一种从深度加工型中药或中药材中提取dna的方法

专利名称：一种从深度加工型中药或中药材中提取dna的方法
技术领域：
本发明涉及中药技术领域，更具体地，涉及中药中的DNA提取技术领域，特别是 指 一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，非常适合于深度加工型产品， 尤其是因深度加工而导致DNA含量极少，片段极短的中草药或中草药材，更尤其是由 动物皮、骨熬炼，精制而成的胶类中药或中药材。
背景技术：
我国传统中药博大精深，可用作中药的物质种类繁多，其中有一类是利用动物皮、 骨熬制而成的胶类中药，包括阿胶、黄明胶、龟曱胶、鹿角胶等。这些胶类中药往往 十分名贵，是滋阴潜阳、增强体质的上乘佳品。阿胶作为一种传统名贵中药，有着2000多年的历史。早在东汉时期的著名医药著 作《神农本草经》中就被列为"上品"，并记载"久服益气轻身"。魏晋时期的药物学集 成《名医别录》中记载阿胶"出东平郡，东阿县"。南北朝梁武帝时期陶弘景在《本草 经集注》中记载，"阿胶出东阿，故名阿胶"。阿胶性甘，平，其功能主要补血滋阴， 润燥、止血。用于血虚萎黄，眩暈心悸，肌痿无力，心烦不眠，虚风内动，肺燥咳嗽， 劳嗽唠血，吐血尿血，便血崩漏，妊娠胎漏，这些功能在《本草纲目》中有详细记载。 据2005年版的中国药典记载，阿胶本品为马科动物驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制 成的固体胶。无论是古代还是现代，阿胶都享有很高的声誉。黄明胶又称牛皮胶，为黄牛皮熬制而成。历史上也曾经使用牛皮熬制阿胶，发展 到现在，阿胶则以驴皮熬制为贵。黄明胶与阿胶一样，同样具有养血止血的功效，治 疗诸血症尤有特效。据2005年版中国药典记栽，龟曱胶及鹿角胶等名贵中药分别是用龟甲及鹿角经水 煎煮浓缩制成的固体胶。其中龟甲胶性咸、甘、凉，能够滋阴，养血，止血，用于阴 虚潮热，骨蒸盗汗，腰膝酸软，血虛萎黄，崩漏带下；而鹿角胶性甘、咸、温，能够 温补肝肾，益精养血。用于肝肾不足所致的腰膝酸冷，阳痿遗精，虚劳羸瘦，崩漏下 血，便血尿血，阴疽肿痛。由此可见，胶类中药主要用于调节身体机能，滋阴潜阳，增强体质，并且对肾虚， 贫血病人具有很好的疗效。因此，该类中药在整个中药市场上占有重要的位置，深受消费者的青睐。然而，随着胶类中药市场的不断发展，随着熬胶原料供应的紧张和原料价格的上 涨， 一些不法分子趁虚而入，制造假冒伪劣产品来迷惑消费者，扰乱市场的正常秩序。 以阿胶为例，国家药典规定正品阿胶应该由驴皮熬制而成，然而不法分子则变相压低 成本，在制备阿胶过程中，部分或全部掺入其他的动物皮，例如马皮、牛皮、猪皮或 其它动物杂皮进行熬制。通过这种方式熬制而成的'伪品阿胶'在外观及质地上都与正 品阿胶极其相似，并且价格低廉，因此，这类'伪品，对消费者而言很具有迷惑性。但 是，从功用上来看，它们则没有显著的疗效，并且还很可能对人体有害。因此，这些 伪品的存在对整个阿胶中药市场的危害是相当大的，不仅损害了消费者的利益，还败 坏了传统中药的名声。再例如黄明胶、龟曱胶等，也存在这种类似的情况。总而言之， 这些伪劣产品严重破坏了我国传统中药的形象损害了消费者的健康，不利于我国中药 事业的健康发展。因此，为了保护我国的传统胶类中药以至于整个中药产业，我们急 需建立一种高效、可靠的针对这种深度加工型胶类中药的鉴定方法，将市场上的假冒 伪劣产品与正品进行区分。传统的鉴别胶类物质真伪的方法主要是通过对产品的外观，颜色，气味等的考察 来实现的。 一方面，这些方法的应用很多都是凭经验进行判断，不仅掌握困难，误判 率高，并且在判断过程中存在大量的人为主观因素；另一方面，'伪品胶类物质，相对 正品而言，只是在制作原料上存在差异，成品之间则无论是外观或是质地方面的差异 都并不显著。因此，传统的鉴别胶类物质真伪的方法很难有效的打击胶类中药市场上 的伪品。然而，随着生物学技术的不断发展， 一些基于DNA的生物学鉴定手段逐渐丰富起 来，包括各种分子标记的使用等，这种基于DNA的生物学鉴定方法往往准确性高，重 复性好，相对于传统方法而言更具科学性，更能适应实际应用的需要。目前这一技术 已经广泛的应用于司法鉴定、食品饲料检测、进出口检验等领域，已经为人们所广泛 接受。与此同时，基于DNA的生物学鉴定方法也被成功应用于中药鉴定领域，例如对 蛇类药材的PCR鉴定等。因此，针对传统胶类中药鉴别手段相对落后的现状， 一种基 于DNA的高效，便捷的生物学鉴别方法的建立将极大的促进整个胶类中药市场的防伪 打假工作。利用基于DNA的生物学鉴定技术来进行胶类中药的鉴定，所面临的最大问题在于 如何从这种深度加工型中药中提取得到DNA。 一方面，由于胶类中药在整个制备过程 中，往往经过泡碱水、高温高压蒸煮等操作，其DNA被严重破坏，并且大量损失，因 此成品中所含有的DNA含量极少，片段极短，如何富集这些仅有的少量DNA片段是提取胶类物质DNA过程中所必须面临的一个挑战；另一方面，胶类中药中最主要的成 分是各种胶原蛋白等肽段，这些蛋白的存在必然对DNA提取和纯化工作造成严重的干 扰，如何克服这些大量存在的蛋白质对DNA提取的影响是整个胶类物质DNA提取过 程中所必须面临的另 一个挑战。此外，我们提取所得到的胶类物质DNA还应该能够达 到 一 些包括PCR在内的常规分子生物学操作的要求，以便于后续鉴定。由于胶类物质的特殊性，它的少量的短片段DNA混杂于在大量的胶原蛋白肽段 中，因此，从胶类物质中成功提取得到能进行后续分子生物学操作的DNA的难度是相 当大的。事实上目前国内外还没有任何成功从胶类物质中提取出DNA的相关报道。一传统的酚/氯仿抽提方法，这种方法利用酚使得蛋白及各种肽段变性，经过萃取操作 以后，蛋白聚集在水相和有机相的中间层，然后将水相取出，从而达到将核酸与蛋白 分离的目的。对普通的生物制品而言，它们的蛋白含量是有限的，经过几次简单的酚 抽提，人们可以方便的除去这些制品中的蛋白，因此利用这种方法，人们能够快速高 效提取得到普通生物制品中的DNA。