251 ;MGC119014 ;MGC119016 ;CPI17样)位于15ql5. l，编码磷酸酶。 位于19pl3. 12的SLC1A6 (溶质载体家族1 (高亲合性天冬氨酸/谷氨酸转运蛋
白)，成员6)基因(也称为EAAT4 ;MGC33092 ;MGC43671)参与胞内运输。位于5pl5. 33的TERT(端粒酶逆转录酶)基因(也称为TP2 ;TRT ;EST2 ;TCS1 ;
hEST2)编码具有逆转录酶活性的端粒聚合酶。 位于llq24. 1的ASAM(脂肪细胞特异性粘附分子)基因(也称为ASAM ;ACAM ; CLMP ;FLJ22415)参与细胞粘附。 最后，位于10pl3的MCM10(微型染色体维持缺陷IO(酿酒酵母(S. cerevisiae)))
基因(也称为CNA43 ;PR02249 ;MGC 126776)编码涉及基因组复制启动的蛋白质。 在本发明的另一方面，体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法包括从受试者收
集膀胱液样品，以在所述样品中进行ANXA10 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、 KRT20 、 MAGEA3 、 SLC1A6 、 TERT
和MCM10基因组合的表达模式的检测和定量。将所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考
值比较。 在本发明的另一方面，体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法包括从受试者收 集膀胱液样品，以在所述膀胱液样品中进行选自C14orf 78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其组合的基因表达的检测和定量。将所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
因此，在本发明的一个特别方面，预期所述基于C14orf78基因表达的个体检测和 定量的诊断和/或预后方法。 在本发明的另一特定方面，预期所述基于KLF9基因表达的个体检测和定量的诊 断和/或预后方法。 在本发明的另一特定方面，预期所述基于POSTN基因表达的个体检测和定量的诊 断和/或预后方法。 在另一特定方面，预期所述基于PPPIR14D基因表达的个体检测和定量的诊断和/ 或预后方法。 在本发明的另一特定方面，预期所述基于ASAM基因表达的个体检测和定量的诊 断和/或预后方法。 在本发明的另一特定实施方案中，预期基于选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其组合的基因以及此外至少一种选自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT及MCM10的基因的检测和定量的体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预 后方法。 在本发明的另一方面，根据前述方法，预期关注于膀胱癌诊断的体外非侵入性 方法，其包括从受试者收集膀胱液样品以进行ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、MAGEA3、P0STN、PPP1R14D、SLC1A6和TERT基因的组合的表达模式的检测和定量。将 所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。 在本发明的另一方面，体外非侵入性膀胱癌诊断方法包括从受试者收集膀胱液样 品，以进行ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6和TERT基因的组合的表达模式 的检测和定量。将所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。 在本发明的另一方面，体外非侵入性膀胱癌诊断方法包括从受试者收集膀胱液样 品，以进行选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其组合的基因表达的检测和定量。将 所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。 在本发明的特定实施方案中，所述诊断方法基于C14orf78基因的检测和定量。
在本发明的另一特定实施方案中，所述诊断方法基于KLF9基因的检测和定量。
在本发明的另一特定实施方案中，所述诊断方法基于POSTN基因的检测和定量。
在本发明的另一特定实施方案中，所述诊断方法基于PPPIR14D基因的检测和定 在本发明的另一特定实施方案中，所述诊断方法基于选自C14orf78、KLF9、P0STN、 PPP1R14D及其组合的基因和此外的至少一种选自ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6及TERT的基因的表达的检测和定量。 在本发明的另一方面，预期体外非侵入性膀胱癌预后方法，其包括从受试者收集 膀胱液样品，以进行ASAM和MCM10基因组合的表达模式的检测和定量。将所得结果与膀胱 液中所述基因的常规参考值比较。 本发明的另一方面提供体外非侵入性膀胱癌预后方法，其包括从受试者收集膀胱 液样品，以进行ASAM基因表达的检测和定量。将所得结果与膀胱液中所述基因的常规参考 值比较。
在本发明的另 一方面，预期使用ANXA10 、 C14orf 78 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、 KLF9 、 KRT20 、 MAG EA3、P0STN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAM和MCM10基因的组合作为膀胱癌诊断和/或 预后标记物。 本发明的另一方面关注使用ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6、TERT 和MCM10基因的组合作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。 在本发明的另一方面，预期使用选自C14orf78、KLF9、P0STN、PPPlR14D、ASAM及其 组合的基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。 在本发明的特定实施方案中，预期使用C14orf78基因作为膀胱癌诊断和/或预后 标记物。 在本发明的另一特定实施方案中，预期使用KLF9基因作为膀胱癌诊断和/或预后 标记物。 在本发明的另一特定实施方案中，预期使用POSTN基因作为膀胱癌诊断和/或预 后标记物。 在本发明的另一特定实施方案中，预期使用PPP1R14D基因作为膀胱癌诊断和/或 预后标记物。 在本发明的另一特定实施方案中，预期使用ASAM基因作为膀胱癌诊断和/或预后 标记物。 本发明的另一方面关注组合使用选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及 其组合的基因与至少一种选自ANXA10、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT及 MCM10的基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。本发明的另一方面涉及使用ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6和TERT基因的组合作为膀胱癌诊断标记物。
本发明的另一方面关注使用ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和 TERT基因的组合作为膀胱癌诊断标记物. 本发明的另一方面涉及使用选自C14orf78、KLF9、P0STN、PPPlR14D及其组合的基 因作为膀胱癌诊断标记物. 在本发明的特定实施方案中，预期使用C14orf78基因作为膀胱癌诊断标记物。
同样，在本发明的另一特定实施方案中，预期使用KLF9基因作为膀胱癌诊断标记
物。

