用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法

专利名称：：用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法
技术领域：
：本发明涉及一种用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白及用该L1蛋白制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法。
背景技术：
：人乳头瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一个无包膜的小型双链环状DNA病毒。HPV可通过人体间的密切接触传播，引起被感染者的皮肤出现寻常疣和肛门生殖器尖锐湿疣等病变，被列为性传播疾病。1995年，国际癌症研究中心公布的研究结果证实，HPV与宫颈癌有密切的因果关系。由此可见，HPV感染已成为严重危害人类健康的病原体。因此，研制高效、廉价的HPV疫苗，对于预防女性宫颈癌和HPV感染所引起的性传播疾病具有十分重要的意义。根据HPV亚型与女性生殖道恶性肿瘤的关系，将HPV分为低危型和高危型。HPV6、11、34、40、42等型别多见于良性宫颈病变如宫颈湿疣及宫颈上皮轻度不典型性增生病变中，属HPV低危型；而宫颈上皮重度不典型增生及宫颈癌中以HPV16、18、31、33、35、39、45型感染更为多见,这些亚型为高危型。不同人群中一系列的研究已证实生殖道的HPV16、18型感染与宫颈癌的发生高度相关，较其他危险因素更密切。因此HPV16、18型的疫苗的开发将能够有效的预防宫颈癌的发生。HPV是一种DNA病毒，直径约为4555nm，呈球形，无包膜，衣壳为由72个壳微粒组成对称偏斜的20面体。其病毒颗粒衣壳由主要衣壳蛋白(Ll)和次要衣壳蛋白(L2)组成。主要衣壳蛋白L1在细胞中表达后能自动组装成衣壳颗粒，称为病毒样颗粒(VLPs)，该颗粒与天然病毒有相似的空间构象、免疫特性和生物学活性，并可以大规模制备和纯化，因而基于Ll衣壳蛋白的VLPs预防性疫苗的开发成为目前HPV疫苗研究的主要方向。目前，Merck公司的预防型HPV四价疫苗(商品名Gardasil)已经上市。该疫苗为酿酒酵母系统表达的HPV16+18+6+11Ll蛋白，临床实验表明Merck疫苗在预防16型、18型、6型(6a和6b)、ll型HPV感染的有效率接近100%。GlaxoSmithKline公司的预防型HPV双价疫苗(商品名为Cervarix，昆虫细胞表达的HPV16+18Ll蛋白)也已经进入FDA审批阶段，已获准在澳大利亚、欧盟、菲律宾、阿联酋等地上市。毕赤酵母(户/cWap"Won's)表达系统具有操作简单、易于培养、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷。毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为814个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50-150甘露糖残基要短得多。'专利申请CN1869215A公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备人乳头瘤病毒的病毒样颗粒的方法，分别将用PCR扩增宫颈癌病理组织标本得到的编码人乳头瘤病毒晚期蛋白的基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体中，构建重组毕赤酵母细胞；利用重组毕赤酵母细胞进行发酵培养和甲醇诱导分泌表达L1蛋白，培养上清经纯化后，所得L1蛋白可自组装成病毒样颗粒。但该文献未公开根据毕赤酵母密码子的偏爱性合成的HPVL1基因的核苷酸序列以及该重组L1蛋白的活性。
发明内容因此，本发明要解决的问题就是提供一种表达量高的用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒16型L1(HPV16L1)蛋白的方法。本发明还要解决的问题是提供用所述重组HPV16Ll蛋白制备抗HPV16感染的疫苗的方法，制得的疫苗具有较佳活性。本发明人经过深入而广泛的研究，成功的建立了用优化密码子的基因在毕赤酵母表达系统中高量表达病毒样颗粒和制备抗人乳头瘤病毒16型疫苗的技术，在此基础上完成了本发明。首先，本发明人经过仔细的研究，设计了适用毕赤酵母偏好密码子的人乳头瘤病毒16型基因。遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。毕赤酵母和人的基因对密码子的利用有各自的偏爱。由于遗传密码是简并的，每个氨基酸都由一个以上的密码子编码，同一氨基酸的密码子在野生型的基因中的使用频率是不同的。毕赤酵母的密码子偏好可能导致重组蛋白低的翻译效率和表达水平，本发明人对野生型的HPV16L1基因(GenebankAAC09292)进行改造对其所有的氨基酸全部采用使用频率最高的密码子。Pichia酵母密码子使用频率见表1(参见http:〃www.kazusa.or.jp/codon/)。然后在此基础上，又为了避免翻译出来的mRNA的GC比例过高，mRNA的二级结构影响翻译的效率和一些常用的酶切位点，本发明人对最高频率的密码子进行一定的修正。由此，本发明人优化设计出若干种适于毕赤酵母表达的HPV16L1基因的核苷酸序列，按照所述的序列全合成了HPV16L1基因，将其克隆到现有毕赤酵母表达载体中，通过同源重组及高浓度抗生素的筛选构建重组毕赤酵母表达菌株；利用重组毕赤酵母进行发酵培养和甲醇诱导胞内表达HPV16Ll蛋白。从中筛选出3种全新的HPV16Ll基因的核苷酸序列，可在毕赤酵母中高表达HPV16L1蛋白，并在胞内同时形成病毒样颗粒(VLPs)，破菌上清经过层析方法纯化后，纯化的病毒样颗粒纯度大于90%，吸附铝佐剂后，具有极高的免疫原性，可作为人用预防宫颈癌的疫苗。这些优化设计的HPV16Ll基因的核苷酸序列如SEQIDNO.l、SEQIDN0.2或SEQIDNO.3所示。