专利名称：：用响应面法优化林可霉素发酵生产的种子培养基的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物发酵领域，更具体地，本发明涉及一种优化的林可霉素发酵生产的种子培养基。
背景技术：
：林可霉素(Lincomycin)—种有用的医药中间体，用于制备抗生素，其通常由链丝菌(如林可链霉菌)产生。目前，用林可链霉菌发酵生产林可霉素的过程非常复杂，在种子培养方面存在以下缺陷培养基组分的配比不合理，导致林可链霉菌生长和繁殖速率较小，培养周期长；培养工艺繁杂，常采用中间补料的方式来延长培养时间，以增加菌浓(PMV);移种时PMV较小，种子已经老化，严重影响林可霉素发酵过程的正常进行，生产效率较低。因此，本领域迫切需要改良林可霉素生产菌的种子培养基，以期提高林可霉素的发酵效率。
发明内容本发明的目的在于提供一种优化的用于林可霉素发酵生产的种子培养基以及基于所述培养基的林可链霉菌种子培养方法。在本发明的第一方面，提供一种林可链霉菌种子培养基，所述培养基含有碳源、氮源、磷源、无机盐，培养基中含有以下必要组分淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，硝酸铵，和硫酸铵，且它们的含量如下淀粉18.7±2g/L;葡萄糖24.3±1g/L;黄豆饼粉22.3±1g/L;硝酸铵1.33±0.2g/L;硫酸铵2±0.1g/L。淀粉在另一优选例中，所述的培养基是液体培养基。更优选的，将各组分溶于水中，形成液体培养基。在另一优选例中，所述的培养基由碳源、氮源、磷源、无机盐、微量元素构成。在另一优选例中，培养基中淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，硝酸铵，和硫酸铵的含量如下18.7±1g/L;24.3±0.5g/L;黄豆饼粉22.3±0.5g/L;硝酸铵1.33土0.1g/L;硫酸铵2±0.05g/L。在另一优选例中，培养基中还含有选自下组的组分玉米浆，牛肉膏，酵母膏，或它们的组合。在另一优选例中，玉米浆，牛肉膏，或酵母膏的含量是26士6g/L。在另一优选例中，玉米浆，牛肉膏或酵母膏的含量是26土3g/L。在另一优选例中，培养基中还含有以下组分碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠。在另一优选例中，碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠的含量如下7±2g/L;0.7±0.2g/L;0.045±0.02g/L;0.85±0.2g/L。氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠的含量如下7±1g/L;0.7±0.1g/L;0.045±0.01g/L;0.85±0.1g/L。在另一优选例中，所述的培养基基本上由组分淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，硝酸铵，硫酸铵，玉米浆，碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠添加于水中而构成。碳酸钙氯化钠磷酸二氢钾硝酸钠在另一优选例中，碳酸钙,碳酸钙氯化钠磷酸二氢钾硝酸钠在本发明的第二方面，提供所述的培养基的用途，用于林可链霉菌的种子培养。在本发明的第三方面，提供一种林可链霉菌种子培养的方法，所述方法包括采用所述的培养基培养林可链霉菌种子。在另一优选例中，培养温度是30±2°C;优选的，培养温度是3o±rc;更优选的，培养的温度是30土0.5°C在另一优选例中，培养时每分钟的通气量是1.2±0.2L/L培养基；优选的，培养时每分钟的通气量是1.2±0.1L/L培养基；更优选的，培养时每分钟的通气量是1.2±0.05L/L培养基。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。图1显示了硫酸铵与葡萄糖交互影响菌体浓度的曲面图(A)及等高线图(B)。图2显示了pH(A)和菌体浓度(B)的变化曲线。具体实施方式针对目前现有技术中林可链霉菌培养基组分配比不合理，林可链霉菌生长和繁殖速率较小，培养周期长，培养工艺繁杂，种子易老化等缺陷，本发明人经过反复的研究和试验，首次揭示一种优化的林可链霉菌种子培养基，该培养基配比合理，林可链霉菌生长和繁殖速率高，培养周期短即可达到高的菌浓，从而可有效避免种子的老化，有效提高后续林可霉素发酵过程的生产效率。在此基础上完成了本发明。本发明人通过以下方法对培养基进行优化首先设定初始培养基，并以淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉，硝酸氨和硫酸铵作为影响因子，进行两水平因子设计，结果确定葡萄糖和硫酸氨为显著影响因子。根据软件分析的结果，得到淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉，硝酸氨和硫酸铵的较佳配比。