专利名称：：利用铵离子调控林可霉素发酵过程及提高林可霉素产量的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物发酵领域，更具体地，本发明涉及一种优化的林可霉素发酵生产方法。
背景技术：
：林可霉素(Lincomycin)属林可胺类抗生素，林可链霉菌(5Yre;z^历7ce51"/7C0^7e7^A，5".7i/cW/7e/L5i5)生产林可霉素的发酵过程非常复杂，其生物合成路线目前尚不清楚，仅有文献报道过推测的途径。目前，仅有在摇瓶规模上关于林可霉素发酵过程影响因素的研究，但由于混合和取样等方面的限制，使得摇瓶发酵既不能充分发挥林可链霉菌的生产潜力，又不能及时反馈发酵过程的动态调节信息。而目前还没有在较大规模的生物反应器中对林可霉素发酵的影响因素进行研究的报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种优化的林可霉素发酵生产方法。在本发明的第一方面，提供一种利用林可链霉菌发酵生产林可霉素的方法，所述方法包括(1)调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57土5mmol/L，在适宜条件下培养林可链霉菌；(2)当发酵培养基中铵离子浓度为0.2-1.5mmol/L时，补加铵离子，之后控制发酵培养基中铵离子浓度2-5mmol/L至发酵结束。在另一优选例中，当发酵培养基中铵离子浓度为0.5-lmmol/L时，补加铵离子。在另一优选例中，调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57土3mraol/L;更优选的是57土2誦ol/L;最优选的是57±lmmol/L。在另一优选例中，补加铵离子之后控制发酵培养基中铵离子浓度为3-4tnmol/L。在另一优选例中，在步骤(2)中，通过补加硫酸氨来调节铵离子浓度。在另一优选例中，调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±lmmol/L;优选的是57±0.5mmol/L;在培养第20-24小时，当氨基氮[NH2-N]《0.35g/L时，补加硫酸铵1.067g/L培养基；在培养第2440小时，当氨基氮《0.55g/L时，补加硫酸铵0.8g/L培养基；在培养第40140小时，当氨基氮《0.55g/L时，补加硫酸铵0.533g/Li肯养基；在培养第140小时放罐，当氨基氮《0.55g/L时，补加硫酸铵0.267g/L培养基。在另一优选例中，初始发酵培养基中硝酸铵为2±0.2g/L，硫酸铵3±0.2g/L。优选的，初始发酵培养基中硝酸铵为2±0.lg/L，硫酸铵3±0.lg/L;更优选的，初始发酵培养基中硝酸铵为2±0.05g/L，硫酸铵3±0.05g/L。在另一优选例中，初始发酵培养基中含有以下成分淀粉6土lg/L，葡萄糖47士5g/L，黄豆饼粉28土3g/L，玉米浆12土lg/L，氯化钠5土0.5g/L，硝酸钠6±0.5g/L，磷酸二氢钾0.3±0.03g/L，碳酸钙8±0.8g/L，硝酸铵2±0.2g/Lg/L，硫酸铵3±0.2g/L。优选的，初始发酵培养基中含有淀粉6±0.5g/L，葡萄糖47±2.5g/L，黄豆饼粉28±1.5g/L，玉米浆12±0.5g/L，氯化钠5±0.25g/L，硝酸钠6±0.25g/L，磷酸二氢钾0.3±0.015g/L，碳酸钙8±0.4g/L,硝酸铵2±0.lg/Lg/L，硫酸铵3±0.lg/L。在另一优选例中，在发酵过程中还补加葡萄糖和玉米浆。优选的，在采用初始的发酵培养基进行培养后，当测定出还原糖含量在5g/L培养基以下时开始补糖，20-40小时，按20±2g/L-h补加葡萄糖；40-140小时，按10土lg/L'h补加葡萄糖;140-结束，按5土0.5g/L'h补加葡萄糖。