表1Pichia酵母密码子表氨基酸密码频率氨基酸密码频率LeuTTA15.6HisCAT11.9TTG31.2CAC9.1CTT15.7GinCAA25.3CTC7.5CAG16.2CTA10.9AsnAAT24.6CTG15.1AAC26.1lieATT30.8LysAAA30.4ATC19.6AAG34.7ATA11.7AspGAT36.0MetATG18.1GAC26.2ValGTT27.1GluGAA39.0GTC14.8GAG29.7GTA9.8CysTGT7.7GTG12.2TGC4.2SerTCT23.9终止TGA0.3TCC16.2TAA0.9TCA15.4TAG0.5TCG7.1TypTGG10.3AGT12.8pheTTT23.6AGC7.7TTC19.8ProCCT16.0ArgCGT6.8CCC6.7CGC2.2CCA18.4CGA4.4CCG4.2CGG2.0ThrACT22.3AGA20.2ACC14.3AGG6.6ACA13.7TyrTAT15.2ACG6,0TAC18,2AlaGCT29.0GlyGGT26.0GCC16.5GGC8.0GCA15.0GGA19.1GCG3.8GGG5.86然后，本发明利用上述3种全新的适于毕赤酵母表达的HPV16Ll基因的核苷酸序列，采用现有常规的分子生物学技术，构建了基因工程菌，并发酵培养工程菌，分离纯化得到重组的HPV16L1蛋白。其中，本发明基因工程菌的构建方法根据毕赤酵母密码子的偏爱性，全基因合成上述优化设计的病毒HPV16衣壳蛋白Ll基因，克隆至毕赤酵母表达载体中，所用的表达载体选自pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pA0815等现有常用的毕赤酵母表达载体，将含HPV16L1基因的表达载体转化毕赤酵母宿主菌株，通过筛选获得重组毕赤酵母工程菌，转化方法可用电转化或原生质体转化，所用的宿主酵母菌选自现常用的毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168等菌株。本发明基因工程菌的发酵方法将本发明基因工程菌接入活化培养基(YPD或LB或SOC),2537'C培养过夜。将镜检合格的活化液接入种子培养基(YPD或LB或SOC)，2537'C培养过夜。镜检无杂菌污染。按一定比例接种。发酵用基础盐培养基(BSM1或BSM2或BSM3)，发酵温度为2037°C，初始pH38，添加痕量盐类(PTM1、PTM2、PTM3)。初始增殖阶段大约1530小时，通过调节搅拌转速、空气流量、罐压等维持溶氧值2080%。当碳源消耗完毕时，菌体湿重达到约50150g/L。补加甘油或葡萄糖溶液。维持溶氧值2080%。补加一定时间，菌体湿重约50500g/L时，停止补料。同时将pH值控制调为38，开始加入甲醇诱导。维持溶氧值高于2080%，温度维持在2037。C，pH值控制为38。每210小时取一次样，WestemBlot检测。诱导590小时发酵结束，放出发酵液。用冷冻离心机离心发酵液后收集菌体。收获的菌体在-20。C冻存。诱导表达的HPV16Ll蛋白，可在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒(HPV16LlVLPs)。本发明纯化HPV16LlVLPs的方法取-20'C冷冻的表达目的蛋白的菌体，通过中性缓冲盐溶液或纯化水解7冻并清洗菌体，去除其中的培养基成分(盐、色素等)，减少对后期纯化的影响。经过清洗后的菌体，使用适当的含有一定盐浓度和表面活性剂成分的破菌缓冲液混合可使用的盐成分有NaCl、KCl等，浓度范围在0.40.8mol/l左右；可使用的表面活性剂有Tween-80、Tween-20、Triton-XlOO等，浓度范围在0.0050.05%(w/v)左右，可使用的缓冲系统有磷酸盐缓冲、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、HEPES缓冲液等，使用浓度范围在0.020.2mol/l左右。混合后的菌体可以通过高压均质机或珠磨匀浆机等设备进行破壁，高压均质机使用破菌的压力范围8002000Bar左右，破碎循环24遍可至破菌率>90%，珠磨匀浆机选用珠体直径0.20.4mm，珠体的装量控制在70%90%左右，循环12遍可至破菌率>80%以上。将破碎后的菌液通过高速离心或者切向流微滤的方法分离沉淀和上清，离心机(SORVALL、HITACHI等)的转速控制在600010000rpm，离心时间2060分钟，切向流微滤可使用0.45~0.65um的膜包(Millipore，PALL等)收集上清用于后期纯化。经过澄清后的上清，上样于可吸附HPV16LIVLPs层析介质上，如SPSepharoseFF、SPSepharoseXL(GE)、POROS50HS(AppliedBiosyst画)、HeparinSepharose6FF(GE)、CellufmeSulfate(ChissoCorporation)等，HPV16L1VLPs蛋白有效结合于上述层析介质上，并通过一定的盐浓度梯度(如0.51.0MNaCl或KC1缓冲溶液)洗脱，将杂质与HPV16LIVLPs蛋白分离，用含高盐(如1.02.0mol/lNaCl或KCl缓冲溶液)的缓冲溶液洗脱结合的HPV16L1VLPs蛋白，收集洗脱的初步纯化的HPV16L1VLPs蛋白。将经过初纯的HPV16LIVLPs蛋白上样于精细纯化的层析介质上如CHT(BIO-RADTypeII)，HPV16LIVLPs蛋白在一定盐浓度范围(如0.31.5mol/lNaCl或KCl缓冲溶液)能有效结合于CHT(BIO-RADTypeII)介质上，并通过一定的磷酸盐浓度梯度(如磷酸盐的浓度可使用20400mM)洗脱，将杂质与HPV16L1VLPs蛋白分离。经过纯化的样品也可上样与精细纯化的介质如S印harose6FF、Sepharose4F(GE)，Hw-75(TSK)，通过8凝胶分离将杂质与HPV16LIVLPs蛋白分离。通过精细纯化后收集洗脱的HPV16LIVLPs蛋白即为最后纯化的样品，经过还原性SDS-PAGE(Bio-RAD)以及毛细管电泳(BeckmanCoulter)的检测纯度>90%，Western-blot(Bio-RAD)的检测电泳目的条带可与HPV16LIVLPs的单抗或多抗呈特异性的显色反应，经过动态光散射(MalvernInstrumentsZetasizerNanoZS)的检测纯化样品颗粒范围在5080nm左右，经过电镜(Philips)观察纯化样品中呈现病毒样颗粒，颗粒直径在5080nm之间。