然后，以葡萄糖和硫酸铵为显著影响因子进行响应面设计，淀粉、黄豆饼粉、硝酸铵按照较佳配比不变，其余因子按照初始配比不变，进一步优化得到葡萄糖、硫酸铵的最佳配比。根据前述的优化结果，并且经过本发明人反复多次的配比试验，证实了林可链霉菌种子培养基中淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉，硝酸氨和硫酸铵的较佳含量如表1。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明的培养基中除了含有上述必要组分以外，还可含有其它氮源、无机盐、或微量元素等常规的培养基成份。碳源是指能提供微生物营养所需碳元素的营养源。氮源是指能提供微生物营养所需氮元素的营养源。无机盐是构成菌体成分、酶活性基组成或维持酶活性、调节渗透压、pH等的成份。这些常规的成份，可以采用常规的链霉菌培养基中相应成份及用量。这些成份可用本领域技术人员熟知的其它成份替代，且本领域的技术人员可以根据常规知识确定其作为本发明的优选方式，所述的培养基中还含有选自下组的组分玉米浆，牛肉膏，酵母膏，或它们的组合。优选的，玉米浆，牛肉膏，或酵母膏的含量是26土6g/L。更优选的，玉米浆，牛肉膏或酵母膏的含量是26土3g/L。作为本发明的优选方式，所述的培养基中还含培养基中还含有以下组分碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠。优选的，碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠的较佳含量如表2。较佳配比更佳配比碳酸钙7±2g/L;7士1g/L;氯化钠0.7±0.2g/L;0.7±0.1g/L;磷酸二氢钾0.045±0.02g/L;0.045±0.01g/L;硝酸钠0.85±0.2g/L。0.85±0.1g/L。本发明的培养基可以直接配制成液态，从而用于林可链霉菌的培养；此外，本发明的培养基也可以被配制成固态形式，在需要时溶解于溶剂(如水)。本领域人员在参考了本发明提供的组分配比后，很容易根据配比来配制固态或液态的培养基。经本发明人优化后的培养基配方，它含有足够的营养成份，配方合理，足以满足林可链霉菌种子培养的营养所需，菌体生长和繁殖速率高，培养周期短即可达到高的菌浓，特别有利于后续林可霉素发酵过程。将优化后的种子培养基配方与初始的配方相比较，初始种子培养基中葡萄糖和硫酸铵的含量均偏高，而淀粉和黄豆饼粉的含量则偏低。本发明人在效果验证中发现，采用初始培养基培养，在开始的一段培养时间内，由于林可链霉菌周围高渗透压环境或分解代谢物阻遏效应的影响，其生长和繁殖受到抑制，培养周期太长，缺点主要表现在两方面一是种龄长，种子老化，进入发酵过程后，导致林可链霉菌生产"后劲"不足现象，生产效率低；二是增加了染菌的几率。而优化培养基中减少了速效碳氮源的含量，适当增加了迟效碳氮源的含量，大大縮短了种子培养周期；进入发酵过程后，林可链霉菌生理活性强，代谢水平高，生产"后劲"很足，为提高生产效率提供了基本保障。作为本发明的一种优选实施方式，所述的培养基的组分和含量为(g/L):淀粉18.7，葡萄糖24.3，黄豆饼粉22.3，硝酸铵1.33，硫酸铵2，玉米浆26，碳酸钙7，氯化钠O.7，磷酸二氢钾0.045，硝酸钠O.85。各组分溶于水中制成液态培养基。在本发明的一个实施例中，所述培养基与优化以前的培养基相比，培养时间大大縮短，由50多小时縮短为20小时左右；并且，优化后的培养基在培养20小时的菌浓高于优化前培养基在培养53小时的菌浓。本发明的培养基适合于不同规模的林可链霉菌的种子培养，如摇瓶规模的种子培养以及发酵罐规模(如15L种子罐)的种子培养。本发明还提供一种林可链霉菌种子培养的方法，所述方法包括用本发明提供的种子培养基进行培养。培养林可链霉菌的其它条件(如温度、湿度、通气量等)可采用本领域已知的条件。作为本发明的优选方式，培养温度是30士2。C;优选的，培养温度是30土1°C;更优选的，培养的温度是30土0.5°C。作为本发明的优选方式，培养时每分钟的通气量是1.2±0.2L/L培养基；优选的，培养时每分钟的通气量是1.2±0.1L/L培养基；更优选的，培养时每分钟的通气量是1.2±0.05L/L培养基。本发明的主要优点在于(1)本发明的培养基配比合理，林可链霉菌生长和繁殖速率高，培养周期短即可达到高的菌浓，从而可有效避免种子的老化，有效提高后续林可霉素发酵过程的生产效率。(2)由于培养基配方合理，且所需培养时间短，因此无需进行中间补料，在培养原料利用率高且浪费少的基础上，操作也大大简化。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。材料与方法l.仪器FUS-15L多参数全自动控制发酵罐(上海国强生化工程装备有限公司)。2.菌种与培养基菌禾中林可链毒菌(6Yre/^M7yce517//C07/7e/75^'51，>5".7jf'/7C07/7e/LS/51)L—427，购自江西国药有限责任公司。3.种子培养方法(1)摇瓶种子培养将母瓶中的种子液按6y。的接种量接种至摇瓶种子培养基(500ml摇瓶)，摇床转速为220r/min，在温度为30。