优选的，在发酵起始后80-168小时补玉米浆，补加速率为0.2g/Lh。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(3)从发酵培养基中分离林可霉素。在另一优选例中，发酵培养基中每分钟空气的通气量是1.4±0.3L/L;优选1.4±0.2L/L;更优选1.4±0,1L/L。在另一优选例中，发酵培养的培养温度是30±2°C;优选30士rC;更优选30士0.5°C。在另一优选例中，培养的时间是150-200小时。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了不同培养方式下林可链霉菌发酵液中铵离子的含量变化。图2显示了不同培养方式下第1次补糖前发酵液总糖含量的变化。图3显示了不同培养方式下林可链霉菌菌浓(DCW)与生物效价变化图。图4显示了不同培养方式下前50h发酵液的在线摄氧率(0UR)变化图。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究和试验，首次在较大规模水平上研究了林可链霉菌发酵生产林可霉素的影响因素，总结出了一种优化的林可霉素发酵生产方法。利用本发明的方法可使得林可链霉菌生长良好，林可霉素的产量大大提高，生物效价达到7000U/ml以上。在此基础上完成了本发明。本发明人在研究中发现，铵离子(NH4+)作为一种微生物易利用的氮源，在林可链霉菌的大规模发酵生产林可霉素过程中是影响产量的关键因素。并且，在发酵的不同时间段铵离子的添加方法和加入量是影响发酵过程至关重要的因素。也即并非在整个过程中始终控制相同的铵离子浓度才能获得良好的效果。因此，本发明提供一种利用林可链霉菌发酵生产林可霉素的方法，所述方法包括(1)调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±5mmol/L，在适宜的条件下培养林可链霉菌；(2)当发酵培养基中铵离子浓度为O.2-1.5mmol/L时，补加铵离子，之后控制发酵培养基中铵离子浓度2-5mmol/L至发酵结束。本发明人在研究中发现，林可链霉菌氨同化铵离子主要经丙氨酸脱氢酶(ADH)途径和谷氨酰胺合成酶(GS)/谷氨酸合酶途径，在发酵开始的一段时间(约14h)，ADH保持较高的酶活力，而GS的酶活力较小，主要依靠ADH对铵离子进行同化，此期间，菌浓(DCW)迅速增加，林可霉素的合成受抑制，在随后的发酵过程中，应将铵离子限制在较低浓度状态，此时ADH的酶活力受抑制，而GS的酶活力较高，利于林可霉素的合成。若基础培养基中铵离子含量过高或发酵过程中铵离子补入速率太大，则会抑制蛋白水解酶及淀粉水解酶的活性，并抑制GS的活性。发酵前期，在发酵培养基中铵离子浓度降低到0.2-1.5mmol/L并补加铵离子后，林可霉素效价可较快升高，原因在于补铵离子前菌体将铵离子消耗至较低浓度，解除了高浓度的铵离子对GS的抑制作用，而GS是菌体合成抗生素时参与细胞成分如细胞壁、蛋白质、酶和辅酶的维持代谢的关键酶，它的酶活力大小与林可霉素的产量呈正相关；补加铵离子之后，将发酵液中的铵离子浓度控制在25mmol/L范围内，可使GS的酶活力稳定在较高水平；而如果补入铵离子量过多，GS的活性则将被高浓度的铵离子抑制。同时，铵离子被同化后发酵液中将生成氢离子(H+)，使pH降低，在低pH值条件下，糖代谢酶的活性可能会受到抑制，因而需要控制铵离子的加入量。当加入铵离子过少时，由于铵离子浓度太低，GS对铵离子同化生成谷氨酰胺的速率较小，而谷氨酰胺是细胞壁、蛋白质和酶等合成的首选供体，从而导致林可链霉菌生产迟缓及林可霉素的产量降低。作为本发明的优选方式，当发酵培养基中铵离子浓度为0.5-lmmol/L时，补加铵离子。作为本发明的优选方式，补加铵离子之后控制发酵培养基中铵离子浓度为3-4mmol/L。