因此，本发明利用毕赤酵母(i^/z^/7^toWs)表达系统制备重组人乳头瘤病毒16型LI蛋白的方法，包括将优化设计的HPV16LI基因克隆至表达载体，转化毕赤酵母菌株，培养转化体，获得重组的HPV16L1蛋白；其中，所述的优化设计的HPV16LI基因的核苷酸序列如SEQIDNO.l、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。优选的，所述的表达载体选自市售商品pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pA0815。优选的，所述的转化用电转化或原生质体转化。优选的，所述的毕赤酵母选自选自市售商品毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案可以是将本发明上述方法制得的重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白作为抗原，利用现有疫苗的制备方法来制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗。因此，本发明一种制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法，包括采用上述方法制备重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白病毒样颗粒，然后加入药学上可用的疫苗佐剂。所述的该疫苗佐剂可以是铝佐剂，纯化后的人乳头瘤病毒16型蛋白(HPV16L1)形成病毒样颗粒，吸附于佐剂上，可作为预防宫颈癌的疫苗。本发明除特别说明之处外，所用的百分比都是重量百分比。相比于现有技术，本发明选用优化设计的HPV16L1基因，克隆至毕赤酵母中，使HPV16L1蛋白表达量较其他表达系统(如哺乳动物细胞、杆状病毒、酿酒酵母)有明显提高。表达所得病毒样颗粒经纯化后在电镜下观察为50-80nm，与野生型HPV病毒颗粒相似。重组的HPV16Ll蛋白病毒样颗粒吸附铝佐剂后，免疫小鼠，能产生高效价的抗HPV16L1抗体；假病毒中和实验结果表明，该抗体具有较佳的中和活性(即能够阻止假病毒进入细胞)。以下结合本发明的特征和优点。图1是pPICZA-16Ll载体构建示意图。图2是pPICZA-16Ll载体鉴定图。M，250bpladderMarker(Takara公司)；1,BstBI+Kpnl双酶切pPICZA;2，BstBI+Kpnl双酶切pPICZA-16Ll。图3是HPV16Ll表达WesternBlot鉴定图。M，彩虹Marker(Fermentas公司)；1，表达的阳性对照；2，筛选到的HPV16L1表达菌株；3，表达的阴性对照。箭头所指之处即为表达的HPV16L1。图4是HPV16Ll层析纯化样品还原性SDS-PAGE电泳图。l)POROS50HS收集峰样品；2)CHT流穿1;3)CHT流穿2;4)HPV16Ll阳性对照；5)CHT洗脱峰1;6)CHT洗脱峰2;7)CHT洗脱峰4;8)CHT洗脱峰8;9)CHT洗脱峰12。图5是HPV16Ll毛细管电泳纯度图。图6是HPV16LlVLPs纯化样品透射电镜图(X105000)。图7a是HPV16Ll假病毒感染293FT细胞图。图7b是鼠血清中和HPV16Ll假病毒图。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。实施例1合成HPV16Ll基因按照毕赤酵母使用的密码子偏爱性设计1.5kb的HPV16Ll基因的核苷酸序列。见序列表中的SEQIDNO.l、SEQIDNO,2和SEQIDN0.3。由捷瑞公司分别商业合成上述全长基因，并应用DNA测序仪#3730对HPV16L1基因进行测序。实施例2HPV16Ll毕赤酵母表达载体的构建将实施例1中获得的序列为SEQIDNO.l的HPV16Ll基因两端以EcoRI和Kpnl酶切位点装入pUC18质粒(捷瑞公司)中，命名为pUC-16Ll，送至上海生工生物工程有限公司应用DNA测序仪3730进行DNA测序。委托上海生工生物工程有限公司合成扩增HPV16Ll所需的引物。正向引物包括一个BstBI限制性内切酶位点并具有核苷酸序列5，-ACTAATTATTCGAAACGATGTCTTTGTGG-3，(如SEQIDNO.4所示)。反向引物包括位于终止密码子侧翼的Kpnl限制性内切酶位点并具有核苷酸序列5'-AGCGGTACCCTATTACAACTTTCTCTTCTTTC-3，(如SEQIDNO.5所示)。聚合酶链式反应(PCR)用上述引物对，并以pUC-16Ll为DNA模板进行。PCR片段按常规亚克隆方案经限制性内切核酸酶BstBI和Kpnl双酶切消化，再与BstBI/Kpnl双酶切消化的pPICZA(购自Invitrogen)连接。用连接液转化大肠杆菌菌株ToplO的感受态细胞，铺板于含25pg/ml零霉素(Zeocin)的LB琼脂上。分离已转化细胞的单菌落，制备质粒DNA并经限制性图谱和核苷酸序列分析HPV16Ll基因和载体序列的存在。鉴别出包含HPV16Ll基因的正确构建体(命名为pPICZA-16Ll)。图1是pPICZA-16Ll载体构建示意图。图2是pPICZA-16Ll载体的鉴定结果。实施例3HPV16Ll毕赤酵母表达菌株的构建和筛选为了提高重组质粒在酵母染色体上的整合效率，用SacI限制性内切酶单酶切pPICZA-16Ll质粒使其线性化，对空质粒pPICZA进行同样的酶切作为阴性对照。酶切反应液加入无水乙醇沉淀DNA，用少量双蒸水溶解线性化的pPICZA-16Ll片段，按《分子克隆实验指南》(第三版)的步骤电击转化毕赤酵母菌X-33(购自Iiwitrogen)。电转化条件为DNA片段5微克，电压1500伏，电阻25欧姆，电击时间为5毫秒。电转化产物铺板于含200pg/ml零霉素的YPDS琼脂上，分离已转化细胞的单菌落，重新接种至含IOOO吗/ml、1500pg/ml零霉素抗性平板上。高浓度抗性平板上获得的克隆，分别用4mlYPD液体培养基培养，24h后换成BMMY培养基诱导基因表达，表达48h后离心收获菌体。玻璃珠法破菌，WesternBlot检测各个菌株的表达量，筛选后获得HPV16Ll表达量较高的菌株pGK413。图3是HPV16Ll表达Western-Blot鉴定图。实施例4重组HPV16L1蛋白的表达种液制备从工作种子库取1支菌种甘油冻存管，即实施例3所得的基因工程菌pGK413，融化后吸取100pl接入5mlYPD培养基，280转/分钟(rpm)，30。