C和相对湿度为4045%的培养间培养48h。(2)FUS-15L罐中的种子培养摇瓶种子液按10%的接种量接种至15L罐种子培养基(灭菌后种子培养基体积约7L)，搅拌转速为260400r/min，每分钟通入1L培养液的灭菌空气体积为1.2L。4.测定方法细胞干重(DCW):吸取发酵液10ml，称湿重，布氏漏斗抽滤，湿固形物水洗3次后8(TC恒温烘12h，称重，计算DCW(g/L)。总糖(TS)和还原糖(RS)含量采用斐林氏法测定[参见北京大学生物系生化教研室；生物化学实验指导[M];高等教育出版社，1986:92-96.]。实施例1两7夂平因子设计(2LevelFactorialDesign)本实施例从培养基的影响因子中找出显著影响因子，采用两水平因子设计。本研究的实验设计、数据分析及响应值优化采用DesignExpert7.0软件来进行。设计的初始培养基配方为(g/L):淀粉14，葡萄糖28，黄豆饼粉20，玉米浆26，氯化钠0.7，硝酸钠0.85,碳酸钙7，硝酸铵2，硫酸铵2.3，磷酸二氢钾0.045。根据前期试验，在初始种子培养基中淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、硝酸铵和硫酸铵为较为关键的因素。因此选取淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、硝酸铵和硫酸铵为影响因子进行两水平因子设计，其余组分含量同初始培养基。各因子浓度范围的设定如表3所示。表3变量高低水平值的设定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>两水平的因子设计及实验结果如表4所示。以菌浓(PMV)作为响应值，由软件分析得到的方差分析结果如表5所示。表4两水平因子设计及实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>130.820.90.030.0437.31.870.56140.30.50.40.060.0433.30.450.55150.820.40.060.0432.31.970.48160.551.250.650.0450.075430.790.58170.30.50.40.030.11410.510.65表5方差分析表平方和DF均方离差F值几率〉F模型695.916115.985.420.0125显著B413.111413.1119.300.0017显著AB30.53130.531.430.2629AC21.86121.861.020.3387AD18.71118.710.870.3743BE196.701196.709.190.0142显著CD15.02115.020,700.4240曲率78.26178.263.660.0882非显著残差192.64921.40总闺差966.8016本设计模型的F值为5.42，由于噪声的影响而出现大于F值的几率仅为0.0125%(<0.05%)，故本设计模型是显著的。影响因子B(Glucose)、BE(Glucose与硫酸铵的交互作用项)的F值分别为19.3和9.19，由于噪声影响而出现比各自F值大的几率(Prob)均在5W以下，故它们对模型的影响是显著的。曲率的F值为3.66，出现比F值大的几率为0.0882%(>0.05%),说明模型的响应曲面显著弯曲，进一步说明模型具有很强的显著性。再结合另外两个响应值进行综合分析，确定葡萄糖和硫酸铵为显著影响因子。由软件分析得到一组优化配比(g/U:淀粉18.7，葡萄糖26.9，黄豆饼粉22.3，硝酸钠1.33，硫酸铵1.8(其它组分含量同初始培养基)。实施例2响应面设计(Responsesurfacedesign)以葡萄糖和硫酸铵为显著影响因子进行响应面设计，其余因子在每一设计组中的含量(g/L)相同，即淀粉18.7，黄豆饼粉22.3，硝酸铵1.33，玉米浆26，碳酸钙7，氯化钠0.7，磷酸二氢钾0.045,硝酸钠0.85。实验设计和分析结果分别如表6-表IO所示。_表6变量高低水平值的设定_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表8方差分析<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>表9相关系数分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>多元回归方程为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage14</formula>回归方程的确定系数R2为0.9659，该方程对菌浓的预测值是可信的。硫酸铵与葡萄糖交互影响菌体浓度的曲面图(A)及等高线图(B)见图1。