物。 在本发明的另一方面，预期使用选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其组合 的基因与至少一种选自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2， KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6及TERT的基因作 为膀胱癌诊断标记物。 在本发明的另一方面，预期使用ASAM和MCM10基因的组合作为膀胱癌预后标记 物。 在本发明的另一方面，预期使用ASAM基因作为膀胱癌预后标记物。 本发明的另一方面涉及膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，其包括适用于ANXA10、
在本发明的另一特定实施方案中，预期使用POSTN基因作为膀胱癌诊断标记物。 在本发明的另一特定实施方案中，预期使用PPP1R14D基因作为膀胱癌诊断标记
13C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6、 TERT、 ASAM和 MCM10基因的组合的表达模式的检测和定量的一组探针。 在本发明的另一方面，膀胱癌诊断和/或预后试剂盒包括适用于ANXA10、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的组合的表达模式的检测和定量的 一组探针。 在本发明的另一方面，预期膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，其基于适用于选自 C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其组合的基因的检测和定量的一组探针。
在本发明的特定实施方案中，所述基于用于选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、ASAM及其组合的基因的检测和定量化的一组探针的膀胱癌诊断和/或预后试剂 盒，另外包括适用于选自ANXA10 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、 KRT20 、 MAGEA3 、 SLC1A6 、 TERT和MCM10的 基因的检测和定量的一组探针。 在本发明的另一方面，预期膀胱癌诊断试剂盒，其基于适用于ANXA10、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、MAGEA3、 P0STN、 PPP 1R14D、 SLC1A6和TERT基因的组合的表达 模式的检测和定量的一组探针。在本发明的另一方面，膀胱癌诊断试剂盒包括适用于ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、MAGEA3、 SLC1A6和TERT基因的组合的表达模式的检测和定量的一组探针。
在本发明的另一方面，预期癌症诊断试剂盒，其基于适用于选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其组合的基因的检测和定量的一组探针。在本发明的另一方面，所述基于适用于选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及
其组合的基因的检测和定量的一组探针的试剂盒，另外包括适用于至少一种选自ANXAIO、
CTSE、 CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6和TERT的基因的检测和定量的探针。 在本发明的另一方面，预期膀胱癌预后试剂盒，其基于适用于ASAM和MCM10基因
组合的表达模式的检测和定量的一组探针。 在本发明的另一方面，预后试剂盒基于适用于ASAM基因检测和定量的探针。
表1显示作为膀胱癌诊断和/或预后遗传标记物鉴别出的14种基因。ASAM和 MCM10基因是用于预后的2种特异性基因。 以下给出用于说明本发明但不用于限制本发明的几个实施例。 实施例 实施例膀胱液样品中降解重要件的确定。 为了实现本发明的最终目标，首先有必要知道不同RNA降解水平对基因表达谱 (gene e邓ression profile)的影响，因为由膀胱液(尿和/或膀胱洗液)获得的RNA的品 质通常低。还要确定由膀胱液获得的基因表达谱与相应肿瘤中获得的那些是否匹配。
1.样品选择和RNA制备 选择来自同一个诊断为高级别(G3)pT2的患者的肿瘤组织(T)和膀胱洗液 (BW)样品[根据以下中所述方法Lopez-Beltran A， Sauter G， Gasser T， Hartma皿 A， Schmitz- 。,er BJ， Helpap B， Ayala AG， Tamboni P， K丽les MA， Sidransky D， Cordon-Cardo C， Jones PA， Cairns P， Simon R， Amin MB， Tyczynsky JE. Tumours of theUrinary System. In :Eble JN，Sauter G，Epstein JI，Sesterhenn IA (eds. )，Pathologyand Genetics of Tumours of the Urinary System and Male GenitalOrgans. World Health Organization Classification of Tumours丄yon :IARC Press ;2004 :89-157 ; Sobin LH， Wittekind CH. TNM Classification of Malignant Tumours. International Union Against Cancer. ，6th ed. New York :Jonh Wiley & Sons ;2002]。根据供应商的说 明，用TRlzol (Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)提取两种样品(TO和BW0)的RNA。然后将 两种RNA(T0和BW0)的等分试样通过将它们在80。C下保温15 (Tl和BW1)分钟、30(T2和 BW2)分钟和60 (T3和BW3)分钟降解，得到三种降解水平，如Xiang CC，Chen M，Ma L等人在 A new strategy to amplify degraded RNAfrom small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003 ;31 :53中所述，区别在于使用水代替碱性缓冲液。
还从4名没有膀胱病变证据的患者收集健康膀胱粘膜样品(对照样品)，以与前述 样品相同的方式获得RNA，4种RNA以等摩尔比混合(CO)。 在Agilent 2100 Bioanalyzer中分析1 ii 1各完整RNA和降解RNA，以确定各 RNA的品质(根据Imbeaud S， Graudens E， Boulanger V等人在Towardsstandardization of RNA quality assessment using user—independent classifiers ofmicroc即illary electrophoresis traces. Nucleic Acids Res 2005 ;33 :e56中所述的方法)(图1. A-H)。 图l(J)显示各分析样品的具有核糖体R NA(28S和18S)带的凝胶，其中观察到这些带的逐 渐降解。 此外，从没有膀胱病变的患者收集36种膀胱洗液(8低级别(LG)pTa，5高级别
(HG)pTa，3pTlLG，5pTlHG，4pTis，9pT2HG和2pT4HG)和14种对照膀胱洗液，以与前述情况相
同的方式提取RNA。 2.体外RNA扩增和标记 通过使用在T3启动子序列(T3N9)的3'添加修饰的具有9核苷酸随机序列的引 物(随机九聚物引物)扩增5 ii g完整RNA(T0和BW0)和降解RNA(T1、 T2、 T3、 BW1、 BW2和 BW3)(根据Xiang CC， Chen M， Ma Let al.A newstrategy to amplify degradedRNA from small tissue samples for microarray studies. Nucleic Acids Res 2003 ;31 :e53)。 探针通过直接t示记f去合成(*艮据Richter A， Schwager C， Hentze S， AnsorgeW， Hentze 丽，Muckenthaler M. Comparison of fluorescent tag DNA labelingmethods used for expression analysis by DNA microarrays. Biotechniques 2002 ;33 :620_8，630).