作为本发明的优选方式，调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±3mmol/L;更优选的是57±2mmol/L;最优选的是57±lmmol/L。本发明的方法中，可以选择合适的无机氮源作为铵离子的供体。作为本发明的优选方式，所述的铵离子来源于硫酸铵和硝酸氨。优选的，初始发酵培养基中硝酸铵为2±0.2g/L，硫酸铵3土0.2g/L;更优选的，初始发酵培养基中硝酸铵为2±0.lg/L,硫酸铵3±0.lg/L;进一步优选的，初始发酵培养基中硝酸铵为2士0.05g/L，硫酸铵3±0.05g/L。在一个优选的实施方案中，在后续的培养过程中，不补加硝酸氨而仅通过补加硫酸氨来调节铵离子浓度。作为本发明的一种优选方式，所述方法是调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±lmmol/L(优选的是57±0.5誦ol/L);在培养第20-24小时，当[跳-N]《0.35g/L时，硫酸铵补加量为1.067g/L;在培养第2440小时，当NH2-N]《0.55g/L时，硫酸铵补加量为0.8g/L;在培养第40140小时，当[NH厂N]《0.55g/L时，硫酸铵补加量0.533g/L;在培养第140小时放罐，当[NH2-N]《0.55g/L时，硫酸铵补加量O.267g/L。在发酵培养结束后，还可包括步骤从发酵培养基中分离林可霉素。从培养产物中分离或纯化林可霉素可采用本领域技术人员熟知的技术。例如可采用硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose离子交换、UltrogelAcA34凝胶过滤三步法纯化；或采用Ni-IDA亲和层析一步法纯化。用于配制发酵培养基的其它原料(如碳源、磷源、有机氮源、无机盐、微量元素)及其使用量均可根据本领域常规用于发酵生产林可霉素的原料及使用量而定。作为本发明的优选方式，初始发酵培养基中含有以下成分淀粉6±lg/L，葡萄糖47±5g/L，黄豆饼粉28±3g/L，玉米浆12±lg/L，氯化钠5±0.5g/L，硝酸钠6±0.5g/L，磷酸二氢钾O.3±0.03g/L，碳酸钙8±0.8g/L，硝酸铵2士0.2g/Lg/L，硫酸铵3土0.2g/L;在发酵过程中，当测定出还原糖含量在5g/L培养基以下时开始补糖，20-40小时，按20士2g/L'h补加葡萄糖；40-140小时，按10土lg/L'h补加葡萄糖;140-结束，按5±0.5g/L'h补加葡萄糖；在发酵起始后80-168小时补玉米浆，补加速率为0.2g/Lh。培养林可链霉菌的其它条件，如温度、湿度、通气量等，可采用本领域已知的条件。作为本发明的优选方式，发酵培养基中空气的通气量是1.4土0.3L/L培养基；优选1.4±0.2L/L;更优选1.4±0.1L/L。作为本发明的优选方式，发酵培养的培养温度是30土2。C;优选30±1。C;更优选30土0.5°C。作为本发明的优选方式，培养的时间是150-200小时。在本发明的实施例中，本发明人采用50L全自动控制发酵罐，以林可链霉菌L-427为生产菌发酵生产林可霉素。在50L发酵罐中采用4种硫酸铵补料工艺发酵制备林可霉素。将林可霉素的发酵生产过程分为初期(024h)、前期(2440h)、中期(40140h)和后期(140h放罐)，通过多参数的采集与分析，从而找出了铵离子对林可霉素生物合成过程产生重要影响的规律。与采用小规模培养(如摇瓶培养)方法来分析培养基各因素对发酵的影响相比，本发明更加准确，更能够反映现实发酵生产中的规律。本发明的主要优点在于(1)首次在较大规模水平上研究了林可链霉菌发酵生产林可霉素的影响因素，总结出了一种优化的林可霉素发酵生产方法，利用该方法可使得林可链霉菌生长良好，林可霉素的产量大大提高，生物效价达到7000U/ml以上，而现有技术中目前可达到的较好的生物效价仅为约3000U/ml。