然而，胶类中药是一种深度加工的产品，其中含 有大量的胶原蛋白( 一般超过总重量的80% )和极少量的破坏严重的DNA ，在提取DNA 过程中，这种特殊生物制品仅仅依靠几次常规酚/氯仿抽提操作是无法除尽其中含有 的大量蛋白的。为了除去大量蛋白，人们往往会增加酚抽提次数，然而这种简单的做 法势必造成样品中DNA的大量损失，因此常规酚/氯仿抽提方法并不适用胶类物质 DNA的提取。再例如碱裂解法，这种方法是利用碱性条件对蛋白的破坏作用来除去样 品中的蛋白，当样品中仅仅含有少量蛋白时，这种方法是便捷、有效的，但是当样品 例如胶类中药中含有大量蛋白时，利用该法就很难达到除尽蛋白的目的，所得到的 DNA提取液也势必蛋白含量高，影响后续的分子生物学操作。再例如CTAB法，这种 方法主要应用于植物细胞DNA的提取，因为CTAB能够与DNA形成复合物，而这种复 合物在高盐浓度环境下是溶解的，转到低盐浓度环境下，这种复合物析出，通过这种 转换，就能够实现样品DNA与蛋白类及多糖类物质的分离。这种方法如果用在胶类物 质DNA提取上，其局限性与之前的2种方法是类似的，胶类物质所含有的大量蛋白会 严重干扰CTAB与DNA复合物的形成，并且在通过离心操作分离复合物的过程也会混 杂大量的蛋白，试验证明，利用这种方法我们同样很难提取出胶类中药的DNA。再例 如硅材料吸附法，包括硅材料膜，硅材料树脂等，这种材料的表面电荷在高离子序溶 液中会发生重组，从而能够吸附DNA分子。这种吸附作用与溶液pH密切相关， 一般 而言，中性偏酸性环境有利于DNA的吸附，而中性偏^喊性环境则有利于DNA的解吸。 目前，常用的高离子序溶液有盐酸胍、异硫氰酸胍、高氯酸钠等，在这种溶液环境下，肽段将大量变性，人们就可以通过硅材料对DNA的吸附、解吸作用来实现DNA的富 集。但是同样的，胶类中药蛋白含量极高，大量的蛋白会对整个硅材料对DNA的吸附 造成严重的干扰，如果在提取过程中不对胶类物质做一些预处理，首先除去部分蛋白 的话，直接利用这种方法同样很难顺利提取出胶类中药的DNA。此外，利用这种方法 所采用的高离子序溶液也十分关键，有研究表明，不同的溶液环境下，硅材料吸附 DNA的性质是不同的，在某些溶液环境下，硅材料可能比较适合于吸附大片段核酸分 子，但在另一些溶液环境中，硅材料可能就比较适合于吸附小片段的核酸分子。对于 胶类中药这种深度加工的产品，其DNA含量极少，并且破坏极其严重，它所包含的显 然都是 一 些小分子的DNA片段，因此选用 一 种有利于小分子DNA吸附的溶液环境是 非常重要的。 '可以发现，单纯使用目前存在的任何一种常用的DNA提取方法来提取胶类中药 中的核酸，我们也许能够得到少量的DNA样品，但是想继续应用于后续的分子生物学 检测是非常困难的，事实上，如果直接采用目前市面上的各种国内外DNA提取商业化 试剂盒进行阿胶DNA提取，我们同样也很难得到能够满足后续检测要求的DNA样品。 因为不可避免的，这些方法本身都没能有效的针对胶类中药中蛋白含量极高，DNA 含量低，片段短的特点。因此，要建立一种能够应用于后续分子生物学操作的胶类中 药DNA提取方法就必须在现有基础上，对这些常规方法包括商业化试剂盒的方法进行 一些必要的，有针对性的调整和改进。发明内容本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种从深度加工型中药 或中药材中提取DNA的方法，该方法快速、简便、可靠、效率高，特别适合因深度加 工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药，获得的DNA能够用于后续常规分子生 物学搡作，为利用DNA生物学鉴定技术实现胶类中药的鉴别提供基础。为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，其特点是，包括下列步骤a) 用消化液对所述深度加工型中药或中药材进行预处理，使所述深度加工型中 药或中药材中的大量胶原蛋白降解，少量DNA则被完全释放溶解于所述消化液中，获 得预处理液；b) 采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述预处理液中的DNA。 所述预处理包括粉碎所述深度加工型中药或中药材成颗粒，加入所述消化液，所述消化液弱碱性且含有SDS，搅拌加热溶解所述颗粒，加入蛋白酶进行消化，所述抽提方法是硅材料吸附法。所述消化液是Tris'EDTA溶液，pH为6 9,所述硅材料吸附法中采用了针对短片 段核酸吸附的高离子型溶液。所述消化液的pH为8.0，含有10mmol/L Tris-HCl、 25mmol/L EDTA、 100mmol/L NaCl和0.5。/。 SDS,所述高离子型溶液是PN緩冲液，所述蛋白酶是蛋白酶K。在所述步骤a)和所述步骤b)之间，还包括步骤加入除油脂试剂进行萃取，除 去所述处理液中含有的大量油脂。所述除油脂试剂是正己烷。上方法在提取所述深度加工型中药或中药材的DNA中的应用。 所述深度加工型中药或中药材是因深度加工而导致DNA含量极少，片段极短的中 草药或中草药材。所述深度加工型中药或中药材是由动物皮、骨熬炼、精制而成的胶类中药或中药材。采用本发明的方法，通过预处理，在尽量不损伤DNA的前提下，使用了含有SDS 的Tris'EDTA溶液溶解，并用蛋白酶消化，降解胶类中药中所存在的大量胶原蛋白， 若其中含有较多油脂，可加入除油脂试剂萃取其中的大量油脂，将其中的DNA完全释 放出来，然后再根据胶类中药中DNA分子在经过各种处理之后含量极少，并被大量降 解成小片段的特点，以及为了减少过多提取步骤对DNA造成的损失，采用硅材料吸附 法对该DNA进行富集，并且在吸附过程中采用主要针对短片段核酸吸附的高离子型溶 液，在这种溶液环境下，硅材料对小分子DNA吸附效率较高。最终，通过硅材料对 DNA的吸附与解吸，成功提取得到了胶类中药的DNA。所得到的DNA能够适用于一 些常规的分子生物学操作包括PCR、酶切等，以便于利用DNA生物学鉴定技术来鉴定 这些深度加工的胶类中药产品。该方法快速、简便、可靠、高效率地从深度加工而导 致核酸含量极少、片段极短的胶类中药中提取DNA,尤其是从由各种动物皮、骨熬制 而成的各种胶类中药包括阿胶、黄明胶、龟曱胶、鹿角胶等中提取DNA。