3.阵列加工和数据分析 0ncochip-v2玻璃人cDNA芯片(htt。
〃gru。os. cnio. es/genomica/arrays/ reports/ochip v2.xls)用于将肿瘤和膀胱洗液(T0、 Tl、 T2、 T3、 BW0、 BW1、 BW2和BW3)两 者RNA的四种逐渐降解的各等分试样与来自健康膀胱粘膜样品(CO)的RNA库共杂交。用 G2565BA Microarray Sca皿erSystem(Agilent, Technologies, Waldbro皿，Germany)获得 荧光图像，使用Spotprogram(http://experimental, act, cmis. csiro. au/Spot)在R统计 环境(htto:〃w丽.r-OToiect. org)中定量TIFF图像。芯片各点的最终强度测量如前述已 建议夷，样计算(http:〃www. stat. berkeley. edu/users/terry/zarray/Html/image. html) (公众在GE0数据库可获得的数据；GSE3192)。最后，获得1111种符合所有质量标准的有 效克隆，选择各阵列100种最不相同表达的克隆进行阵列间比较并计算它们之间共同基因 的百分数。肿瘤组织阵列之间(85至91%)以及膀胱洗液阵列之间(78至93%)检测到
15差异性表达的共同基因的高百分数(图2a)，这表明RNA降解实际上并不影响基因表达谱。
芯片中获得的所有克隆的无监督聚类也使用UPGMA(用算数平均值的非加权对群 法)和皮尔森对射变换进行。该聚类表明在用具有不同降解水平的RNA(例如，BW0和BW1) 杂交的2种阵列之间鉴别出的共同基因百分数偶尔高于相同阵列染色交换(DS)复制物 (例如，BWO与BWO-DS)之间的百分数(图2b)，这加强了当用部分降解RNA作业时基因表 达谱实际上不变化的结论。 为了确定从膀胱洗液样品获得的基因表达谱与相应肿瘤中获得的那些是否匹配， 比较肿瘤组织阵列和膀胱洗液阵列之间差异性表达的共同基因百分数。获得肿瘤和膀胱洗 液之间的高度相似性(52至60% )，该相似性有赖于RNA降解条件。 总之，该数据提示部分降解的膀胱洗液RNA能用于使用芯片的基因表达研究，以 及该RNA是肿瘤基因表达的反映。
4.定量实时RT-PCR(aRT-PCR) 为了验证在特定患者芯片中获得的结果能推广到更长远的群体，通过qRT-PCR分 析在根据文献涉及膀胱癌发生过程的阵列中4种差异性表达基因(KRT20， IGF2， GSN和 CCL2)。关于该验证，使用36种其他肿瘤膀胱洗液和14种对照膀胱洗液。
由lug RNA使用High-Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems， FosterCity ， USA)，根据供应商的说明合成cDNA，除了反应的最后体积减少至50 yl。 GUSB 基因用作内源性对照。使用ABI PRISM 7000S DS(Applied Biosystems,FosterCity,USA) 中的Assays-on-DemancT Gene Expression Products,根据供应商的说明进行PCR，除了反 应体积减少至20iU。 A ACt方法(ABI PRISM 7700 Sequence Detection System User Bulletin #2 : Relative Quantification of Gene Expression P/N 4303859)用于计算相对于14种对照 样品表达的平均值各基因表达的相对量。为了确立对照样品中的参考值，获得来自没有膀 胱病变的患者的14种对照膀胱洗液表达值的算术平均值。 将表示为1og2ratio的该分析结果定义为表示为2为底数的对数的2种比较条件 (在这个情况下是内源性对照相对于各指出基因)之间的比例或除法(比率)，对于KRT20 在81 %的样品中证实了芯片结果，对GNS为89 %中，对IGF2为64 %中和对CCL2为89 %中 (图3)。由单个患者分析获得的芯片数据和由36名其他患者群组分析获得的qRT-PCR数 据之间的高度一致性证实在芯片中获得的基因表达谱不应归于单个患者分析。
5.实施例1的结论 通过cDNA芯片和qRT-PCR两者，均可能使用膀胱洗液RNA以推论相应膀胱肿瘤的 基因表达谱。 实施例2用于预测l樽型的候诜某因的最初确定 —旦了解可能在膀胱液样品中确定基因表达谱，接下来的目标是获得尽可能广泛 的特征基因表达数据。为了在连续阶段的更广泛样品系列中逐渐分析或多或少增加的基因 选择量，决定遵循通过在少量样品中分析最大可能量基因开始的策略。 流程依次包括在该过程的所有关键步骤中确立非常严格的质量控制。这包括在手 术室由F皿daci6Puigvert团队的外科大夫获得具有期望特性的生物样品，在适当条件下 贮存并保藏样品，通过实验室仪器进行样品的解剖病理分析和分子处理。
1.获得并诜择牛物样品 在手术室使用冷手术钳切除器(resector)(肿瘤样品)或直接用剪刀(对照样 品)获得组织样品。获得的部分组织立即在-8(TC下冷冻，直至随后加工用于RNA提取，剩 余部分送至病理解剖部门以用于其病理解剖分析。关于RNA提取，将该组织机械地均匀化， 根据TRlzol (Invitrogen，Calsbad，CA，USA)规程提取RNA。最后，通过分光光度法在260nm 下测量吸光度来定量RNA。
2.要研究的样品纟目 已知浅表性肿瘤和侵入性肿瘤看来具有不同的基因谱(genetic profile)，决定 比较最极端的肿瘤组(低级别浅表性肿瘤与浸润性肿瘤)。此外，还决定查明具有不明临床 行为的肿瘤类型的分子情况(molecular prof ile)，这是因为它们是浅表性但具有高度细 胞畸变的肿瘤(分类为高级别Tl、 pTl HG)，在很多情况下(约50% )以浸润性肿瘤告终。 因此确定四个研究组-组l ;低级别(LG)浅表性肿瘤样品，其仅侵入膀胱粘膜(病理上分类为pTa LG)。