由图l知，在一定的浓度范围内，葡萄糖和硫酸铵对PMV的影响具有正协同作用，这说明林可链霉菌在进行快速生长和繁殖的过程中需要有一定浓度的易利用碳源(葡萄糖)和易利用氮源(硫酸铵)；当培养基中的葡萄糖和硫酸铵超过一定浓度范围时，PMV迅速下降，可能有以下几个方面的原因一是大量葡萄糖被快速利用，产生较多的有机酸，部分分泌至胞外，导致发酵液的pH降低；硫酸铵是一种生理酸性盐，在发酵起始阶段，丙氨酸脱氢酶(VDH)同化NH/的速率较大，生成较多的H+，导致pH值迅速下降；同时，菌体产生C02溶解在发酵液中也使其酸度增大，上述几个因素的综合作用，使得发酵液的pH值降至很低值(如pH<6.0)，如菌体长时间处于此环境中，可能导致细胞膜的通透性增大而使菌体初级代谢的一些关键调控酶的活力下降；二是发酵液中葡萄糖浓度太高时，林可链霉菌在高渗透压的环境中不能进行正常的生理活动。三是葡萄糖的分解代谢物阻遏效应，迟效碳源(如淀粉)难于被林可链霉菌利用；高浓度的NH/抑制林可链霉菌对迟效氮源(如黄豆饼粉)的降解，实验发现，此环境条件下生长的菌丝耐剪切能力较小，菌体因为受到机械性损伤而降低代谢水平。当PMV的预测值为52.36%时，葡萄糖和硫酸铵的浓度分别为24.3和2g/L，即二级种子培养基的优化配比(g/L)为淀粉18.7，葡萄糖24.3，黄豆饼粉22.3，硝酸铵1.33，硫酸铵2，玉米桨26，碳酸钙7，氯化钠O.7，磷酸二氢钾0.045，硝酸钠0.85(培养基1)。实施例3培养基的配制培养基的配方如表io所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>配制培养基的方法精确称取各组分，将各组分混合后加适量蒸馏水溶解，定容，使培养基中个组分满足表中配比。实施例4验证实验将初始培养基和优化培养基(培养基l)分别用于FUS-15L种子罐培养，培养过程中的pH变化和PMV变化如图2A和图2B所示。可见培养基1仅需要不到20小时即可获得很高的菌浓，20h时PMV为51%，pH回升至7.3以上；而初始培养基在53小时的菌浓仅为40%。经发酵试验检测，采用培养基1获得的种子活性高，生产林可霉素的产率高；而采用初始培养基获得的种子种龄高，活性差，生产林可霉素的产率明显低。将培养基2、培养基3和培养基4分别用于FUS-15L种子罐培养，其它培养条件同前，结果发现，均在20-25小时即可获得很高的菌浓，种子不易老化。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。权利要求1.一种林可链霉菌种子培养基，所述培养基含有碳源、氮源、磷源、无机盐，其特征在于，培养基中含有以下必要组分淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，硝酸铵，和硫酸铵，且它们的含量如下淀粉18.7±2g/L；葡萄糖24.3±1g/L；黄豆饼粉22.3±1g/L；硝酸铵1.33±0.2g/L；硫酸铵2±0.1g/L。2.如权利要求1所述的培养基，其特征在于，培养基中淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，硝酸铵，和硫酸铵的含量如下淀粉18.7±1g/L;葡萄糖24.3±0.5g/L;黄豆饼粉22.3±0.5g/L;硝酸铵1.33±0.1g/L;硫酸铵2±0.05g/L。3.如权利要求l所述的培养基，其特征在于，培养基中还含有选自下组的组分玉米浆，牛肉膏，酵母膏，或它们的组合。4.如权利要求3的培养基，其特征在于，玉米浆，牛肉膏，或酵母膏的含量是26土6g/L。5.如权利要求l所述的培养基，其特征在于，培养基中还含有以下组分碳酸f丐，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠。6.如权利要求5所述的培养基，其特征在于，碳酸钙，氯化钠，磷酸二氢钾，和硝酸钠的含量如下碳酸钙7±2g/L;氯化钠0.7±0.2g/L;磷酸二氢钾0.045±0.02g/L;硝酸钠0.85±0.2g/L。7.权利要求1所述的培养基的用途，其特征在于，用于林可链霉菌的种子培养。8.—种林可链霉菌种子培养的方法，其特征在于，所述方法包括釆用权利要求1所述的培养基培养林可链霉菌种子。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，培养温度是30士2'C。10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，培养时每分钟的空气通气量是1.2±0.2L/L培养基。全文摘要本发明属于微生物发酵领域，公开了一种林可链霉菌种子培养基，所述培养基含有碳源、氮源、磷源、无机盐，且含有以下必要组分淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，硝酸铵，和硫酸铵，本发明还公开了各必要组分的优化配比。本发明的培养基配比合理，利用该培养基培养，林可链霉菌生长和繁殖速率高，培养周期短即可达到高的菌浓，从而可有效避免种子的老化，有效提高后续林可霉素发酵过程的生产效率。文档编号C12N1/20GK101220343SQ20081003295公开日2008年7月16日申请日期2008年1月23日优先权日2008年1月23日发明者炬储,夏建业,庄英萍,张嗣良,啸李,杭海峰,王永红,郭美锦申请人:华东理工大学