图1是采用本发明的方法从阿胶中提取的DN A的马科动物基因组特异性S IN E序 列ERE-1的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker; 2.驴肉基因组DNA阳性对照；3.阿胶 提取DNA; 4.空白对照。图2是采用本发明的方法从黄明胶提取的DNA的反刍动物基因组特异性SINE序 列Bov-A2的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker; 2.牛肉基因组DNA阳性对照；3.黄明胶提取DNA; 4.空白对照。图3是采用本发明的方法从猪皮胶提取的DNA的猪科动物基因组特异性SINE序 列PRE-1的PCR扩增结果。其中l.DNA Marker; 2.猪肉基因组DNA阳性对照；3.猪皮 胶提取DNA; 4.空白对照。图4是采用本发明的方法从龟曱胶提取的DNA的陆龟超科基因组特异性SINE序 列polIII/SINE的PCR扩增结果。其中l.DNA Marker; 2.龟基因组DNA阳性对照；3.龟 曱胶提取DNA; 4.空白对照。图5是采用本发明的方法从鹿角胶提取的DNA的反刍动物基因组特异性SINE序 列Bov-A2的PCR扩增结果。其中1.DNA Marker; 2.牛肉基因组DNA阳性对照；3.鹿 角月交4是取DNA; 4.空白对照。图6是用乙醇沉淀法从阿胶提取DNA的马科动物基因组特异性SINE序列ERE-1的 PCR扩增结果。其中l.驴肉基因组DNA阳性对照；2.阿胶提取DNA; 3.空白对照； 4.DNA Marker; 5.驴肉基因组DNA阳性对照；6.阿胶提取DNA; 7.空白对照。
具体实施方式
本发明的方法的具体步骤如下1、 胶类中药的预处理将胶块锤击成颗粒状，取出若干加入一只50ml无菌离心 管中，并向其中加入消化緩冲液，该緩冲液pH8.0,由10mmol/L Tris-HCl, 25mmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl, 0.5% SDS构成，然后将离心管置于50。C-60。C水浴中保温， 其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。待溶液冷却至室温后，加入蛋白 酶K溶液，混匀，56。C保温l小时，其间不时轻微摇匀。对于含脂肪较多的样品，如 猪皮胶，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液中加入除油脂试剂进行萃取，除去样 品中含有的大量油脂。2、 胶类中药DNA的提取向上述阿胶预处理液中加入PN緩冲液，混匀，分若干 次加入硅吸附柱中，离心，将溶液中DNA小心的吸附于吸附柱的硅膜上，再于吸附柱 中加入PE緩冲液洗涤吸附柱膜，除去附着在膜上的少量蛋白及脂类物质，完毕之后用 热的pH 8.0的TE緩冲液将吸附柱膜上的DNA洗脱收集下来并置于-2(TC保存。提取得 到的DNA可用紫外分光光度法定量，并进行后续的PCR操作。上述提取操作过程中所用试剂、耗材皆来自商业化试剂(德国QIAGEN公司)， 包括PN緩沖液(Cat. No. 1卯71 ) 、 PE緩冲液(Cat. No. 19065 )、硅吸附柱(Cat. No. 28304)。本方法简便，快捷，有效，能够从各种深度加工的胶类中药中顺利提取出DNA,并且能够进行后续分子生物学常规操作，能够满足实际中药生物学鉴定的要求。 为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进 一 步说明。 下述实施例涉及到的材料和试剂、DNA提取、定量、扩增及电泳条件如下1. 材料和试剂材料各种市场所售各类动物皮、骨等熬制而成的胶类中药，用作阳性对照的 各种动物的基因组DNA溶液(lng/VL)。 提取试剂消化緩冲液10mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 25mmol/L EDTA, 100mmol/L NaCl, 0.5%SDS,高压灭菌；TE緩冲液10mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 1 mmol/L EDTA，高压灭菌；PN緩冲液(产于德国QIAGEN, Cat. No. 19071 );PE緩冲液(产于德国QIAGEN, Cat. No. 19065 );吸附柱(产于德国QIAGEN, Cat. No. 28304 );蛋白酶K溶液20mg/ml (产于日本TAKARA， Cat. No. D卯33 );Premix Taq (Premix Ex T叫，Hot Start Version):(产于日本TAKARA， Cat. No. DRR030A);DNA荧光染料10000xGelRedTM: DNA荧光染料(产于Biotium, Cat. No. 41000 )。2. DNA^是耳又的流程1) 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2) 取lg粉碎胶样，加入lml的消化緩冲液，在60ml离心管中，封口 50-60。C水浴 中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混勻，直到颗粒状物质全部溶解。3) 待冷却至室温后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。CM呆温lh,其间 不时轻微摇匀。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均匀。5) *取混和液700i^l至吸附柱中，13000g常温离心l min,弃收集液。6) 重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)7) 加入500nl PE緩冲液于吸附柱中，13000g常温离心l min，弃收集液。