C培养20小时。OD,在12。镜检无杂菌污染。将检验合格的活化液lml接入500mlYPD培养基，280rpm,3(TC培养20小时。OD600在26。镜检无杂菌污染。发酵工艺发酵用基础盐培养基BSMi(K2S04273g，MgS04109g，CaS04.2H2017.6g，H3PO4400.5ml，KOH62g，甘油600g，PTM!60ml，泡敌lml，去离子水加至15L)，用去离子水配制，其中不含有抗生素，配制后在30L发酵罐(Bioengineering公司)中进行实罐灭菌。灭菌条件为121°C，30分钟，消后冷至30°C。按1:15接种。发酵温度为30.0士0.5。C，初始pH5.00士0.05，起始转速300rpm培养，通气量0.5vvm，DO100%，添加PTM1(CuSO45H2O6.0g，NaIO遍g，MnSO43.0g，NaMoO40.2g，H3BO30.02g，ZnSO420.0g，CoCl20.5g，FeS04.7H2065.0g，biotin0.2g，H2SO45.0ml，去离子水加至1L)痕量盐类。初始增殖阶段大约20小时左右，维持溶氧值不低于30%，当碳源消耗完毕时，溶氧值迅速地上升，菌体湿重达到约100g/L。初始两小时以每小时200ml/h的速率补加体积百分比50%的甘油溶液(每升添加12mlPTM》。补料两小时后改为300ml/h。通过调节搅拌转速、空气流量、罐压(<0.8bar)使溶氧水平维持在20%以上。补加约8小时，菌体湿重约350g/L时，停止补料，溶氧值上升。同时将pH值控制调为6.00士0.05,开始加入甲醇(每升添加12mlPTM》诱导。最初甲醇加入量控制在30ml/h。缓慢增加甲醇的加入量，甲醇诱导4小时后将补料速度设定为90ml/h。维持溶氧值高于体积百分比20%，温度维持在3(TC，pH值控制为6.00士0.05。每8小时取一次样，WesternBlot检测。诱导24小时发酵结束时放出发酵液。菌体收获用冷冻离心机离心发酵液后收集菌体，称重。标明批号、曰期、重量，收获的菌体交付于纯化，或在-2(TC冻存。实施例5提纯制备HPV16Ll蛋白病毒样颗粒(VLPs)清洗将-2(TC冷冻保存的、实施例4制得的表达HPV16Ll(即HPV16LlVLPs)的Pichia酵母细胞，放于室温下解冻，加入清洗缓冲液100mMPBpH7.0、0.15MNaCl或者纯化用水，按比例1:3(g/ml)混合，使用匀浆机(FLUKO)将酵母细胞与清洗缓冲充分混匀，随后通过高速离心(SORVALLRC6PLUS)8000rpm，5min分离细胞和清洗上清。重复以上操作二遍，即完成细胞的清洗。破碎将清洗后的细胞加入破菌缓冲液200mMMOPS、pH7.0、0.4MNaCl、0.05%Tween-80，按1:5(g/ml)的比例混合，使用匀浆机(FLUKO)将酵母细胞与破菌缓冲液充分混匀。使用高压均质机(ATSAH110B)在压力12001300bar的操作压力下破碎以上经过匀浆的细胞悬液，重复4遍4°。8°。出口冷却，使90%的细胞破碎。澄清将经过高压破碎的破菌液倒入离心杯中，通过高速离心去除细胞碎片，收集离心上清用于随后的柱层析分离。使用的离心机SORVALLRC6PLUS，转子型号FIBERLITEF10-6x500y，离心设置9000rpm，30min，10°C。13初纯使用层析介质POROS50HS(AppliedBiosystems)装柱(直径26mm，高度10cm，体积50ml)。通过以下步骤进行纯化清洗消毒0.5MNaOH清洗2个柱体积；再生平衡缓冲液B(1.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)清洗2个柱体积，缓冲液(0.4MNaCl，200mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)平衡层析柱；上样将经过离心澄清的破菌上清，以流速4ml/min的速度上样；淋洗缓冲液A(0.5MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)淋洗5个柱体积，至基线平稳。洗脱100%缓冲液A至100M的缓冲液B的线性梯度洗脱。洗脱流速8ml/min。收集分部收集洗脱组分，将含有HPV16LIVLPs的组分(SDS-PAGE，Westernblot检测判断)合并，用于精纯。精纯使用层析介质CHT陶瓷羟磷灰石(BIO-RAD，TypeII，40um)装柱(直径26mm，高度10cm，体积50ml)。通过以下步骤进行纯化清洗消毒0.5MNaOH清洗2个柱体积；再生平衡缓冲液B(200mMPB，0.6MNaCl，pH7.0，0.05%Tween-80)清洗2个柱体积，缓冲液A(20mMPB，0.6MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)平衡层析柱。上样将经过初纯后收集的样品加入PB至终浓度为20mM，以流速8ml/min的速度上样；淋洗缓冲液A(20mMPB，0.6MNaCl，50mMMOPSpH7.0，0.05%Tween-80)淋洗5个柱体积，至基线平稳。洗脱100"/。缓冲液A至100n/。的缓冲液B的线性梯度洗脱。洗脱流速8ml/min。收集分部收集洗脱组分，将含有HPV16UVLPs的组分合并，即为最后的纯化样品，经过还原性SDS-PAGE(Bio-RAD)(见图4)以及毛细管电泳(BeckmanCoulter)的检测(见图5)，纯度>90%。HPV16Ll毛细管电泳其参数如下波长220nm检测结果峰保留时间峰高校准后峰面积校准后峰面积所占比例118.41715301175.791855206.30041539219.5831426917486.3404255393.69958461合计1579918662.13228074画細OOOOO14Western-blot(Bio-RAD)检测的电泳目的条带可与HPV16LlVLPs的单抗或多抗呈特异性的显色反应。经过动态光散射(MalvernInstrumentsZetasizerNanoZS)的检测纯化样品颗粒范围在5080nm左右，经过电镜(PhilipsTecnai-12Biotwin透射电子显微镜，上海中医药大学科技中心电镜室观察纯化样品中呈现病毒样颗粒，颗粒直径在5080nm之间，见图6。实施例6HPV16L1基因在毕赤酵母中发酵表达量的检测用ELISA夹心法检测发酵表达量。