_组2:高级别(HG)浅表性肿瘤样品，其侵入皮下结缔组织(病理上分类为pTl HG)。-组3 :浸润性和高级别肿瘤样品(病理上分类为pT2)。 [OH4]-组4 :健康膀胱粘膜样品(对照)。 为了减少相当高的生物学差异的目的，进行同样肿瘤类型，即具有相同解剖病理 学分类的样品库。因此，对于各组进行4-5种肿瘤样品的3个库；pTa LG，pTl HG，pT2HG和 对照。 3. Aff，etrix芯片 尽管以前已经利用基于cDNA的芯片平台作业，但从文献已知曾有其他基于寡核 苷酸的商业平台能允许获得更大量基因的表达结果。最后，决定使用Affymetrix平台 (http:〃www. affymetrix. com/index, affx)，已知对于该平台存在大量在公共数据库可获 得的数据，事实上，所有文献都提到它的高的结果品质，允许测量最多的人基因表达的新芯 片(U133 plus 2.0)已刚刚投放市场。 Affymetrix芯片通过专业公司(Progenika)杂交并扫描，原始表达数据(或eel 文件)直接在R统计环境下使用RMA(Robust Multi array Analysis)算法分析。
4. Affymetrix芯片分析 —旦对各克隆已获得标准化表达数据，就决定研究如何通过进行无监督聚类将已 选择的不同样品聚类到一起(图4)。在后者中，能观察到所有对照聚类到一起并明显不同 于肿瘤，这表明在肿瘤和对照之间存在很多差异性表达基因(诊断基因)。此外，还观察到 浸润性肿瘤(pT2J、pT2—2和pT2—3)和高级别浅表性肿瘤(pTl HG_l、pTl HG—2和pTlHG—3) 的3个库聚类到一起并且不同于低级别浅表性肿瘤(pTl LG_l、pTl LG_2、pTlLG_3)的3个 库，这应该允许定位任意一途径的标记物基因(预后基因)。 作为用于比较不同组和获得最不同表达的基因的分级系统，决定使用以对数标度 的具有最小平均值的组的最大强度与具有最大平均值的组的最小强度的比率。该测量相当 于能通过比较组的任意复制物与其他组的任意复制物获得的最小倍数变化。所得最终结果 为在肿瘤和对照之间具有十分明显表达差异的真正数千基因。
5.通讨定量实时PCR所得的芯片结果的验证 —旦基因依次从多到少差异性表达，决定使用完全独立的，并根据文献精确得多的技术定量实时PCR(qRT-PCR)来验证结果。选择十种最不同表达基因进行该技术验证，它们的基因表达通过qRT-PCR使用芯片中杂交的完全相同的库(为了能比较两种技术的结果)并使用各库的单个试验(为了能研究实际qRT-PCR技术的重复性)来定量(图5)。在芯片与qRT-PCR间的比较中获得回归系数O. 978，其表明2种技术间非常良好的重复性。当比较通过qRT-PCR获得的单个样品的算数平均值和通过相同技术获得的库中它们的表达时，回归系数为0. 995，这证实著录数据的事实，通过qRT-PCR的定量具有优良的技术品质。
6.实施例2的结论 考虑到通过在基因的小群体中使用两种完全独立的技术基因表达定量观察到的结果，能够推断通过芯片观察到的表达看来对于后续更广泛和具体的分析用于限定候选基因坚实组(robust group)是充分可靠的。 平行地，推断尽管芯片适于定量基因表达，除了允许样品中更高的RNA降解水平而没有负面影响最终结果以外，qRT-PCR也仍然更精确。
实施例3候诜某闵的第一次诜择 该研究的最终目的在于选择涉及膀胱TCC的基因的减化组以及在定量它们的表达时获得诊断和预后肿瘤信息。为此，已验证能使用两种技术，DNA芯片和定量实时PCR。通过芯片技术，在各试验中测试数千种基因，然而需要比用qRT-PCR方法更大量的具有更好品质的RNA进行试验。此外，后者是更精确的技术，能够定量化感兴趣基因的精确数量。因此，在研究的后续阶段，决定使用基于qRT-PCR的TaqMan Low DensityArray (TLDA)技术。
1.用于TagMan Low Density Arrays (TLDA)卡的384种基因的选择
TLDA是微流体卡(microfluidic card)，含有最多384种基因用冻干引物和TaqMan探针(存在不同TLDA配置，其允许分析从同一卡中的384种基因，一直到同一样品中的48种基因和8个样品)。因此，从通过用组织RNA杂交的Affymetrix芯片前述进行的试验中，已选择384种基因的亚组。选择肿瘤和对照之间最不同表达的基因(诊断基因)以及三个肿瘤组pTa LG、 pTl HG和pT2 HG之间的差异性表达基因(预后基因)。
此外，已知本项目的目的之一是用膀胱液作业，在项目该阶段中的意图是能研究384种基因，不用组织RNA，而是直接用膀胱液(尿或膀胱洗液)，如迄今已进行的。
2.膀胱洗液和尿的收集和加工 在切除膀胱肿瘤之前或囊切除之前，通过手术时抽液加药注射法(barbotageintraope ratively)收集膀胱洗液样品。尿样品通过在患者进入手术室之前自发排尿来收集。膀胱洗液样品和尿样品在收集后都立即在冰中运送到实验室。样品与1/25体积的pH8. 0的0. 5M EDTA混合，在1000Xg下离心10分钟。将细胞沉淀(cell pellet)重悬浮于1ml TRIzol(Invitrogen，Calsbad，CA，USA)中，并在_80°C下冰冻直至RNA提取。
收集并贮存425种肿瘤膀胱洗液样品，30种对照膀胱洗液样品，43种肿瘤尿样品和158种对照尿样品。
3. RNA提取和cDNA合成 根据TRIzol (Invitrogen， Calsbad， CA， USA)程序提取RNA，并通过分光光度法测量在260nm下的吸光度定量。
18
由lug腿使用High-Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems， Foster
City， USA)根据供货商的说明合成cDNA，除了最后的反应体积减少至50 yl。4.诜择"TaaMan某因表汰产物"和定量实时RT-PCR(aRT-PCR). —旦了解感兴趣的基因，在Applied Biosystems web (htto: 〃www.