8) 重复7操作2次。9) 将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2 min。10) 将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5 min 干燥。11) 加入lO(Hil预热(70°C) TE緩沖液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置3 min。12) 13000g常温离心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置l min。13) 13000g常温离心2 min，取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20。C保 存备用。*对于含脂肪较多的样品，如猪皮胶，可在混和液上柱吸附操作之前于混和液 中加入除油脂试剂进行萃取，除去样品中含有的大量油脂。3. 制备DNA的核酸定量将所提取胶类中药DNA进行核酸定量，利用紫外分光光度法检测其OD26o确定浓 度，并且根据OD26o/OD，值来考察所提取DNA样品纯度。将所提取的胶类中药DNA 稀释至10ng/)al备用。4. 制备DNA的PCR检测，确定其来源并且考察其是否可用于PCR反应，下面的 试验方法以阿胶、黄明胶、猪皮胶以及龟曱胶为例，试验方法和条件具体如下A) 引物设计根据马科动物(Equidae) SINE序列ERE-1设计，理论目标条带大小81bp,用于 检测阿胶中DN A 。其序列如下上游引物Assup : 5'-CGGACATGGCACTGCTCAT-3， 下游引物Assdown: 5'-TATATTCTTCGTTGTGGGTCCTTCT-3， 根据反刍亚目动物(Ruminantia) SINE序列Bov-A2设计引物，理论目标条带大小 70bp,用于检测黄明胶中DNA。其序列如下上游引物Rum up: 5'-AGAAGGCAATGGCAACCCAC-3' 下游引物Rum down: 5，-AACCCACCAGGCTCCTCTGT-3， 根据猪科动物(Suidae) SINE序列PRE-1设计引物，理论目标条带大小88bp,用 于检测猪皮胶中DNA。其序列如下上游引物Pig up: 5，-CGAATCCGACTAGGAACCA-3， 下游引物Pig down: 5，-ACCACATCTCACGGCTACG-3， 根据陆龟超科动物(Testudinoidea) SINE序列polIII/SINE设计引物，理论目标条 带大小72bp，用于检测龟曱月交中DNA。其序列如下上游引物 Turtle up: 5'-GAGCATTGGCCTGCTAAACC-3， 下游引物 Turtle down: 5，-TTTTGCCCCAGATCCCTAAA-3，B) PCR反应体系反应体系中各试剂用量根据反应体系的总体积进行适当调整。以检测阿胶、黄明胶、猪皮胶以及龟曱胶中DNA为例，PCR检测参考反应体系如下 检测阿胶提取DNA:25plPCR反应体系:P腿ix Taq 12，、 Ass up ( 10,ol/l) 0.5^1， Ass down UOpmol/1) 0.5^1, ^模板DNA ( 10ng/nL) 5-l(Hil、无菌超纯水补足反应体系，使总 体积为25^1。*:阳性对照样品中的DNA模板(IngVL)用量0.5-lpl。 检测黄明胶提取DNA:25^1 PCR反应体系:Premix Taq 12.5^1、 Rum up ( 10pmol/l) 0，, Rum down (lO^mol/1) 4莫板DNA 5-10(^1、无菌超纯水补足反应体系，使总体积为25pl。*:阳性对照样品中的DNA模板量(lng L)用0.5-lpl。 检测猪皮胶提取DNA:25)^1 PCR反应体系:Premix Taq 12.5^1、 Pig up ( lO^imol/l) 0.5^il, Pig down (lO^imol/1) 0.5pl， ^莫板DNA 5-10W、无菌超纯水补足反应体系，使总体积为25pl。 *:阳性对照样品中的DNA模板量(lng/^L)用0.5-lpl。 检测龟甲胶提取DNA:25|al PCR反应体系Premix Taq 12.5|il、 Turtle up( lOpmol/1) 0.5^1， Turtle down (lO^mol/1) 0.5^1， ^莫板DNA ( 10ng/pl) 5-10pl、无菌超纯水补足反应体系，使总体 积为25pl。*:阳性对照样品中的DNA模板量(lng小L)用0.5-lpl。 C. PCR反应条件以分别检测阿胶、黄明胶、猪皮胶、龟甲胶DNA的PCR反应为例，它们的反应条 件是类似的阿胶DNA检测变性94°C 6min;扩增94°C 30s, 60°C 30s, 72。C30s(40循 环)；最后延伸72 °C 7min黄明胶DNA检测变性94°C 6min;扩增94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s ( 40-50 循环)；最后延伸72°C 7min猪皮胶DNA检测变性94°C 6min;扩增94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s ( 30 循环)；最后延伸72°C 7min龟曱胶DNA检测变性94°C 6min;扩增94°C 30s, 50°C 30s, 72°C 30s ( 40-50 循环)；最后延伸72°C 7minD.电泳条件用1 xTAE电泳緩冲液制备2.5 %琼脂糖凝胶并按照参考比例混入荧光染料GelRedTM。按照比例将10pl的PCR产物与上样緩沖液均匀混合,加入凝胶孔中，所用的 DNA marker为20bp DNA Ladder Marker (日本TAKARA， Cat. No. D521A ),点样5jal 于凝胶孔中电泳。