用纯化的毕赤酵母表达的重组装HPV16LlVLPs做标准蛋白浓度曲线，诱导前菌体做阴性对照。鼠血清滴度测定用包被液稀释HPV16LlVLPs的兔多抗(1:2000，上海普欣生物技术有限公司制备)，各0.1ml加于酶标板每个凹孔中，4"C过夜。移去包被液，凹孔用0.3ml洗涤液PBST洗涤。用封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)0.3ml封闭，37"C保温2小时。抗原(实施例5制得的纯化的毕赤酵母表达的重组装HPV16L1VLPs)从浓度2pg/ml稀释到0.0625pg/ml(标准曲线用)，或待测发酵菌体破菌上清稀释100到200倍，每凹孔分别加入O.lml，37。C保温1小时。移去抗原液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。一抗为16LlVLPs的MAB885鼠单抗(1:1000，CHEMICON公司)，用稀释缓冲液(2X脱脂奶粉+PBST)稀释，每凹孔分别加入0.1ml，37'C保温1小时。移去血清液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。每凹孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的酶标抗(HRP标记的羊抗小鼠IgG)0.1ml，37"C保温0.5小时。移去酶标液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。加入0.1mlDAB显色液于每个凹孔，室温作用20分钟。每凹孔加2MH2S040.05ml终止。用酶标比色仪测定OD450值。禾U用梯度稀释的HPV16L1的OD45o的检测结果，制作标准蛋白浓度曲线，再通过标准蛋白浓度曲线换算获HPV16Ll蛋白的发酵表达量，结果如表2所示，其中用已测定浓度的纯化目的蛋白原液稀释一系列浓度，例如2pg/mL，l吗/mL，0.5ng/mL,0.25pg/mL，0.125(ig/mL,作为标准浓度，通过ELISA检测，用浓度做纵坐标，对应OD45o检测值做横坐标，建立标准线性回归方程。发酵破菌液上清稀释一系列倍数，例如50，100，200，400倍。测出的OD45o值通过标准线性回归方程求得对应浓度(单位为pg/mL)，再乘以稀释倍数即为发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为pg/mL)。由于破菌液是由菌体湿重破菌缓冲液=1:5配制的，所以发酵菌体的目的蛋白表达量(单位为pg/g菌体)为5X发酵破菌液上清目的蛋白浓度(单位为pg/mL)。再乘以发酵液菌体密度(单位为g菌体/L发酵液)，则为发酵目的蛋白表达量浓度(单位为pg/L发酵液)。发酵破菌液上清目的蛋白浓度(pg/mL)二稀释倍数X标准目的蛋白浓度(pg/mL)XOD450(发酵破菌液上清)/OD45()(标准目的蛋白浓度)；发酵目的蛋白表达量浓度(pg/L发酵液)二5X发酵破菌液上清目的蛋白浓度(pg/mL)X发酵液菌体密度(g菌体/L发酵液)。表2HPV16L1基因的在毕赤酵母中发酵表达量的检测<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>实施例7重组HPV16LI病毒样颗粒的免疫原性ELISA间接法检测HPV16L1疫苗的制备参考《中华人民共和国药典》(2005年版)中的方法，将实施例5中纯化获得的HPV16LIVLPs吸附铝佐剂，获得具有免疫原性的HPV16L1疫苗。免疫程序选取68周龄的SPF级BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物责任有限公司，合格证号SCXK(沪)2003-0003，分为4组，每组6只小鼠。第l组小鼠均用含有铝佐剂的缓冲液进行免疫，其它3组分别免疫0.1ml浓度为5pg/ml、0.5ng/ml、0.05pg/ml的吸附铝佐剂的HPV16LlVLPs，采用皮下注射免疫，第0、7、21天免疫三次，免疫后两周采血。将采集的血液置37。C放置2h，4000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于-20。C。鼠血清阳转率用包被液稀释抗原(即实施例5制得的纯化的毕赤酵母表达的HPV16L1VLPs)至最适浓度l吗/ml各0.1ml加于酶标板每个凹孔中，4'C过夜。移去包被液，凹孔用0.3ml洗涤液PBST洗漆。用封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)0.3ml封闭，37i:保温2小时。每凹孔加入用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)以1:400稀释的被检血清(免疫过HPV16Ll和铝佐剂的鼠血清)各0.1ml，37t:保温l小时。移去血清液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。每凹孔加入用稀释缓冲液以l:5000稀释的酶标抗[辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG]O.lml，37'C保温0.5小时。移去酶标液，凹孔用0.3m欣涤液洗涤。加入0.1mlDAB显色液于每个凹孔，室温避光作用20分钟。每凹孔加2MH2SO40.05ml终止。用酶标比色仪测定0045()值。cutoff值为检测阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的OD450值的平均值加上3倍标准差。根据ciitoff值判断鼠血清抗体阳转率。结果见表3。表3鼠血清阳转率<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>鼠血清滴度测定用包被液稀释抗原(本发明纯化的毕赤酵母表达的重组装16L1VLPs)至最适浓度l吗/ml各0.1ml加于酶标板每个凹孔中，4'C过夜。移去包被液，凹孔用0.3ml洗涤液PBST洗涤。用封闭液(5%脱脂奶粉+PBST)0.3ml封闭，37。C保温2小时。被检血清(免疫过本发明重组装16LlVLPs的鼠血清)用稀释缓冲液(2%脱脂奶粉+PBST)从1:500稀释到1:32000，阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)以1:10000稀释，每凹孔分别加入O.lml，37'C保温1小时。