(2)本发明人揭示了不同时间段上添加铵离子的较佳方式，可操作性强，有利于指导实际生产。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。仪器与材料1.仪器与试剂FUS-50L多参数全自动控制发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)。林可霉素标准品(Sigma公司)。2.菌种与培养基林可f连毒菌(5Yrepz^/zyces^Vco7/7e/7W^)L—427禾口藤黄八叠球菌(5krci"a7〃t朋，CMCC(B)28001)均购自江西国药有限责任公司。种子培养基(g/L):淀粉18.7，葡萄糖24.3，黄豆饼粉22.3，硝酸铵1.33，硫酸铵2，玉米浆26，碳酸钙7，氯化钠0.7，磷酸二氢钾0.045，硝酸钠0.85。发酵培养基(g/L):淀粉6，葡萄糖47，黄豆饼粉28，玉米浆12,氯化钠5，硝酸钠6，磷酸二氢钾0.3,碳酸钙8，硝酸铵2，硫酸铵(F1罐7，F2、F3、F4罐均为3)，配料体积24L。在发酵过程中需要补加的原料为葡萄糖、硫酸铵和玉米桨。在采用初始的发酵培养基进行培养后，当测定出还原糖含量在5g/L以下时开始补糖，20-40小时，按20g/L'h补加葡萄糖;40-140小时，按10g/L'h补加葡萄糖;140-结束，按5g/Ivh补加葡萄糖。在发酵起始后80-168小时补玉米浆，补加速率为O.2g/L'h。实施例150L发酵罐培养接种量20%;每分钟通入单位体积(L)发酵液的空气体积(VVM)为1.4L;搅拌转速300550r/min;培养温度30°C;罐压0.05MPa;起始培养液体积30L;培养周期184h。测定方法细胞干重(DCW):吸取发酵液10ml，称湿重，布氏漏斗抽滤，湿固形物水洗3次后80。C恒温烘12h,称重，计算DCW(g/L)。林可霉素效价中国药典(2005版)二部管碟法。NH/含量利用苯酚-次氯酸盐反应测定铵离子[参见徐晨东等，利用苯酚-次氯酸盐反应测定铵离子方法的探讨[J];无锡轻工大学学报食品与生物技术，1998，17(1):34-38]。氨基氮(NH2-N)含量甲醛氧化法[参见北京大学生物系生化教研室；生物化学实验指导[M];北京高等教育出版社；1986:92-96]。总糖(TS)和还原糖(RS)含量斐林氏法[参见北京大学生物系生化教研室；生物化学实验指导[M];北京高等教育出版社；1986:92-96]。实施例2NH4+对氮源代谢的动态影响本发明人确定了四种典型的补硫酸铵方案(表1)，以考察NH/对发酵过程的影响。为考察基础培养基中NH/含量较高时发酵过程的变化，将F1罐基础培养基中硫酸铵的含量设为7g/L(相当于103.139mmol/L);为考察发酵初期和前期补入硫酸铵的速率较高时发酵过程的动态变化，设计了F3罐补料工艺；为考察发酵初期和前期补入硫酸铵的速率较低时发酵过程的动态变化，设计了F4罐补料工艺。其中[NH2-N]起每隔2小时时间检测一次。表l硫酸铵的补料工艺方案<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>NH4+对氮源代谢的动态影响发酵过程中，每一罐中NH/含量变化曲线分别如图l所示。对Fl罐，0h时NH/和氨基氮含量分别为103.139mmol/L、0.19mg/ml，全程未补加硫酸铵，NH/和氨基氮含量分别在25mmol/L和110mg/100ml以上，全程消耗硫酸铵5.318g/L(40h后的消耗量约0.669g/L)，未消耗的硫酸铵为0.283g/L。对F2罐，20h时NH/和氨基氮含量分别降为0.823mmol/L、30.8mg/100ml，随后第一次补入硫酸铵；24184h，最低丽4+浓度(每次补硫酸铵之前的测定值)约为3.04.O画ol/L，全程消耗硫酸铵14.936g/L(40h后的消耗量约10.134g/L)。