选择合适的电压(4V/cm-1 OV/cm )进行电泳，电泳时间为40-60分 钟，电泳结束后将凝胶块置于凝胶成像仪上观察并拍照。实施例l 提取阿胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测以市售阿胶(山东东阿阿胶股份有限公司)为材料，采用下述方法提取其中的 DNA。1) 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2) 取lg粉碎胶样，加入lml的消化緩冲液，在60ml离心管中，封口 50-60。C水浴 中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。3) 待冷却至室温后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。C保温lh,其间 不时轻微摇匀。4) 加入10mlPN緩冲液，混和均匀。5) 取混和液700(al至吸附柱中，13000g常温离心l min,弃收集液。6) 重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)7) 加入500pl PE緩沖液于吸附柱中，13000g常温离心l min,弃收集液。8) 重复7操作2次。9) 将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2 min。10) 将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5 min 干燥。11) 加入100pl预热(70°C) TE緩冲液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置 5 min。12) 13000g常温离心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置l min。13) 13000g常温离心2 min,取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20°〇保 存备用。利用核酸定量仪对所提取的阿胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯 度。浓度为21.0ng 1, OD26o/OD28o为1.26。由此可见，从lg阿胶样品中成功提取得到 DNA。用传统方法提取的驴肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增马科动物特异性 SINE序列ERE-1的引物，以本方法提取的阿胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图1。由图l,从阿胶中提取的DNA，利用扩增马科动物特异性DNA序列ERE-1的引物 进行PCR扩增，所得扩增片段与对照驴肉基因组的扩增片段大小完全一致。可见，利 用本方法确实能够正确提取得到阿胶中的DNA,包括其中因深度加工而含量极少、片 段极短的驴源性成分DNA,并且能完全满足后续PCR检测的要求。实施例2 提取黄明胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测以市售黄明胶(山东东阿阿胶股份有限公司)为原料采用下述方法提取其中的 DNA。1) 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2) 取1 g粉碎胶样，加入1 ml的消化緩沖液，在60ml离心管中，封口 50-60 °C水浴 中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。3) 待冷却至室温后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。C保温lh，其间 不时轻微摇匀。4) 加入10mlPN緩冲液，混和均匀。5) 耳又混和液700nl至吸附柱中，13000g常温离心lmin,弃收集液。6) 重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)7) 加入500pl PE緩冲液于吸附柱中，13000g常温离心l min，弃收集液。8) 重复7操作2次。9) 将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。10) 将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5 min 干燥。11) 加入100nl预热(70°C) TE緩冲液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置 5 min。12) 13000g常温离心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温》文置1 min。13) 13000g常温离心2 min，取收集液分装，即为换_取得到的DNA液，-20°。保 存备用。利用核酸定量仪对所提取的黄明胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及 纯度。浓度为26.6ng/^1, OD26o/OD28()为1.35。由此可见，从lg黄明胶样品中成功提取 得到DNA。用传统方法提取的牛肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列Bov-A2的引物，以本方法提取的黄明胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴 定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图2 。