专利名称：变异鳞毛蕨的孢子繁殖方法
技术领域：
本发明涉及蕨类植物的孢子繁殖方法，具体地说是涉及一种能快速繁殖变异鳞毛蕨 (D 70/7to7;y(L.) Ktunze)的孢子繁殖方法。
背景技术：
变异鳞毛蕨为中型草本植物，在我国热带及亚热带地区有广泛分布，其林下土生，通常 高40 80cm，株形美观，叶色暗绿，四季常青，不但可开发成为具有观赏价值的观叶植物， 而且其根茎有清热止痛的药效，可以入药，因此这种蕨类植物具有良好的市场开发价值。但 是目前关于繁殖变异鳞毛蕨的研究极少。
发明内容
本发明的目的在于开发出一种能快速繁殖变异鳞毛蕨的方法。
我们通过将消毒过的变异鳞毛蕨孢子在孢子萌发培养基中进行培养得到片状原叶体，然 后将原叶体依次在增殖培养基、孢子体诱导培养基、孢子体继代培养基中进行培养，待长出
孢子叶后转入孢子体生根培养基中培养，待基部长出细根就可以出瓶移植，全过程只需半年 左右，从而实现了本发明的目的。
本发明的变异鳞毛蕨的孢子繁殖方法，其特征包括以下的步骤
(1) 收集变异鳞毛蕨孢子，先在酒精中浸泡25 30s，然后再在升汞溶液中浸泡7 8min， 消毒后用无菌水漂洗；
(2) 将上述消毒过的变异鳞毛蕨孢子用无菌水配成悬浮液，加入孢子萌发培养基中，在 温度23 25 °C，光照强度2000 2500 lx，光照时间11 13 h/d条件下培养，先萌发出绿色 丝状体，再发育成片状原叶体，所述的孢子萌发培养基是每升含6 8g琼脂，18 22g蔗糖， 其余为MS或1/2MS， pH 5. 7 5. 8的培养基；
(3) 将上述片状原叶体转接到增殖培养基中，在温度23 25"C，光照强度2000 2500 lx， 光照时间11 13h/d条件下，培养25 35d后，转入孢子体诱导培养基中，在温度23 25T， 光照强度2000 2500 lx，光照时间11 13 h/d条件下，培养至原叶体出芽后转入孢子体继 代培养基，在温度23 25X，光照强度2000 2500 lx，光照时间11 13 h/d条件下，培养 至形成幼孢子体，长出2 3片幼孢子叶；所述的增殖培养基每升中含有6-苄基嘌呤0. 15 0.25 mg，萘乙酸0. 15 0.25mg，琼脂6 8g，蔗糖28 32g，其余为MS， pH 5.7 5.8;所 述的孢子体诱导培养基每升中含有激动素6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4 0.6mg，萘乙酸O. 15 0. 25mg，琼脂6 8g，蔗糖28 32g，其余为MS， pH 5.7 5.8;所述的孢子体继代培养基每升中含有萘乙酸0.05 0. 15mg，琼脂6 8g，蔗糖28 32g，其余为 MS， pH 5. 7 5. 8;
(4)将上述幼孢子体分株转接到孢子体生根培养基上，在温度23 25t，光照强度2000 2500 lx，光照时间11 13 h/d条件下，培养至幼孢子体基部长出褐色带鳞片的细根时，可 出瓶移栽，炼苗后移栽至pH值为6.3 6.4的土壤基质培养，所述的孢子体生根培养基每升 中含有萘乙酸0.25 0.35mg，活性碳4 6g，琼脂6 8g，蔗糖28 32g，其余为1/2MS培养 基，pH 5. 7 5. 8。
歩骤(l)中采用的酒精和升汞是植物材料通用的消毒剂， 一般使用浓度酒精为体积分数 75%，升荥为lg/L，最好消毒用无菌水漂洗5次。 歩骤(2)所述的光照的光源可以是日光灯。
步骤(3)所述的片状原叶体在转入孢子体诱导培养基后35 45d形成出芽的原叶体，所述 的原叶体在转入孢子体继代培养基15 25d形成幼孢子体，长出2 3片幼孢子叶，所述的增 殖培养基，孢子体诱导培养基和孢子体继代培养基的光照的光源可以是日光灯。