appliedbiosystems. com/)选择弓|物禾口荧光探针(TaqMan Assays_on_Demand Gene
Expression Products)用于通过qRT-PCR的基因表达定量。 配置微流体卡(TaqMan Low Density Array, TLDA)，其包括384个试验，相应于诊断基因和预后基因以及内源性对照基因(图8)。该TLDA配置允许每卡分析单个样品。图8的表指出基因名称和符号，以及其中发现差异性基因表达的Affymetrix克隆。还限定为了 TaqMan Low Density Array微流体卡选择的TaqMan Gene ExpressionAssay (http: //www, a加liedbiosystems. com/)名称。该试验名称依次表明将在qRT-PCR中扩增的基因区。最后指出将用该试验扩增的一个主要转录本(Ref Seq或Gene BankmRNA)。
在ABI PRISM 9700HD SDS(A卯lied Biosystems, Foster City， USA)中根据供货商的说明进行PCR。 通过384-基因TLDA分析总共60种样品 _39种膀胱洗液样品 -15种对照膀胱洗液样品 _3种肿瘤尿样品 _3种周围血液样品；这已知以基于Affymetrix芯片的预先分析进行，在推测纯的
膀胱粘膜样品中观察到肌肉组织污染，并且有迹象怀疑在膀胱液样品中存在免疫系统所致的污染。因此，决定分析3种淋巴细胞样品，以能够通过比较消除在血液中高度表达的基因(已知血液是来自具有膀胱肿瘤的患者的膀胱液样品中的恒定污染物)。
5. 384-基因TLDA的分析 —旦进行所有PCR，通过SDS 2. 1程序(A卯lied Biosystems)确立最适于各基因的阈值水平和基线水平，以及Ct (循环阈值)或原始表达数据。 随后，计算各基因的相对表达测量或ACt(目标基因的Ct-内源性对照的Ct，在这个情况下的内源性对照为GUSB)，研究通过无监督聚类(使用欧几里得距离和U PGMA)各个样品如何聚类在一起(图6)。在该聚类中观察到的第一分类水平在为周围血液和膀胱液(膀胱洗液和尿)样品的3种样品中的区别。此外，膀胱液亚聚类至在聚类上部聚类到一起的一个样品组(从B 155-RVJ2high样品至B288-RVlJaG2high样品)，其仅由肿瘤膀胱液样品形成，以及在聚类下部的另一个样品组(从B71-RV_TaG21oWCIS样品至B109_RV_T2high样品)，其由肿瘤和对照膀胱液的混合物形成。在上部聚类内部，高级别和低级别肿瘤能依次被辨别出，而在下部聚类中存在几乎仅具有对照样品的聚类和具有对照和肿瘤混合物的另一个聚类，必须考虑已发生从库中分析组织到各个样品中膀胱液的变化，因此通过聚类的辨别能力损失是相对可预测的。 该分析的目的是将在使用更大数量样品的下一阶段中要研究的基因从384减少至96。对选择最好基因的过程考虑不同参数，包括前述统计参数(最小倍数变化)，还包括2个比较组中位值的对数标度比例(中位值倍数变化)和通过不同强度值基因的个体化人工分析。这使得减少初始组384种基因至试验下一阶段所需的96种基因(图9)。
棚列4.細白條二雄柳乂土曾力口i條/予脂肯p匕力 在本阶段作业中，目的是增加肿瘤和对照样品之间的辨别能力。为此，意图是分析更多数量膀胱液样品，和如果可能减少至少一半数量的该诊断和预后系统应该基于其的初始原型的基因。 1.要分析的样品和96-某因TLDA 配置包括96个试验的微流体卡(Taq Man Low Density A rrays)(图9)，并以与
384种基因相同的方式加工，区别在于该TLDA配置允许每卡分析4种样品。 通过96-基因TLDA分析总共80种样品 _42种肿瘤膀胱洗液样品 -8种对照膀胱洗液样品 _15种肿瘤尿样品 -15种对照尿样品 2. 96-某因TLDA的分析 已知试验前阶段(实施例3)中使用的技术与本实施例中刚好相同，在本阶段中分析的基因已包括在前面分析的384-基因TLDA中，决定提取新的80种样品并将其数据添加到实施例3的60种样品(总共=140种样品)。 第一次分析通过具有96种基因表达的140种样品的无监督聚类进行，能观察到2个明确辨别的大组(图7)。在第一组中(图7. B)，所有样品都是肿瘤样品而没有例外。相反，在第二组中(图7.A)，大部分样品是对照，但是有一些具有不能与常规样品区别开的基因谱的肿瘤样品。从该结果能得到的结论是大多数肿瘤都具有与对照样品不同的特征基因谱，尽管存在一些基因谱无法与常规样品区别开所以它们不能被检测到的情况。观察到与实施例3相同的效果，尽管样品中的辨别能力现在更高。 基于由聚类观察到的数据，在尝试使用其他分类算法(如区别线性分析，k近
邻算法(KNN)，等等)的合适的探讨性分析中，能观察到与持久(pe rsisted)对照样品
有关的一些肿瘤的辨别问题。新的作业假说是使用特定基因组的区别测量的普遍计算
(globalcalculation)用的任意系统具有相同问题。这由以下事实组成，由于肿瘤的高异质
性，相对容易识别具有大多数相似变化的它们大部分的谱，尽管总有选择用于它们分析的
基因的普遍行为未与对照样品区别开的少数情况，这是因为它们改变了少数途径。 为了检测多数和少数肿瘤，通过以下方式建立"报警系统"确立对照样品在其间
变化的值的范围，并添加置信区间以使得能确定这样的点从其更高(或在未表达基因的
情况下更低)的表达将表明肿瘤，不管在其他基因中观察到的表达值。该系统的优点在于，
尽管肿瘤具有与健康样品类似的总体表达谱，但是如果触发报警基因中之一，则肯定样品
是肿瘤样品。 开发所述系统的第一步骤是评价对照的表达范围和它们的置信区间。因为对于对照值非常重要的是没有将错误地改变范围的技术误差，决定排除没有最小品质水平的对照。为了计算该品质测量，使用3种基因(GUSB、18S和PPIA)，其此外可用作所有基因相对定量用的内源性对照(通过计算它们的几何平均值)。通过分析各基因分布的个体行为，不可能证实满足充分适于正态分布，因此不能确立基于其方差的置信区间。作为替代，决定确立具有不同的严格水平任意的固定置信区间(决定使用2倍、4倍或8倍对照值，该对照值具有更类似于作为阈值点的肿瘤的表达值)。 —旦确定对于各基因的阈值点，所有该信息都概括于具有针对肿瘤样品的96种基因的矩阵中。不超过阈值水平的值标记为O，超过阈值水平的那些标记为l(对于每一严格水平)。为了选择最好的基因(意图用其减少谱至至少48种)，考虑两种性质1)基因能检测更大数量的肿瘤(搜索具有更大的值1之和的基因)和2)该检测尽可能地与其它报警基因独立(为了能检测最大量的少数途径)。 结果，感兴趣基因数能减少至小于48，尽管由于技术原因和保守，决定在随后阶段中对于它们的分析保持该数目，这是因为对照中的一些区间可能不完全正确(由于迄今分析的对照样品的低数目)。 