由图2,从黄明胶中提取的DNA,在利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列 Bov-A2的引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照牛肉基因组的扩增片段大小 完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到黄明胶中的DNA,包括其中因深 度加工而含量极少、片段极短的牛源性成分DNA并且能完全满足后续PCR检测的要 求。实施例3 提取猪皮胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测以山东东阿阿胶股份有限公司研究所利用猪皮熬制的猪皮胶为原料采用下述方 法提取其中的DNA。1) 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2) 取lg粉碎胶样，加入lml的消化緩冲液，在60ml离心管中，封口 50-60。C水浴 中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。3) 待冷却至室温后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。C保温lh，其间 不时轻微摇匀。4) 加入10mlPN緩冲液，混和均匀，加入2ml正己烷，轻微颠倒混匀，3000g, 4。C离心5min,弃上清，将下层溶液转移到干净的50 ml离心管中。5) ^^混和液70(^1至吸附柱中，13000g常温离心lmin,弃收集液。6) 重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。7) 加入500)ilPE緩冲液于吸附柱中，13000g常温离心lmin,弃收集液。8) 重复7操作2次。9) 将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。10) 将吸附柱取出，转移至新的1.5ml EP管中，打开吸附柱盖，常温放置5 min 干燥。11) 加入100nl预热(70°C) TE緩冲液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置 5 min。12) 13000g常温离心l min，取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置l min。13) 13000g常温离心2 min,取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20°。保 存备用。利用核酸定量仪对所提取的猪皮胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为177.6ng/nl， OD26o/OD28o为1.8。由此可见，从lg猪皮胶样品中成功提取 得到DNA。用传统方法提取的猪肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增猪科动物特异性 SINE序列PRE-1的引物，以本方法提取的猪皮胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方 法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图3 。由图3,从猪皮胶中提取的DNA，在利用扩增猪科动物特异性SINE序列PRE-1的 51物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照猪肉基因组的扩增片段大小完全一 致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到猪皮胶中的DNA，包括其中因深度加工 而含量极少、片段极短的猪源性成分DNA，并且能完全满足后续PCR检测的要求。实施例4 提取龟曱胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测以市售龟甲胶(山东东阿阿胶股份有限公司生产)为原料，采用下述方法提取其 中的DNA。1) 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2) 取lg粉碎胶样，加入lml的消化緩冲液，在60ml离心管中，封口50-60。C水浴 中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混勻，直到颗粒状物质全部溶解。3) 待冷却至室温后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。C保温lh,其间不 时轻微摇匀。4) 加入10mlPN緩沖液，混和均匀。5) 取混和液700pl至吸附柱中，13000g常温离心lmin，弃收集液。6) 重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)7) 加入500(ilPE緩冲液于吸附柱中，13000g常温离心lmin,弃收集液。8) 重复7操作2次。9) 将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。10) 将吸附柱取出，转移至新的1.5mlEP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。11) 加入100pl预热(70°C) TE緩冲液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常温;故置5 min。12) 13000g常温离心l min,取收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温放置l min。13) 13000g常温离心2min,取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-2(TC保存 备用。