步骤(4)所述的光照的光源可以是日光灯，所述的炼苗时间为3 4d，所述的土壤基质 可以由花卉土，菜园泥和素沙按体积比2:1:1混合得到，也可以由塘泥、碎木、腐殖土和细 沙等混合得到。
歩骤(2)、 (3)中所述的MS为国际通用的培养基，其成分和配制方法参看文献(谭文澄、 戴策刚主编.观赏植物组织培养技术.北京中国林业出版社1991.);步骤(2)、 (4)中所述 的1/2 MS是将MS中的大量元素浓度减半，而其他成分浓度不变而形成的培养基。
本发明投入少，设备简单，并有效地縮短了变异鳞毛蕨孢子的繁殖周期，从孢子萌发到 幼孢子体形成仅需110d左右，获得大量种苗，幼孢子苗成活率可达90%，使变异鳞毛蕨成为 优良的观叶植物并发挥其药用价值。
具体实施例方式
以下实施例是对本发明的进一歩说明，但本发明不限于以下实施例。 实施例1:
剪取成熟的孢子叶，将孢子从叶缘小心的刮下，将收集的孢子(约O. lg)用滤纸包好， 在超净工作台上用lOmL体积分数75%的酒精浸泡25s，再放入10mL lg/L的升汞溶液中消 毒7min，无菌水漂洗5次，洗净升汞，最后放在无菌的培养皿中待用。
将MS培养基、6g琼脂和18g蔗糖制成pH 5. 7 5. 8的MS孢子萌发培养基1L,并将制成 的培养基分装到150mL或200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基约15mL，室温冷却后待用。
将无菌孢子用3mL无菌水配成悬浮液，用无菌的移液管取0. 2mL滴加入准备好的培养瓶 中，轻微摇动培养瓶，使孢子均匀分布在孢子萌发培养基上。培养温度为23 25'C，光照强度2000 2500 lx，光源为日光灯，光照时间11 13 h/d。在25 30d时孢子萌发培养基显 绿，孢子大量萌发出绿色丝状体。
将6-苄基嘌呤0. 15mg，萘乙酸0. 15mg，琼脂6g，蔗糖28g和MS配制成pH 5. 7 5. 8 的增殖培养基1L;将激动素6-糠基氨基嘌呤0.4mg，萘乙酸O. 15mg，琼脂6g，蔗糖28g和 MS配成pH5. 7 5.8孢子体诱导培养基1L;将萘乙酸0.05mg，琼脂6g，蔗糖28g和MS配成 pH 5. 7 5. 8的孢子体继代培养基1L。将制成的三种培养基分别加注到150mL或200mL培养 瓶中，每瓶约加入培养基约15mL，室温冷却后待用。
孢子萌发后,原叶体在孢子萌发培养基上均生长良好，约30d后发育成片状结构，将片 状原叶体转接到原叶体增殖培养基上，培养温度为23 25'C，光照强度2000 2500 lx，光 源为日光灯，光照时间11 13h/d。 30d后，原叶体增殖培养基中的原叶体增殖明显，不仅加 宽伸长显著，而且原叶体中间及顶端处明显加厚，此时，将原叶体转接入孢子体诱导培养基 中，培养温度为23 25°C，光照强度2000 2500 lx，光源为日光灯，光照时间11 13 h/d， 原叶体顶端不断加厚，约40d后，原液体顶端诱导出芽，l片原叶体顶端通常有3 4个芽。 将已出芽的原叶体转入孢子体继代培养基中继代培养，培养温度为23 25°C，光照强度 2000 2500 lx,光源为日光灯，光照时间11 13h/d，原叶体不再增殖加厚，原叶体上的芽 不断生长，约20d后，芽陆续长出幼孢子叶，大量幼孢子体形成。从孢子萌发到幼孢子体形 成仅需110d左右。
将萘乙酸0.25mg，活性碳4g，琼脂6g，庶糖28g, 1/2MS培养基制成pH 5. 7 5. 8的孢 子体生根培养基1L，将制成的培养基分装到150mL或200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基约 15ml，室温冷却后待用。