移去血清液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。每凹孔加入用稀释缓冲液以1:5000稀释的酶标抗(HRP标记的羊抗小鼠IgG)O.lml，37°C保温0.5小时。移去酶标液，凹孔用0.3ml洗涤液洗涤。加入O.lmlDAB显色液于每个凹孔，室温作用20分钟。每凹孔加2MH2S040.05ml终止。用酶标比色仪测定OD450值。cutoff值为检测阴性对照被检血清(免疫铝佐剂的鼠血清)抗体的OD450值的平均值加上3倍标准差。采用终点滴度法计算血清的滴度值，其结果如表4所示。由表4中的结果可见本发明制得的重组HPV16Ll蛋白病毒样颗粒吸附铝佐剂后，免疫小鼠，能产生高效价的抗HPVLl抗体，本发明重组HPV16Ll蛋白具有高免疫原性。表4鼠血清滴度测定的滴度值鼠1鼠2鼠3鼠4鼠5鼠65jxg免疫组7172748969307006428911827945981780.5昭免疫组730952706335668459347049858220.05pg免疫组2433042552842157517108<400实施例8假病毒中和实验检测小鼠HPV16Ll抗体的中和活性小鼠免疫程序同实施例7，免疫后两周采血。将采集的血液置37t:放置2h，4000g离心10min，吸取上清，即得到鼠多抗血清，存放于-2(TC。将293FT细胞(Invitrogen)预先铺于15cm细胞培养皿(1.1Xl(f细胞/dish)，24h后将质粒pl6Llh，pl6L2h(BuckCB，PastranaDV，LowyDRetal.EfficientIntracellularAssemblyofPapillomaviralVectors.JVirol,2004,78(2):751-757)和带绿色荧光基因的pIRES2-EGFP(购自BDBiosciencesClontech)用磷酸钙方法进行共转染，用量分别为20吗、10吗、IO吗。48h后进行观察并收集和裂解细胞，将收集的细胞裂解上清立即用于纯化或置-80。C保存。在5ml离心管(Beckman)中用30%OptiPrep密度梯度离心纯化收集的细胞裂解液，16'C下100，OOOg离心4h(MLS-50转头，Beckman超速离心机)，分部收集离心组分，每份约500W，以蛋白印迹实验方法检测各组分中的HPV16L1蛋白含量，将L1蛋白浓度最高的组分合并，作为假病毒液，分装后-80'C保存。将293FT细胞铺于24孔细胞培养板中(1.5X105细胞/well)。24h后进行中和实验，将不同的血清样本分别用DMEM培养基从100倍起进行连续倍比稀释，然后取50pl分别与50^1稀释于DMEM培养基的假病毒液混合，4"C孵育lh后分别加入预铺有293FT细胞的24孔细胞培养板中，37。C培养48h后用OLUMPUSCKX41F32FL倒置荧光显微镜观察表达绿色荧光蛋白的细胞并采集荧光图像，见图7。图7a有荧光，表明HPV16假病毒感染了293FT细胞。图7b只剩极少荧光，表明鼠血清中和了HPV16假病毒，降低了293FT细胞的感染。由此可见小鼠产生的HPV16Ll抗体具有中和活性，能够阻止假病毒进入细胞。本发明也可以将核苷酸序列SEQIDNO.2或SEQIDN0.3替换实施例1中的SEQIDNO.l，按照实施例2~5的制备过程制备本发明的HPV16L1蛋白；也可以将上述基因克隆至现有其它毕赤酵母表达载体，如pPIC6、pGAPZ或pA0815，并选择与之相应的克隆方式，然后将重组表达载体转化其它毕赤酵母细胞，如/^/n'a/oston;sGS115、KM71或SMD1168菌株，构建基因工程菌，按照常规技术培养发酵、分离纯化得到本发明的HPV16Ll蛋白(HPV16L1VLPs)，这些技术为本领域技术人员所知，在此不详述。制得的HPV16Ll蛋白也具有与上述实施例5制得HPV16Ll蛋白相类似的免疫原性。19序列表〈110>上海泽润生物科技有限公司<120〉用毕赤酵母表达系统制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法<130>P4-071430C〈160〉5一〈170〉Patentlnversion3.4〈210〉1〈211〉1518〈212〉腿〈213〉Artificial(人工序列)<220〉<223>适用毕赤酵母偏好密码子的HPV16Ll蛋白基因的核苷酸序列〈400〉1atgtctttgtggttgccatctgaagctactgtttacttgccaccagttccagtttctaag60gttgtttctactgatgaat8cgttgctagaactaacatttactaccatgctggtacttct120卿ttgttggctgttggtcacccatactttccaatt犯gaagccaaac^C￡L3C3￡Lga>tt180ttggttccaaaggtttctggtttgcaatacagagtttttagaatccatttgccagatcca240asc犯gtttggttttccagatacttcttttt3C犯CCC3gsttggtttgg300gcttgtgttggtgttg卿ttggt卿ggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcac360ccattgttgaac犯gttggatg￡Lt8Ctg^aacgcttctgcttacgctgctaacgctggt420gttg8t犯cagagaatgt3tttctatggattacaagc犯actcaattgtgtttgattggt480tgtaagccacca^ttggtga^acattggggt犯gggttctccatgt3Ctascgttgctgtt540aacccaggtgattgtccaccattggetattgsitt^ceictgttattcaagatggtgatatg600gttgatactggttttggtgctatggattttactactttgcaagct犯c犯gtctg犯gtt660ccattggatatttgtacttctatttgtaagtacccageittacattaagatggtttctgaa720ccatacggtgattctttgtttttttacttgag犯g3