利用核酸定量仪对所提取的龟曱胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及 纯度。浓度为20.8ng OD雄/OD28o为1.45。由此可见，从lg龟曱胶样品中成功提取 得到DNA。用传统方法提取的龟肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增陆龟超科动物特 异性SINE序列pol III/SINE的引物，以本方法提取的龟曱胶DNA为模板，通过PCR扩增 鉴定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图4 。由图4，从龟曱胶中提取的DNA,利用扩增陆龟超科动物特异性DNA序列polIII /SINE的引物进行PCR扩增，所得扩增片段与对照龟肉基因组的扩增片段大小完全一 致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到龟曱胶中的DNA,包括其中因深度加工 而含量极少、片段极短的龟源性成分DNA,并且能完全满足后续PCR检测的要求。实施例5 提取鹿角胶中所含有的DNA并对其进行PCR检测以市售鹿角胶(山东东阿阿胶股份有限公司生产)为原料，采用下述方法提取其 中的DNA。1) 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2) 取1 g粉碎胶样，加入1 ml的消化緩冲液，在60ml离心管中，封口 50-60°C水浴 中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。3) 待冷却至室温后加入50pl 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。C保温lh，其间不 时轻微摇匀。4) 加入10mlPN緩冲液，混和均匀。5) 取混和液700^d至吸附柱中，13000g常温离心lmin，弃收集液。6) 重复操作5上柱、离心操作，直至混和液全部过柱。(舍弃不溶固体残留)7) 加入500nlPE緩沖液于吸附柱中，13000g常温离心l min,弃收集液。8) 重复7操作2次。9) 将空吸附柱重新置于收集管中，13000g常温离心2min。10) 将吸附柱取出，转移至新的1.5mlEP管中，打开吸附柱盖，常温放置5min干燥。11) 加入100nl预热(70°C) TE緩冲液(pH8.0)于吸附柱柱膜中央，常温放置5 min。12) 13000g常温离心l min,耳又收集液，再次加于吸附柱柱膜中央，常温;故置l min。13) 13000g常温离心2min,取收集液分装，即为提取得到的DNA液，-20匸保存备用。利用核酸定量仪对所提取的鹿角胶DNA进行核酸定量，分别确定其核酸浓度以及 纯度。浓度为16.2ng/nl， OD26o/OD28o为1.28。由此可见，从lg鹿角胶样品中成功提取 得到DNA。方法以及试剂和实施例2中检测黄明胶时所用条件都是一致的，因为鹿也是属于 反刍动物亚目的，因此也可以利用该反刍亚目SINE序列来检测其中的鹿源性成分。 即，用传统方法提取的牛肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增反刍亚目动物特 异性SINE序列Bov-A2的引物，以本方法提取的鹿角胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴 定本方法所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图5 。由图5,从鹿角胶中提取的DNA，在利用扩增反刍亚目动物特异性SINE序列 Bov-A2的引物进行PCR扩增以后，得到的扩增片段与对照牛肉基因组的扩增片段大小 完全一致。可见，利用本方法确实能够正确提取得到鹿角胶中的DNA,包括其中因深 度加工而含量极少、片段极短的鹿源性成分DNA并且能完全满足后续PCR检测的要 求。对比实施例利用酚/氯仿、乙醇沉淀法提取阿胶DNA及PCR检测此方法所用试剂 乙酸钠溶液3MPH5.2消化緩冲液50mMTris-HCl, 50mM EDTA， 0.5% SDS， PH 8.01. 将待检测的固体胶样锤击粉碎成颗粒状。2. 取lg粉碎胶样，加入20-25 ml的消化緩冲液，在60ml离心管中，封口 50-60。C 水浴中保温若干分钟，其间不时轻微搅拌混匀，直到颗粒状物质全部溶解。3. 待冷却至室温后加入100-150(il 20mg/ml蛋白酶K溶液，混匀，56。C保温lh， 其间不时轻微摇匀。4. 于离心管中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25/24/l体积比)PH 8.0抽提液，漩 涡振荡器上强烈振荡10s,使2相充分混合形成乳浊液。室温下5000g离心 10-15min。静置分层，收集水相于另一60ml离心管中。5. 重复4操作2次。6. 加入0.1倍体积的乙酸钠溶液以及2倍体积的冰冷乙醇，充分混匀，于-2(TC冰 箱中放置过夜。7. 取出离心管，于0。C, 10000rpm离心30min，用移液管小心吸出上清液8. 加入lml的70。/o冰乙醇，轻轻旋转离心管，洗涤沉淀，4。C下10000rpm离心10min,用移液管小心吸出上清液。9. 重复8操作。10. 将离心管于室温下敞口放置在试验台上，直至残留的液体挥发干。11. 将沉淀下来的DNA充分溶解于100jxl的TE緩冲液中-2(TC保存备用。利用核酸定量仪对利用常规酚/氯仿，乙醇沉淀法提取的阿胶DNA进行核酸定量， 分别确定其核酸浓度以及纯度。浓度为18.6ng/nl， OD雄/OD28o为2。由此可见，从lg 阿胶样品中我们也能够成功提取得到DNA 。用传统方法提取的驴肉组织基因组DNA作为阳性对照，利用扩增马科动物特异性 SINE序列ERE-1的引物，以本方法提取的阿胶DNA为模板，通过PCR扩增鉴定本方法 所提取的DNA是否能满足后续PCR检测的要求。