对F3罐，16h时NH/和氨基氮含量分别为3.676mmol/L、50.7mg/100ml，随后第一次补入硫酸铵；40h后未补加硫酸铵，但全程的NH/浓度均在19.5mmol/L以上，氨基氮含量在94mg/100ml以上；全程消耗硫酸铵9.403g/L(40h后的消耗量约0.447g/L)，未消耗的硫酸铵为1.541g/L。对F4罐，16h时NH4+和氨基氮含量分别为3.836mmol/L、51.8mg/100ml，随后第一次补入硫酸铵，最低NH/浓度在40h时降为0.543mmol/L;40h以后，最低NH/浓度基本在1.502.50mmol/L的范围内；全程消耗硫酸铵10.116g/L(40h后的消耗量约6.108g/L)。与F2罐相比，Fl和F3罐NH/含量很高，而消耗硫酸铵的总量却比F2罐少，说明高浓度的NH4+可抑制林可链霉菌对NH/的利用；F3罐40h后未补加硫酸铵，但消耗硫酸铵的量极少，进一步说明发酵前期产生的NH/阻遏效应很难解除，会降低后续发酵过程中菌体消耗氮源的能力。另外，40h前F2罐硫酸铵的消耗量比F4罐的仅多0.794g/L，但40h后F2罐的消耗量比F4罐的多4.026g/L，前者的干重也较后者平均多2g/L左右(图4)，NH/的这种调节作用类似信号的放大作用，此处简称"NH4+放大效应"。综上，第一次补硫酸铵以前，待发酵液中的顺4+消耗至很低浓度(<1.0mmol/L，如F2罐)后，林可链霉菌对NH/的消耗速率和消耗量增大，说明低浓度的NH/促进了催化铵同化的酶的大量合成；发酵初期和前期补入硫酸铵的平均速率过大或偏小(本工艺以F2罐的为最佳)时均会导致后续发酵过程的"NH/放大效应"。实施例3冊4+对糖代谢的动态影响根据测定，0h时，4罐培养液的总糖含量分别为6.3、6.52、6.32和6.78g/100ml。16h前F2、F3和F4罐的总糖消耗速率变化基本相当，16h后按表l补加硫酸铵F3和F4罐均在16h开始第一次补硫酸铵，前者补硫酸铵的速率较后者的大，导致前者的总糖消耗速率比后者的大；F2罐在20h才开始补入硫酸铵，1620h，其NH/浓度比F3和F4罐的低，总糖消耗速率也较低(图2)，说明NH4+浓度与葡萄糖降解酶的酶活力正相关。对F1罐，总糖消耗速率最慢，在44h时总糖含量降至16.7g/L，由于起始培养基中含47g/L的葡萄糖，仅含6g/L的淀粉，说明过高浓度的NH4+会抑制葡萄糖降解酶的酶活力。因此，在一定浓度范围内，增大NH/的供给速率可提高葡萄糖降解酶的活性；当NH/的浓度过高时(如F1罐，〉25mmol/L)，葡萄糖降解酶的酶活力会受到抑制。补葡萄糖后的影响整个发酵过程中Fl罐的最低NH/浓度为25.3mmol/L，葡萄糖的降解速率均很低，说明NH/浓度持续在25mmol/L以上时会抑制葡萄糖降解酶的酶活力。对F2罐，24h时第一次补入葡萄糖，2428h平均耗糖速率为2.0g/(h'L)[或0.0499g'(h'g干重)—']，24h补加硫酸铵后NH/的最高瞬时浓度为12.5mmol/L，此后，平均耗糖速率逐渐降低，但降幅较小。对F3罐，19h时第一次补入葡萄糖，1925h，平均耗糖速率为2.15g/(h'L)[或0.05g'(h'g干重)—J，较F2罐的高，而在19h和22h两次补硫酸铵后NH/的最高瞬时浓度分别为19.lmmol/L禾P19.9mmol/L，说明NH/的最高瞬时浓度约为19.0mmol/L时葡萄糖降解酶的酶活力较最高瞬时浓度为12.5mmol/L时的高；2528h平均耗糖速率为1.644g/0rL)，较第一时段下降0.467g/0vL)[F2罐第二时段相对第一时段下降0.222g/0vL)]，说明F3罐由于补入硫酸铵速率过快而抑制了葡萄糖降解酶在此时段的酶活力，即当NH/浓度达到20.927mmol/L(2528h的最高瞬时浓度)时葡萄糖降解酶的活性会受到抑制；31h后，平均耗糖速率下降很快，进一步说明过高浓度的NH/会对葡萄糖降解酶产生明显的抑制作用。