g犯ca犯tgtttgttagacacttg780tttaacaigagctggtgctgttggtg犯aacgttccagatgatttgtacattaagggttct840ggttctactgct犯cttggcttcttctaactactttccaactxcatctggttctatggtt■acttctgatgctcaaattttt犯C^gCC3tactggttgcaaagagcccaaggtcataac960aacggtatttgttggggt犯ccaattgtttgttactgttgttgatactactagatctact1020aacatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacttacaagaacactaacttt1080aaggaatacttg卿cacggtg8aga3tax:gatttgcaatttatttttcaattgtgtaag1140attactttgactgctgatgttatgacttacattcattctatgaactctactattttggaa1200gattggaactttggtttgca3CC3CC3CC3ggtggtactttggaagatacttacagattt1260gttacttc"tcaagctattgcttgtca^3gC3cactccaccagctccaaaggaagatcca1320ttgaagaagtacactttttggg犯gttaacttgaaggaaaagttttctgctgatttggat1380caatttccattgggt卿6L3gtttttgttgcaagctggtttga已ggctaagccaa已gttt1440actttgggt已卿g犯3ggctactccaactacttcttctacttctactactgctaagaga1500aag犯gag犯1518<210〉2<211〉1521〈212〉腿〈213〉Artificial(人工序列)〈220>〈223〉适用毕赤酵母偏好密码子的HPV16Ll蛋白基因的核苷酸序列<400〉2atgtctttgtggttgccatctgaagctactgtttacttgccaccagttccagtttctaaa60gttgtttctactgacgaatacgttgctagaactaatatttactaccatgctggtacttct120卿Ugttggctgttggtcatccatactttccaattaaaataataaaatt180ttggttccaaaagtttctggtttgcaatacagagtttttagaattcatttgccagaccca240^tai犯tttggttttccagacacttctttttacaatccagattggtttgg300gcttgtgttggtgttgaagttggt卿ggtcaaccattgggtgttggtatttctggtcat360cceittgttgacg3cactg犯aatgcttctgcttacgctgctaatgctggt420gttgax;aat3gagaeLtgtatttctatggactacaaacaaactcaattgtgtttgattggt■tgtaaaccaccaattggtgaacattggggtaaaggttctccatgtactaatgttgctgtt540aatccaggtgactgtccaccsttaatactgttattcaagacggtgacMg600gttgacactggttttggtgctatggactttactactttgcaagctaataastctg犯gtt660ccattggacatttgtacttctacccagactggtttctgaa720ccatacggtgactctttgtttttttacttg3g犯gag33Caaatgtttgttagacatttg780tttaatagagctggtgctgttggtgaaaatgttccagacgacttgtacattaaaggttct840ggttctactgctaatttggcttcttctaattactttccaactccatctggttctatggtt900acttctgacgctcaaatttttactggttgcaa3g3gctc3960犯tggtatttgttggggtaatcaattgtttgttactgttgttgacactactagatctact1020犯tatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacttacaaaaatactaatttt108021tg卿catggtg犯g犯tacgacttgcaatttatttttcaattgtgtaaa1140attactttgactgctgacgttatgacttacattca/ttctatgaattctact已ttttggaa1200gactggaattttggtttgca已ccaccaccaggtggtactttgg犯gacacttacagattt1260gttacttctcaagctattgcttgtc犯3^C3t3CtCC3Ccagctccaaaagaagaccca1320ttg犯36Laatacactttttgggaagttaatttgaaagaaaaattttctgctgacttggac1380caatttccatatttttgttgcaagctggtttgaa3gct犯axx3a^ttt1440actttgggtatactccaactacttcttctacttctactactgctaaaaga1500犯ttgtaaLt3g1521<210>3〈211>1521〈212>廳<213>Artificial(人工序列)〈220〉<223〉适用毕赤酵母偏好密码子的HPV16Ll蛋白基因的核苷酸序列<400〉3atgtctttgtggttgccatctgaagctactgtttatttgccaccagttcc已gtttctaag60gttgtttctaCtg3tg犯t3tgttgctagaactaacatttattatcatgctggaacttct120卿ttgttggctgttggacatccatatttcccaattaagacaacaagatt180ttggttcc犯aggtttctgg3ttgC犯t已tagagttttcagaattcatttgccagatcca240aac犯gttcggattcccagatacttctttctataacccagatactcaaagattggtttgg300gcttgtgttggagttgaagttgga卿ggacaaccattgggagttgg犯tttctggacat360ccattgttgaacaagttggatgatactgaaaacgcttctgcttatgctgctaacgctgga420gttgataacagagaatgtatttctatggattat犯gca^aactcaattgtgtttgattgga480tgtaagccaccaattggagaac已ttggggacatgtact犯cgttgctgtt540aacccaggagetttgtccaccattgg犯ttgttattc犯gatgg卿tatg600gttgatactggattcggagctatgg已tttcactactttgcgtctgaagtt660ccattggatatttgtacttctatttgtaagt3tccagaltatatt犯g3tggtttctgaa720cc3tatggagattctttgttcttctatttgaaatgttcgttagacatttg780ttcaeicELgagctggagctgttggaLg犯犯cgttccagatgatttgtatatt犯gggatct840ggatctactgctaacttggcttcttctaactatttcccaactccatctggatctatggtt900acttctgatgctc犯attttcaac33gccatattggttgcaaagagctca960aacggaatttgttgggga犯ccaattgttcgttactgttgttgstactELCtagatctact1020aacatgtctttgtgtgctgctatttctacttctgaaactacact犯cttc1080aagg^tatttg卿catgggatttgcaattcattttccaattgtgtaag114022attactttgactgctgatgttatgeicttatattcattctatgaactctactattttggaa1200gattggaacttcggattgcaaccaccaccaggaggaactttggaagatacttatagattc1260gttacttctcaagctattgcttgtcaaaagcatactccaccagctccaaaggaagatcca1320ttgaagaagtatactttctgggaagttaacttgaaggaaaagttctctgctgatttggat1380caattcccattgggaagaaagttcttgttgcaagctggattgaaggctaagccaaagttc1440actttgggaaagagaaaggctactccaactacttcttctacttctactactgctaagaga1500aagaagagaaagttgtaat3g1521〈210〉4<211>29〈212〉DNA<213〉Artificial(人工序列)〈220〉〈223〉引物〈400〉4actaattattcgaaacgatgtctttgtgg29〈210〉5〈211〉32<212〉■<213>Artificial(人工序列)<220〉〈223〉引物〈400〉5agcggtaccctattacaactttctcttctttc322权利要求1、一种利用毕赤酵母(Pichiapastoris)表达系统制备重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白的方法，其包括将优化设计的HPV16L1基因克隆至表达载体，转化毕赤酵母菌株，培养转化体，获得重组的HPV16L1蛋白；其中，所述的优化设计的HPV16L1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。2、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的表达载体选自质粒pPICZ、pPIC6、pGAPZ和pA0815。3、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的转化用电转化或原生质体转化。4、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的毕赤酵母菌株选自毕赤酵母X-33、GS115、KM71和SMD1168菌株。5、根据权利要求1所述的方法，其特征是，将所述的优化设计的HPV16Ll基因克隆至质粒pPICZ，得到重组表达质粒，然后电转化毕赤酵母X-33株，筛选得到基因工程菌，经发酵培养、破菌、离心、柱层析纯化得到重组的HPV16L1蛋白。6、根据权利要求5所述的方法，其特征是，所述的柱纯化包括采用POROS50HS柱层析初纯，再经过CHT柱层析精纯。7、根据权利要求1所述的方法，其特征是，所述的重组的HPV16Ll蛋白能在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒。8、一种制备抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法，其特征是，包括采用权利要求17任一项所述的方法制备重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白病毒样颗粒，然后加入药学上可用的疫苗佐剂。9、根据权利要求8所述的方法，其特征是，所述的药学上可用的疫苗佐剂为铝佐剂。全文摘要本发明公开了一种利用毕赤酵母表达系统制备重组人乳头瘤病毒16型L1蛋白的方法，包括将按照优化设计的HPV16L1基因装入表达载体，转化毕赤酵母，培养转化体，获得重组的人乳头瘤病毒16型L1蛋白，该蛋白在毕赤酵母体内自组装成病毒样颗粒；其中，所述的优化设计的HPV16L1基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2或SEQIDNO.3所示。本发明的方法制备的HPV16L1蛋白表达量高。本发明还公开了该重组HPV16L1蛋白病毒样颗粒制成抗人乳头瘤病毒16型感染的疫苗的方法。该疫苗具有较佳的活性。文档编号C12N15/34GK101487009SQ20081003265公开日2009年7月22日申请日期2008年1月15日优先权日2008年1月15日发明者克吴,张千里,张高峡,琼沈,熊莹华,袁靖宇,雷建强,健魏申请人:上海泽润生物科技有限公司