为了使分析新样品48种选择基因的基因谱的过程自动化(图10)，创作计算机程序，其从由qRT-PCR获得的Ct结果开始，能进行诊断预测。该程序能使用不同参数文件(有赖于区间的严格性)，因此灵敏度(SN)和特异性(S P)值变化。使用最不严格的参数文件(阈值点为最接近肿瘤的对照的二倍)，获得SN = 100%和SP = 100%。在第二参数文件(阈值点为最接近肿瘤的对照的4倍)中，获得SN = 98. 96%和SP = 100% 。在最后的情况下(阈值点为最差对照的8倍)，获得SN = 97. 93%和SP = 100% 。重要的是指出这些结果从用于生成参数文件的相同样品上获得，因此可能发生过度拟合，其在后续试验中有必要用新样品评价。 实施例5最终谂断樽型的开发 在项目该阶段中的目的是测试并改善肿瘤预测模型以及减少用于实施该预测的基因数至最小。 对于该阶段，有必要扩增更多得多的肿瘤合对照样品组。通过具有48种基因的微流体卡分析440种新样品，其已添加至实施例3(60种样品)和实施例4(80种样品)的数据。 —旦进行样品中最低品质的对照，它们通过前述定性报警模型来分析。所得结果(SN = 0. 81和SP = 0. 81)明显不同于用实施例4的最终模型获得的结果，因此决定尝试改进它，这是因为它可能具有很多过度训练。 从各基因的离散化频率直方图的观察，能够观察到肿瘤和对照样品如何分布。由于具有大幅增加取样的事实，分配间的重叠限制已经明显减少。还能观察到尽管以非常低的频率， 一些对照情况也具有与肿瘤非常类似的表达水平。 尽管在概念上的水平，也仍然认为开发的定性报警系统对基因表达的细胞行为有
良好的近似，定量各基因重要性的不可能性表现出对其预测能力的严重限制。 基于相同的报警概念，决定尝试开发定量模型，这通过使用贝氏条件概率定理
(Bayes， conditional probability theorem)是可會g的。 因为分析的样品数足够高，给出表达值，样品是肿瘤或对照的概率能从观察到的表达频率评价。 基于贝氏理论的模型的优点之一是能独立应用于各传感器基因。观察到的基因表达将改变作为肿瘤的先验概率，给出后验概率，其能作为下一基因的先验概率再次使用。事实上，暗中假定不同基因之间的独立性。 已可能应用该模型的最终样品数为308种肿瘤和156种对照。
当该模型反复应用于该48种基因时，获得前述定性模型预测能力的明显改进(SN=0. 86和SP = 0. 92)，尽管通过研究频率直方图能够观察到很多基因看来没有提供明显信息至最终模型。因此，建议选择对于获取最大量样品诊断信息充分且必要的基因亚组。
没有明确方式通过使用定量模型进行最感兴趣基因的选择。旧的定性模型不允许选择最有益的基因，反过来它们之间具有更高的独立性。对于新的定量模型采用定性模型检测出的最好基因(CTSE、MAGEA3、CRH、SLClA6、PPPlR14D、IGF2、C14orf78和KLF9)的结果显示出结果的重要改进(SN = 0. 89和SP = 0. 96)。 在任何情况下，决定尝试其他近似值。从48种基因频率直方图的目视分析，选择明显最多信息的亚组(ANXAIO、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 SLC1A6和TERT)，其具有彼此之间最多变化的直方图(期望这个事实指出它们之间更高的独立性)。所得结果还显示出与48种基因的分析有关的明显改进(SN = 0. 90和SP = 0. 96)。 最后，由于通过定性模型获得的基因亚组和目视选择的基因均显示出与初始定量模型有关的改进，决定组合2近似值的基因(ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6和TERT)。组合模型的结果略好于它们的任一者(SN = 0. 91和SP = 0. 96)。 —旦获得模型，决定研究不良分类的肿瘤和对照中是否有任何共同模式。在对照的情况下，能够检测到明显存在与泌尿系统(主要是前列腺、肾和阴茎)联系的具有肿瘤的样品。这些类型的样品可能具有共同的具有膀胱肿瘤的表达模式，因此它们能够淆乱预测模型。因此，决定从对照样品中排除所有具有可能与泌尿系统联系的肿瘤的情况。
对照样品数从156减少至126，还有308种肿瘤样品。在该新的群体上通过使用具有48种基因的定量模型观察到重要改进(SN = 0. 90和SP = 0. 93)。在8种最独立基因的情况下，获得SN = 0. 91和SP = 0. 97。在具有最感兴趣直方图的亚组中，获得SN = 0. 91和SP二0.97。最后，在组合的基因亚组中，获得SN = 0.93和SP = 0.97。通过用各前面选择的亚组再次计算数据，通常能够看出模型的能力已通过排除这些对照类型而增加。
关于不良分类肿瘤的研究，检测到在该组中存在的囊切除数明显增加。认为先前的经常在时间上非常接近于根治性手术进行的经尿道切除术(TUR)能改变观察到的分子谱，这是因为肿瘤物质已从膀胱的上皮壁部分或完全地物理除去。尽管在该研究中没有排除囊切除术的情况，这是因为数据不是决定性的，建议在新群体的分析中不包括这些样品种类。实施例6最终预后模型的开发 尽管最重要的关心事件是肿瘤预测(诊断预测)，还对分类不同肿瘤类型有兴趣(预后预测)，这是本节的主要目的。该分类能允许进一步在各情况下的个性化治疗。
肿瘤分类目前基于病理解剖实验室中的宏观和微观观察。它们的分类通过基于肿瘤深度和细胞微观外观的大致标准化观察决定。近来的分子研究看来表明实际上有主要区分浅表性类型肿瘤和浸润性肿瘤的两种不同基因谱。 为进行预后分类模型，必须正确区分肿瘤组的不同组。病理解剖观察并不保证与样品在分子水平下的行为匹配，因此仅从该分类派生预后模型看来不是好主意。除了考虑病理解剖学(AP)级别以外，选择使用通过无监督聚类的分类系统(其主要区分样品至2个大组)。 作为有效浅表性肿瘤样品组，对于它们有必要根据相应于它们的组中的聚类来聚
22类到一起，而且根据AP它们为低级别Ta、Tl肿瘤而与原位癌(cis)无关。浸润性肿瘤属于
相应的聚类组，而且根据AP它们为高级别Tl、 T2、 T3或T4肿瘤以及任何存在CIS的肿瘤。 在定义为浅表性肿瘤的样品组中，分类308种肿瘤中的129种。在定义为浸润性
肿瘤的组中，分类308种肿瘤中的IOO种。最后，79种肿瘤样品具有它们的病理解剖学分类
和它们的分子谱之间的不一致，或者并未明确定义为两种主要聚类组内。 用于创造能区别浅表性和浸润性肿瘤的模型的方法与实施例5中用于获得诊断
模型的方法完全相同。 当采用48种基因应用贝氏理论时，获得良好的分类(SN = 0. 97和SP = 0. 96)。
