专利名称：一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌及其构建方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌 及其构建方法。
背景技术：
N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)是神经氨酸苷酶抑制剂的前体，该抑制剂在临床上用于 治疗病毒性流感，在医药领域中具有重要的应用价值。
获得Neu5Ac的方法虽然有多种，但由于生物转化法制备Neu5Ac具有工艺简单，纯 化方便、污染少等优点，因此现在主要采用该方法制备。生物转化法生成Neu5Ac的过程 分为一步酶法和两步酶法两种。其中一步酶法，即利用N-乙酰神经氨酸裂合酶催化N-乙 酰甘露糖胺(ManNAc)和丙酮酸(pyruvate)直接生成Neu5Ac。该法步骤简单，转化效 率及产率都比较理想，但ManNAc的昂贵的价格限制了这种方法的应用。两步酶法，即 用N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶先将N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)转化生成ManNAc， 再由N-乙酰神经氨酸裂合酶催化生成Neu5Ac，该过程详见图1。
1985年，Ohta等人公布了编码大肠杆菌K12 (Eyc/zm'c/z/a co//K12) N-乙酰神经氨酸 裂合酶基因"a/)序列，并于1986年成功克隆了该基因。随后，Maru等人于1996年成 功地从猪肾中克隆了 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因(age)。目前已有分别利用N-乙 酰神经氨酸裂合酶基因w /和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因age构建的单独的表达质 粒，但是由于两步酶法的生产过程相对复杂，因此有必要进一步加以改进。
发明内容
本发明的首要目的就在于对两步酶法生产N-乙酰祌经氨酸(Neu5Ac)的工艺进行改 进，从而提供一种N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的双基因共表 达质粒。
本发明的第二个目的在于提供一种所述双基因共表达质粒的构建方法。 本发明的第三个目的在于提供一种利用所述双基因共表达质粒转化的基因工程菌。 本发明的第四个目的在于提供一种所述工程菌的构建方法。 本发明的第五个目的在于提供一种利用所述工程菌生产Neu5Ac的方法。本发明的双基因共表达质粒同时含有N-乙酰神经氨酸裂合酶基因w"/和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因"ge。
本发明分别利用质粒pLY-3、 pET-29a-nal和pQE30-nal扩增得到N-乙酰神经氨酸裂 合酶基因表达元件，然后在连接酶的作用下分别连接于含有N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异 构酶基因"ge表达元件的质粒pLY-AGE 、 pET-29a-age和pQE30-age，构建获得双基因共 表达质粒。
将所述双基因共表达质粒转化大肠杆菌，获得可同时表达N-乙酰神经氨酸裂合酶和 N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的基因工程菌。
将所述工程菌在适当的条件下进行发酵，收集菌体破碎离心，获得的上清粗酶液可以 将底物GlcNAc转化为Neu5Ac。
利用本发明的双基因共表达质粒构建的基因工程菌，能够同时表达N-乙酰神经氨酸 裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶，从而可以实现在一次反应过程中，将GlcNAc 催化生成Neu5Ac，大大简化了生产工艺过程，提高了生产效率和Neu5Ac的产率。
图1是两步酶法制备Neu5Ac流程示意图。 图2是双基因共表达质粒pLY-NA结构示意图。 图3是双基因共表达质粒pLY-9结构示意图。 图4是双基因共表达质粒pLY-10结构示意图。
图5是构建重组质粒pLY-NA流程图，其中，5A为pLY-NAL亚克隆的制备流程图， 5B为重组质粒pLY-NA的构建流程图。 .