鉴于此，可取19.0腿ol/L作为NH4+抑制葡萄糖降解酶的浓度临界点。因此，发酵初期(从第l次补硫酸铵开始)和前期抑制葡萄糖降解酶活性的NH/浓度临界点为19.0圆ol/L，即临界值以下，NH/浓度与葡萄糖降解酶的活力呈正相关。实施例4对次级代谢的动态影响林可链霉菌进行旺盛的次级代谢主要需具备两方面的条件具有较高的生物量积累及合适的环境条件；林可霉素合成酶的量很大且活性很高。由图3可见，40h后，Fl罐的菌浓(DCW)最低，F2罐的DCW最高最稳定，维持在43.5g/L左右；F4罐的DCW维持在41.4g/L左右；而F3罐的DCW呈下降趋势。Fl、F2、F3和F4罐发酵液在24h时的生物效价分别为0、376、145和259u/ml，在40h时分别为286、1223、598和834u/ral，F2罐起步效价最高，2440h其生物效价的涨幅也最大，说明F2罐在发酵初期林可霉素合成途径中的一些关键调控酶(统称林可霉素合成酶)可能被大量诱导或激活，并且一经合成后就不受NH4+抑制或所受抑制作用很小；16h前，F2与F4罐各项参数变化很接近，16h时F4罐以很小的速率补入硫酸铵，而F2罐是在NH/消耗至1.Ommol/L以下(20h)才补入硫酸铵，1620h，F2罐的NH/浓度变化范围为3.00.8mmol/L，Fl罐的为3.12.5mmol/L，这说明NH/浓度在2.5mmol/L以下有利于林可霉素合成酶的大量合成。F2罐全程的补硫酸铵速率比F4罐的大，前160h，每24h林可霉素效价的涨幅均在1000u/ml以上，但F4罐在前88h林可霉素效价涨幅仅在600u/ml左右，以后每24h的涨幅约为800u/ml左右，进一步说明发酵初期林可霉素合成酶一经合成后即不受NH/浓度的影响。Fl和F3罐的起步效价低说明高浓度的NH/会抑制林可霉素合成酶的合成；二者的DCW逐渐降低，显微镜下可观察到菌丝提前断裂及自溶，说明高浓度的NH/抑制了糖代谢酶及氮源代谢酶的活性，使得林可链霉菌的初级代谢强度变得很弱，次级代谢水平低。因此，第一次补硫酸铵以前，待NH/消耗至很低的浓度(〈1.0mmol/L)，有利于林可霉素合成酶的大量合成，该酶合成后可能不受NH/浓度(〈19.0mmol/L)的影响；限制硫酸铵的补入速率，使发酵液保持稳定的NH/浓度压力(最低浓度范围为3.04.Ommol/L)，可使林可链霉菌的维持代谢和次级代谢保持较高水平。实施例5前50h的摄氧率(OUR)曲线与菌丝形态变化分析菌体的OUR受多种因素的影响，如罐压、空气流量、转速、营养物质的浓度和环境条件等，OUR的变化与菌丝形态的变化也有密切的关联性。Fl、F2、F3和F4罐的在线0UR曲线如图4所示。与其它3罐相比，F1罐的0UR水平最低；对F2、F3和F4罐，前16h三者的OUR曲线变化趋势基本一致，16h后则有了差异F2罐的0UR曲线较平稳，24h后虽然呈下降趋势，但与其它罐相比，基本保持在最高水平(发酵旺盛期40140h)2030mmol/(L'h)内(50h后数据未列出);F3罐的OUR在25h前较高，此后缓慢下降，31h后降幅明显增大；F4罐的0UR也较稳定，但比F2罐的低。就菌丝特征而言，F2、F3和F4罐的菌丝在16h时均开始出现原生质收縮现象，1620h，对F2罐，该现象逐渐消失，发酵液密度增大，菌丝长而舒展；对F3罐，该现象很快消失，但发酵液密度减小，菌丝出现膨胀现象；对F4罐，该现象一直存在。发酵前期和后续发酵过程中，F2罐的菌丝形态稳定；而F3罐在31h以后断裂的菌丝段明显增多；40h前F4罐的菌丝逐渐变得较细而短，40h以后，菌丝随着硫酸铵补料量的增加逐渐变得较长较粗，0UR与F2罐靠近；Fl罐从20h开始即有许多断裂的菌丝段。