待幼孢子体长出2 3片幼孢子叶时，将其分株转接到孢子体生根培养基上，每瓶培养 基接种约10株幼孢子体，培养温度为23 25'C，光照强度2000 2500 lx，光源为日光灯， 光照时间11 13 h/d。经过30d的生长，幼孢子体叶片逐渐长大，幼孢子体基部开始长出纤 细的根，根多而密。待幼孢子体长出3 4片幼孢子叶，基部长出较多褐色带鳞片的细根时， 可出瓶移栽。将培养瓶从培养室内移植温室内，置于自然光下敞瓶炼苗3d。移栽时，将幼孢 子体从瓶中取出，小心洗净根部附着的培养基，移栽至高温灭菌的混合土壤基质(土壤基质 由花卉土，菜园泥和素沙按体积比2:1:1混合得到)，移栽后，注意喷雾保湿。25 35d后， 幼孢子苗成活率达90%。
实施例2:
剪取成熟的孢子叶，将孢子从叶缘小心的刮下，将收集的孢子(约O. lg)用滤纸包好， 在超净工作台上用10mL体积分数75。/。的酒精浸泡30s，再放入10mL lg/L的升汞溶液中消毒 8min，无菌水漂洗5次，洗净升汞，最后放在无菌的培养皿中待用。将1/2MS和8g琼脂和22g蔗糖制成pH 5. 7 5. 8的1/2MS孢子萌发培养基1L，将制成 的培养基分装到150mL或200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基15mL，室温冷却后待用。
将无菌孢子用3mL无菌水配成悬浮液，用无菌的移液管取0. 2mL滴加入准备好的孢子萌 发培养瓶中，轻微摇动培养瓶，使孢子均匀分布在培养基上，培养温度为23 25'C，光照强 度2000 2500 lx，光源为日光灯，光照时间11 13 h/d。在25 30d时孢子萌发培养基显 绿，孢子大量萌发出绿色丝状体。
将6-苄基嘌呤0. 25mg，萘乙酸0. 25mg,琼脂8g，蔗糖32g和MS配成pH 5. 7 5. 8的 增殖培养基1L;将激动素N6-呋喃甲基腺嘌呤0.6mg，萘乙酸0.25mg，琼脂8g，蔗糖32g和 MS配成pH5.7 5.8孢子体诱导培养基1L;将萘乙酸O. 15mg，琼脂8g，蔗糖32g和MS配成 PH 5. 7 5. 8的孢子体继代培养基1L。将制成的三种培养基分别分装到150mL或200mL培养 瓶中，每瓶约加入培养基约15mL，室温冷却后待用。
孢子萌发后，原叶体在1/2MS孢子萌发培养基上均生长良好，约30d后发育成片状结构， 将片状原叶体转接到原叶体增殖培养基上，培养温度为23 25'C,光照强度2000 2500 lx， 光源为日光灯，光照时间11 13 h/d。约30d后原叶体增殖培养基中的原叶体增殖明显，不 仅加宽伸长显著，而且原叶体中间及顶端处明显加厚，此时，将原叶体转接入孢子体诱导培 养基中，培养温度为23 25°C ，光照强度2000 2500 lx，光源为日光灯，光照时间11 13h/d， 原叶体顶端不断加厚，约40d后原液体顶端诱导出芽，l片原叶体顶端通常有3 4个芽。将 已出芽的原叶体转入孢子体继代培养基中继代培养，培养温度为23 25'C，光照强度2000 2500 lx，光源为日光灯，光照时间11 13 h/d，原叶体不再增殖加厚，原叶体上的芽不断 生长，约20d后芽陆续长出幼孢子叶，大量幼孢子体形成。从孢子萌发到幼孢子体形成仅需 110d左右。
将萘乙酸0.35mg，活性碳6g，琼脂8g，蔗糖32g， 1/2MS培养基制成pH 5. 7 5. 8的孢 子体生根培养基1L，将制成的培养基加注到150mL或200mL培养瓶中，每瓶约加入培养基 15mL，室温冷却后待用。
待幼孢子体长出2 3片幼孢子叶时，将其分株转接到孢子体生根培养基上，每瓶培养 基接种约10株幼孢子体，培养温度为23 25'C，光照强度2000 2500 lx，光源为日光灯， 光照时间11 13h/d。经过约30d的生长，幼孢子体叶片逐渐长大，幼孢子体基部开始长出 纤细的根，根多而密。待幼孢子体长出3 4片幼孢子叶，基部长出较多褐色带鳞片的细根时， 可出瓶移栽。将培养瓶从培养室内移植温室内，置于自然光下敞瓶炼苗4d。移栽时，将幼孢 子体从瓶中取出，小心洗净根部附着的培养基，移栽至高温灭菌的混合土壤基质，移栽后， 注意喷雾保湿。约25 35d后，幼孢子苗成活率达90%。
权利要求
1.一种变异鳞毛蕨的孢子繁殖方法，其特征包括以下的步骤(1)收集变异鳞毛蕨(Dryopteris varia(L.)Ktunze)孢子，先在酒精中浸泡25～30s，然后再在升汞溶液中浸泡7～8min，消毒后用无菌水漂洗；(2)将上述消毒过的变异鳞毛蕨孢子用无菌水配成悬浮液，加入孢子萌发培养基中，在温度23～25℃，光照强度2000～2500lx，光照时间11～13h/d条件下培养，先萌发出绿色丝状体，再发育成片状原叶体，所述的孢子萌发培养基是每升含6～8g琼脂，18～22g蔗糖，其余为MS或1/2MS，pH 5.7～5.8的培养基；(3)将上述片状原叶体转接到增殖培养基中，在温度23～25℃，光照强度2000～2500lx，光照时间11～13h/d条件下，培养25～35d后，转入孢子体诱导培养基中，在温度23～25℃，光照强度2000～2500lx，光照时间11～13h/d条件下，培养至原叶体出芽后转入孢子体继代培养基，在温度23～25℃，光照强度2000～2500lx，光照时间11～13h/d条件下，培养至形成幼孢子体，长出2～3片幼孢子叶；所述的增殖培养基每升中含有6-苄基嘌呤0.15～0.25mg，萘乙酸0.15～0.25mg，琼脂6～8g，蔗糖28～32g，其余为MS，pH 5.7～5.8；所述的孢子体诱导培养基每升中含有激动素6-糠基氨基嘌呤或N6-呋喃甲基腺嘌呤0.4～0.6mg，萘乙酸0.15～0.25mg，琼脂6～8g，蔗糖28～32g，其余为MS，pH 5.7～5.8；所述的孢子体继代培养基每升中含有萘乙酸0.05～0.15mg，琼脂6～8g，蔗糖28～32g，其余为MS，pH 5.7～5.8；(4)将上述幼孢子体分株转接到孢子体生根培养基上，在温度23～25℃，光照强度2000～2500lx，光照时间11～13h/d条件下，培养至幼孢子体基部长出褐色带鳞片的细根时，可出瓶移栽，炼苗后移栽至pH值为6.3～6.4的土壤基质培养，所述的孢子体生根培养基每升中含有萘乙酸0.25～0.35mg，活性碳4～6g，琼脂6～8g，蔗糖28～32g，其余为1/2MS培养基，pH 5.7～5.8。
2. 根据权利要求1所述的一种变异鳞毛蕨的孢子繁殖方法，其特征是步骤(l)中所述的 酒精为体积分数75%，升汞为lg/L，消毒后用无菌水漂洗5次，步骤(4)所述的炼苗时间为3 4天，所述的土壤基质是由花卉土，菜园泥和素沙按体积比2:1:1混合得到或由塘泥、碎木、 腐殖土和细沙混合得到。
全文摘要
本发明涉及一种能快速繁殖变异鳞毛蕨(Dryopteris varia(L.)Ktunze)的孢子繁殖方法，其特征是将消毒过的变异鳞毛蕨孢子在孢子萌发培养基中培养至发育成片状原叶体，然后将原叶体依次在增殖培养基培养约30天，孢子体诱导培养基中培养约40天，孢子体继代培养基中培养约20天，待形成幼孢子体，长出2～3片幼孢子叶后转入孢子体生根培养基中培养约30天，待基部长出褐色带鳞片的细根就出瓶移植，炼苗后移栽至土壤基质培养。本发明投入少，设备简单，从孢子萌发到幼孢子体形成仅需110d左右，短的时间内获得大量变异鳞毛蕨种苗，幼孢子苗成活率可达90％，使变异鳞毛蕨能成为优良的观叶植物并发挥其药用价值。
文档编号C12N5/04GK101297635SQ200810029109
公开日2008年11月5日 申请日期2008年6月30日 优先权日2008年6月30日
发明者唐源江, 欧阳婵娟, 王瑞江, 董仕勇 申请人:中国科学院华南植物园