通过分析频率直方图能观察到，用于诊断的感兴趣基因与预后基因在相当程度上 重合。然而，存在一些基因(MCM10和ASAM)不适于诊断却适于预后，因此将这两种基因添 加至12种预先选择的基因。所得具有14种基因的模型证实几乎完美地作业(SN = 0. 99 和SP = 1. 00)。表1包括这14种基因，其包括选择用于TaqMan Low Density Array微流 卡的基因符号禾口 TaqMan Gene Expression Assay名称。表lTaqMan Gene基因符号Expression AssayANXA10Hs00200464mlC14orf78Hs00746838slCTSEHs00157213mlCRHHs00174941mlIGF2Hs00171254mlKLF9Hs00230918mlKRT20Hs00300643mlMAGEA3Hs00366532mlPOSTNHs00170815mlPPP1R14DHs00214613mlSLC1A6Hs00192604mlTERTHs00162669mlASAMHs00293345mlMCM10Hs00218560ml
权利要求
一种体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法，其包括a.从受试者收集膀胱液样品；b.检测和定量所述膀胱液样品中ANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPP1R14D、SLC1A6、TERT、ASAM和MCM10基因的组合的表达模式；和c.将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
2. 根据权利要求1的体外非侵入性方法，其特征在于所述膀胱液样品是尿。
3. —种体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测和定量所述膀胱液样品中ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的组合的表达模式；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
4. 一种体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测和定量所述膀胱液样品中选自C14orf78、 KLF9、 POSTN、 PPP1R14D、 ASAM及其组 合的基因的表达；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
5. 根据权利要求4的方法，包括C14orf78基因的检测和定量。
6. 根据权利4的方法，包括KLF9基因的检测和定量。
7. 根据权利4的方法，包括POSTN基因的检测和定量。
8. 根据权利4的方法，包括PPPIR14D基因的检测和定量。
9. 根据权利4的方法，包括ASAM基因的检测和定量。
10. 根据权利4-9任一项的方法，另外包括至少一种选自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10的基因的检测和定量。
11. 一种体外非侵入性膀胱癌诊断方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测和定量所述膀胱液样品中ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6和TERT基因的组合的表达模式；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
12. —种体外侵入性膀胱癌诊断方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测并定量所述膀胱液样品中ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和 TERT基因的组合的表达模式；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
13. —种体外非侵入性膀胱癌诊断方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测和定量所述膀胱液样品中选自C14orf78、KLF9、P0STN、PPPlR14D及其组合的基 因的表达；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
14. 根据权利要求13的方法，包括C14orf78基因的检测和定量。
15. 根据权利要求13的方法，包括KLF9基因的检测和定量。
16. 根据权利要求13的方法，包括POSTN基因的检测和定量。
17. 根据权利要求13的方法，包括PPPIR14D基因的检测和定量。
18. 根据权利要求13-17任一项的方法，另外包括至少一种选自ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和TERT的基因的检测和定量。
19. 一种体外非侵入性膀胱癌预后方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测和定量所述膀胱液样品中ASAM和MCM10基因的组合的表达模式；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
20. —种体外非侵入性膀胱癌预后方法，其包括a. 从受试者收集膀胱液样品；b. 检测和定量所述膀胱液样品中ASAM基因的表达；禾口c. 将在步骤b)中得到的结果与膀胱液中所述基因的常规参考值比较。
21. 根据前述权利要求任一项的方法，其特征在于b)中基因表达的定量通过定量实时 PCR进行。
22. ANXA10、C14orf78、CTSE、CRH、IGF2、KLF9、KRT20、MAGEA3、POSTN、PPPlR14D、SLClA6、 TERT、ASAM和MCM10基因的组合作为膀胱癌诊断和/或预后标记物的用途。
23. ANXA10、CTSE、CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的组合作为膀 胱癌诊断和/或预后标记物的用途。
24. 选自C14orf78、KLF9、POSTN、PPPlR14D、ASAM及其组合的基因作为膀胱癌诊断和/ 或预后标记物的用途。
25. 根据权利要求24的用途，其中C14orf78基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。