图6是构建重组质粒pLY-9流程图，其中，6A为pLY-NAL-l亚克隆的制备流程图， 6B为重组质粒pLY-9的构建流程图。
图7是构建重组质粒pLY-10流程图，其中，7A为pLY-NAL-2亚克隆的制备流程图， 7B为重组质粒pLY-10的构建流程图。
图8是N-乙酰神经氨酸裂合酶基因"W的表达元件PCR扩增的电泳结果。
图9是pLY-NA质粒的酶切后电泳验证图片，其中，电泳条带1为pLY-NA质粒的 Sphl酶切结果，电泳条带2为对照(pLY-AGE)。
图10是Eco//BL21 (DE3) (pLY-NA)菌破碎上清粗酶液电泳结果，其中电泳条带 l为蛋白分子量标准，电泳条带2为粗酶上清，其中42Kda的是N-乙酰一D —葡萄糖胺2 一异构酶，33Kda的是N—乙酰神经氨酸裂合酶。图11是Neu5Ac标准品线性分析标准曲线。 图12是标准品Neu5Ac质谱检测图。 图13是标准品GlcNAc质谱检测图。
图14是由基因工程菌五.co/z' BL21(DE3)(pLY-NA)制备的粗酶12h转化液质谱检测图。
图15是由基因工程菌BL21(DE3)(pLY-NA)制备的粗酶12h转化液HPLC检测 图，其中15A为标准品HPLC结果，15B为粗酶12h转化液的检测结果。
图16是由基因工程菌BL21 (DE3) (pLY-10)制备的粗酶12h转化液HPLC 检测图，其中16A为标准品HPLC结果，16B为粗酶12h转化液的检测结果。
图17是由基因工程菌Eco/Z DHa (pLY-9)制备的粗酶12h转化液HPLC检测图， 其中17A为标准品HPLC结果，17B为粗酶12h转化液的检测结果。
具体实施例方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发 明而非用于限定本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验 室手册》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件进行。
本发明的实施例中使用了以下菌株与质粒
大肠杆菌(￡.co//BL21 (DE3)): NOVAGEN公司。 大肠杆菌(￡. co//DH5a): TIANGEN公司。
质粒pMD18-T Simple Vector: TAKARA公司，具有氨苄青霉素抗性(ampR)禾口 p-半乳糖苷酶(LacZ)操纵基因；
pET30a:表达质粒，具有T7启动子，卡那霉素抗性基因，NOVAGEN公司。 pET29a:表达质粒，具有T7启动子，卡那霉素抗性基因，NOVAGEN公司。 pQE30:表达质粒，具有T5启动子，氨苄青霉素抗性基因，Qiagen公司。 质粒pLY-AGE 、 pET-29a-age和pQE30-age:参照Lee, Y.-C.等的文献(Production of N陽acetyl陽d-neuraminic acid by recombinant whole cells expressing Anabaena sp. CHI N-acetyl-d-glucosamine 2-epimerase and Escherichia coli N-acetyl-D-neuraminic acid lyase, J, Biotechnol. 2007， 129: 453460)中描述的方法构建，分别由不同的表达质粒pET 30a、 pET29a禾Q pQE30构建而成，pLY-AGE 、 pET-29a-age都具有卡那霉素抗性(kanR)和age 基因表达元件，pQE30-age具有氨苄青霉素抗性(ampR)和age基因表达元件。质粒pLY-3、 pET-29a-nal和pQE30-nal:参照Mahmoudia M., Noble D.的文献(An effcient process for N-acetylneura- minic acid using N-acetylneuraminic acid [J]， Enz.Micro.Tech., 1997, 20: 399 400)中描述的方法构建，分别由不同的表达质粒pET30a、 pET29a和pQE30构建而成，pLY-3和pET-29a-nal都具有卡那霉素抗性(kanR)和加/基 因表达元件，pQE30-nal具有氨苄青霉素抗性(ampR)和"a/基因表达元件。
pLY-NAL:由从pLY-3经PCR扩增得到的"a/基因表达元件与pMD18-T Simple Vector 连接构建的亚克隆。
pLY-NAL-l:由从pQE30-nal经PCR扩增得到的朋/基因表达元件与pMD18-T Simple Vector连接构建的亚克隆。
pLY-NAL-2:由从pET-29a-nal经PCR扩增得到的朋/基因表达元件与pMD18-T Simple Vector连接构建的亚克隆。
pLY-NA:将亚克隆pLY-NAL酶切得到wa/基因表达元件，然后连接到pLY-AGE质粒， 构建成的朋/和age基因的共表达质粒，质粒图谱如图2所示，该表达质粒的宿主菌为 Eco/亂21 (DE3)。
pLY-9:将亚克隆pLY-NAL-l酶切得到基因表达元件，然后连接到pQE30-age质 粒，构建成的""/和age基因的共表达质粒，质粒图谱如图3所示，该表达质粒的宿主菌 为_￡.co// DHa。
pLY-10;将亚克隆pLY-NAL-2酶切得到"a/基因表达元件，然后连接到pET-29a-age 质粒，构建成的wa/和age基因的共表达质粒，质粒图谱如图4所示，该表达质粒的宿主 菌为五.co/ZBL21 (DE3)。
三种双基因共表达质粒(pLY-NA、 pLY-9和pLY-10)的构建过程基本相同，将其转 入相应的表达宿主大肠埃希氏菌后，都能够进行表达并且具有转化生成Neu5Ac活性。其 构建过程如下