结果见图6，其中，1 3为30个循环的 结果，5 7为40个循环的结果。由图6，利用传统方法从阿胶中提取的DNA,在利用扩增马科动物特异性SINE序 列ERE-1的引物进行PCR扩增以后，无法得到任何扩增条带。可见我们利用常规方法 得到的DNA中并不包含驴源性成分，所得到的DNA很可能来自阿胶制备后期所添加 的辅料包括黄酒、豆油等，而极少量的破坏严重的驴源性DNA利用这种常规方法是无 法得到富集的。可见，利用本方法并没能富集得到阿胶中含量极少、片段极短的驴源 性成分DNA,并不能够满足后续PCR4全测的要求。上述试验结果表明，本发明的DNA提取方法可以有效提取胶类中药中含量极少的 DNA分子，获得的DNA完全能够满足后续的分子生物学检测的需要。在本发明中，为了防止胶类物质中本来就含量极少的DNA分子在提取过程中再次 损失，我们尽量减少萃取操作步骤，并且选择了硅材料吸附法进行DNA的富集。同样 的，为了能够顺利富集胶类物质中存在的短片段DNA分子，我们所用的高离子型吸附 緩冲液也是精心选择的。又例如，在提取过程初始阶段，我们增加了蛋白酶消化的预 处理步骤，使得样品通过预处理之后， 一方面DNA分子能够完全释放到緩冲液中，另 一方面，样品中包含的大量蛋白也能够被初步消化分解。再例如，为了排除动物胶类 物质中可能存在的大量脂质对整个DNA提取过程的干扰，我们在提取过程中还添加除 油脂试剂，通过萃取以消除这些物质的影响。综上所述，为了克服了胶类物质中蛋白含量极高，DNA含量极少，片段极短的困 难，顺利制备得到胶类物质中的DNA,建立了 一种在现有的各种DNA提取方法基础 上进行改进的、新的适合于深度加工的胶类物质DNA提取的技术，并且所提取得到的 DNA能够满足后续的分子生物学检测的需要。因此，本发明的从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法快速、简便、可靠、 效率高，特别适合因深度加工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药，获得的 DNA能够用于后续常规分子生物学操作，为利用DNA生物学鉴定技术实现胶类中药 的鉴别提供基础。需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每 一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例 及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对 本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发 明的范围内。
权利要求
1.一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，其特征在于，包括下列步骤a)用消化液对所述深度加工型中药或中药材进行预处理，使所述深度加工型中药或中药材中的大量胶原蛋白降解，少量DNA则被完全释放溶解于所述消化液中，获得预处理液；b)采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述预处理液中的DNA。
2. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于，所述预处理包括粉碎所述深度加工型中 药或中药材成颗粒，加入所述消化液，所述消化液弱碱性且含有SDS,搅拌加热 溶解所述颗粒，加入蛋白酶进行消化，所述抽提方法是硅材料吸附法。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述消化液是Tris.EDTA溶液，pH为6-9， 所述硅材料吸附法中采用了针对短片段核酸吸附的高离子型溶液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述消化液的pH为8.0,含有10mmol/L Tris-HCl、 25mmol/L EDTA、 100mmol/L NaCl和0.50/。 SDS,所述高离子型溶液是 PN緩冲液，所述蛋白酶是蛋白酶K。
5. 根据权利要求l所述的方法，其特征在于，在所述步骤a)和所述步骤b)之间，还 包括步骤加入除油脂试剂进行萃取，除去所述处理液中含有的大量油脂。
6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述除油脂试剂是正己烷。
7. 根据权利要求l所述的方法在提取所述深度加工型中药或中药材的DNA中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述深度加工型中药或中药材是因深度 加工而导致DNA含量极少，片段极短的中草药或中草药材。
9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述深度加工型中药或中药材是由动物 皮、骨熬炼、精制而成的胶类中药或中药材。
全文摘要
本发明提供了一种从深度加工型中药或中药材中提取DNA的方法，包括步骤a)用消化液对所述深度加工型中药或中药材进行预处理，利用0.5％SDS及蛋白酶K消化，使所述深度加工型中药或中药材中的大量胶原蛋白降解，少量DNA则被完全释放溶解于所述消化液中，获得预处理液；b)采用针对短片段DNA的抽提方法提取所述预处理液中的DNA，该方法快速、简便、可靠、效率高，特别适合因深度加工而导致核酸含量极少、片段极短的胶类中药，获得的DNA能够用于后续常规分子生物学操作，为利用DNA生物学鉴定技术实现胶类中药的鉴别提供基础。
文档编号C12Q1/68GK101270357SQ20081003444
公开日2008年9月24日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日
发明者品 吕, 周祥山, 尤金花, 张元兴, 杨继忠, 田守生, 秦玉峰 申请人:华东理工大学;山东东阿阿胶股份有限公司