26. 根据权利要求24的用途，其中KLF9基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。
27. 根据权利要求24的用途，其中POSTN基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。
28. 根据权利要求24的用途，其中PPP1R14基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。
29. 根据权利要求24的用途，其中ASAM基因作为膀胱癌诊断和/或预后标记物。
30. 选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其组合的基因与至少一种选自 ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT及MCM10的基因的组合作为膀胱癌 诊断和/或预后标记物的用途。
31. ANXA10 、 C14orf78 、 CTSE、 CRH、IGF2 、 KLF9 、 KRT20 、 MAGEA3 、 P0STN、 PPP1Rl4D、 SLC1A6 和TERT基因的组合作为膀胱癌诊断标记物的用途。
32. ANXA10、CTSE、CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、 SLC1A6和TERT基因的组合作为膀胱癌诊 断标记物的用途。
33. 选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其组合的基因作为膀胱癌诊断标记物的 用途。
34. 根据权利要求33的用途，其中C14orf78基因作为膀胱癌诊断标记物.
35. 根据权利要求33的用途，其中KLF9基因作为膀胱癌诊断标记物。
36. 根据权利要求33的用途，其中POSTN基因作为膀胱癌诊断标记物。
37. 根据权利要求33的用途，其中PPP1R14D基因作为膀胱癌诊断标记物。
38. 选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其组合的基因与至少一种选自ANXAIO、 CTSE、CRH、 IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6及TERT的基因的组合作为膀胱癌诊断标记物的用 途。
39. ASAM和MCM10基因的组合作为膀胱癌预后标记物的用途。
40. ASAM基因作为膀胱癌预后标记物的用途。
41. 一种用于实施权利要求1的方法的膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，包括一组探 针，所述一组探针适于ANXAIO、 C14orf78、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KLF9、 KRT20、 MAGEA3、 P0STN、 PPP1R14D、 SLC1A6、 TERT、 ASAM和MCM10基因的组合的表达模式的检测和定量。
42. —种用于实施权利要求3的方法的膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，包括一组探针， 所述一组探针适于ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6、 TERT和MCM10基因的 组合的表达模式的检测和定量。
43. —种用于实施权利要求4的方法的膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，包括一组探针， 所述一组探针适于选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其组合的基因的检测和 定量。
44. 一种用于实施权利要求10的方法的膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，包括一组探针， 所述一组探针选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D、 ASAM及其组合的基因以及至少一种 选自ANXA10、CTSE、CRH、IGF2、KRT20、MAGEA3、SLC1A6、TERT及MCMIO的基因的检测和定量。
45. —种用于实施权利要求11的方法的膀胱癌诊断试剂盒，包括一组探针，所述一组 探针适于ANXA10 、 C14orf 78 、 CTSE、 CRH、 IGF2 、KLF9 、KRT20 、MAGEA3 、P0STN、PPP1 Rl4D、 SLC1A6 和TERT基因的组合的表达模式的检测和定量。
46. —种用于实施权利要求12的方法的膀胱癌诊断试剂盒，包括一组探针，所述一组 探针适于ANXAIO、 CTSE、 CRH、 IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6和TERT基因的组合的表达模式 的检测和定量。
47. —种用于实施权利要求13的方法的膀胱癌诊断试剂盒，包括一组探针，所述一组 探针适于选自C14orf78、KLF9、POSTN、PPPlR14D及其组合的基因的检测和定量。
48. —种用于实施权利要求18的方法的膀胱癌诊断试剂盒，包括一组探针，所述一 组探针适于选自C14orf78、 KLF9、 P0STN、 PPP1R14D及其组合的基因以及至少一种选自 ANXAIO、 CTSE、 CRH， IGF2、 KRT20、 MAGEA3、 SLC1A6及TERT的基因的检测和定量。
49. 一种用于实施权利要求19的方法的膀胱癌预后试剂盒，包括一组探针，所述一组 探针适于ASAM和MCM10基因的组合的表达模式的检测和定量。
50. —种用于实施权利要求20的方法的膀胱癌预后试剂盒，所述试剂盒包括适于ASAM 基因检测和定量的探针。
全文摘要
本发明涉及体外非侵入性膀胱癌诊断和/或预后方法，其基于膀胱液中作为所述疾病遗传标记物的某些基因和/或其组合的基因表达的检测和定量。还预期膀胱癌诊断和/或预后试剂盒，其基于使用适于所述基因的表达模式的检测和定量的一组探针。
文档编号C12Q1/68GK101730848SQ200780053065
公开日2010年6月9日 申请日期2007年6月5日 优先权日2007年3月20日
发明者依丽萨贝·阿尔斯·克里阿克, 安东尼奥·阿尔瓦雷斯·阿森西奥, 洛雷德斯·门瓜尔·布里切斯, 玛丽亚·何塞·纳瓦·卡帕罗斯, 莫伊塞斯·布尔塞特·阿尔瓦雷达 申请人:因达斯生物有限公司