因此，NH/供给速率过高可导致菌丝膨胀；第一次补硫酸铵以前，待林可链霉菌将NH/消耗至很低浓度(〈1.0mmol/L)，可使迟效碳、氮源得到充分利用(原生质收縮现象逐渐消失)；在林可霉素生产旺盛期(40140h)应全面调控，使OUR保持在2030mmol/(L'h)的范围内。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种利用林可链霉菌发酵生产林可霉素的方法，其特征在于，所述方法包括(1)调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±5mmol/L，在适宜条件下培养林可链霉菌；(2)当发酵培养基中铵离子浓度为0.2-1.5mmol/L时，补加铵离子，之后控制发酵培养基中铵离子浓度2-5mmol/L至发酵结束。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当发酵培养基中铵离子浓度为0.5-l,ol/L时，补加铵离子。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±3mmol/L。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，补加铵离子之后控制发酵培养基中铵离子浓度为3-4mmol/L。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的铵离子来源于硫酸铵和硝酸氨。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57士lmmol/L;在培养第20-24小时，当氨基氮[NH2-N]《0.35g/L时，补加硫酸铵1.067g/L;在培养第2440小时，当氨基氮《0.55g/L时，补加硫酸铵0.8g/L;在培养第40140小时，当氨基氮《0.55g/L时，补加硫酸铵0.533g/L;在培养第140小时放罐，当氨基氮《0.55g/L时，补加硫酸铵0.267g/L。7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，初始发酵培养基中硝酸铵为2±0.2g/L，硫酸铵3±0.2g/L。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，初始发酵培养基中含有以下成分淀粉6士lg/L，葡萄糖47士5g/L，黄豆饼粉28土3g/L,玉米浆12士lg/L，氯化钠5±0.5g/L，硝酸钠6士0.5g/L，磷酸二氢钾0.3±0.03g/L，碳酸钙8±0.8g/L，硝酸铵2土0.2g/Lg/L，硫酸铵3±0.2g/L。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基中每分钟空气的通气量是:1.4±0.3L/L。10.如权利要求l所述的方法，其特征在于，发酵培养的培养温度是30土2。C。全文摘要本发明属于微生物发酵领域，公开了一种优化的林可霉素发酵生产方法，所述方法包括调节初始发酵培养基中铵离子浓度为57±5mmol/L，培养林可链霉菌；当发酵培养基中铵离子浓度为0.2-1.5mmol/L时，补加铵离子，之后控制发酵培养基中铵离子浓度2-5mmol/L至发酵结束。本发明人首次在较大规模水平上研究了林可链霉菌发酵生产林可霉素的影响因素，总结出了优化的林可霉素发酵生产方法，利用该方法可使得林可霉素的产量大大提高。文档编号C12P17/16GK101220385SQ20081003295公开日2008年7月16日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者炬储,夏建业,庄英萍,张嗣良,啸李,杭海峰,王永红,郭美锦申请人:华东理工大学