利用己构建的分别表达"a/和"取基因的质粒，例pLY-3和pLY-AGE,其分别含有 "fl/和a取基因表达元件，利用PCR的方法将朋/基因表达元件从前者中扩增得到，构建 亚克隆后，再将""/基因表达元件由适当的限制性内切酶位点连接到后者，最终得到双酶 共表达质粒，具体的构建流程见图5-7。
实施例1、双基因共表达质粒pLY-NA的构建
双基因共表达质粒pLY-NA的构建方法如图3所示，具体过程如下: 1.1、 pLY-NAL亚克隆的制备l丄l、引物设计
根据质粒pLY-3的序列设计以下PCR引物P5: GCATGCATCCGGATATAGTTCCTCCP6: GAGCACCGCCGCCGCAAG
在引物P5中引入了限制性内切酶SphI的酶切位点(下划线所示)；同时，因为质粒
pLY-3中含有一个Sphl的酶切位点，且位置合适，申请人利用了该内切酶位点，因而没有在P6中引入限制性内切酶Sphl的酶切位点，却依然使得最终扩增片段的两端都含有Sphl的酶切位点。l丄2、 PCR扩增
以质粒pLY-3为模板，以P5和P6为引物进行PCR扩增，具体如下反应体系(50^1): 10XExTaq Buffer, 5pl; P5 (20岸)，1^1; P6 (20pM), lpl; pLY陽3，dNTP混合物(各2.5Mm)， 4^1; MgCl2(25 mM)， 4^1; TaKaRaExTaq， 0.5^1; ddH20，33.5|al。
反应条件94。C， 4min; 94°C， lmin， 55°C， lmin， 72°C， 2min，循环29次；72°C，10min。
将PCR扩增获得的扩增产物进行琼脂糖电泳，结果如图8所示，根据该结果，在1.4kb左右处有条带，说明扩增获得了 N-乙酰神经氨酸裂合酶基因朋/的表达元件。
将扩增得到的DNA电泳凝胶于长波长(302nm)紫外灯下，切出含所需DNA片段的凝胶。参考操作手册，使用V—GENE公司的凝胶回收试剂盒回收，并对回收片段进行测序，其序列如SEQIDNO: 2所示。
测序结果显示所获得的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因wa/表达元件包括N-乙酰神经氨酸裂合酶基因"fl/、 T7启动子、T7终止子以及SD序列。
l丄3、 pLY-NAL亚克隆的获得
参考使用手册，将N-乙酰祌经氨酸裂合酶基因朋/表达元件与pMD18-T Simple Vector在T4 DNA连接酶(TaKaRa公司T4 DNA连接酶试剂盒)的催化下，于16'C连接30min。使用热激法将获得的连接产物转化DH5a感受态细胞(TIANGEN公司)，然后在含有IPTG、 X-gal以及100ng/ml氨苄青霉素的LB平板上，于37。C培养16小时，从平板上随机挑取阳性的白色单菌落，提取质粒并进行酶切电泳验证，确定质粒DNA上含有1.4kb的PCR扩增片段，将获得的重组质粒命名为亚克隆pLY-NAL。1.2、质粒pLY-NA构建
1.2.1、 质粒pLY-AGE处理
将含有N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因fl^的质粒pLY-AGE用Sphl酶切后，补充蒸馏水至100Hl，再加入等体积的苯酚氯仿(1: 1)抽提液抽提1 2次，用20pl氯仿抽提1次，然后向水相溶液中分别加入其1/10体积的3mol/L乙酸钠和0.6倍体积的异丙醇沉淀酶切后DNA片段；收集沉淀，用lm70X乙醇洗涤沉淀1次，吸干残余液体，使沉淀干燥，获得纯化的pLY-AGE酶切片段，再用25^1的TE缓冲液将获得的纯化的pLY-AGE酶切片段沉淀重新溶解。
参考使用手册，使用碱性磷酸酶CIAP (购自TaKaRa公司)，将用TE缓冲液溶解的质粒pLY-AGE酶切片段进行去磷酸化处理，再用上述纯化pLY-AGE酶切片段的方法纯化去磷酸化的质粒pLY-AGE酶切片段，并用TE缓冲液溶解。
1.2.2、 pLY-NAL亚克隆的处理
将pLY-NAL亚克隆用Sphl单酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后割胶回收大小约为1.4kb的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因朋/表达元件核苷酸序列。
1.2.3、 质粒pLY-NA制备
将以上1.2.1获得的去磷酸化的pLY-AGE酶切片段和1.2.2获得的N-乙酰神经氨酸裂合酶基因wa/表达元件序列，按摩尔比1:7的比例用T4 DNA连接酶(使用TaKaRa公司T4DNA连接酶试剂盒)于16。C连接30min，获得的连接产物用热激法转化DH5a感受态细胞，然后在含有50吗/ml卡那霉素的LB固体培养基上37'C培养16小时，挑出抗性转化子单菌落，转接到3ml含有50吗/ml卡那霉素的LB液体培养基，于37'C培养过夜。
从培养获得的菌液中抽提质粒，进行酶切验证，结果如图9所示，根据该图结果，酶切产物中有大小约为1.4kb的片断，确定N-乙酰神经氨酸裂合酶基因朋/表达元件序列已连接到pLY-AGE质粒中，获得的重组质粒即为双基因共表达质粒，命名为pLY-NA。
经测序验证，双基因共表达质粒pLY-NA的序列如SEQ IDNO: 1所示，其中，179一1342是N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因age， 1854-2747是N-乙酰神经氨酸裂合酶基因朋/;质粒pLY-NA的结构如图2所示。实施例2、 pLY-NA转化大肠杆菌
将实施例1获得的双基因共表达质粒pLY-NA转化到用CaCl2法制备的大肠杆菌fi.co//BL21 (DE3)感受态细胞，然后在含有50pg/ml卡那霉素的LB固体培养基上37'C培养16小时，挑出抗性转化子单菌落，获得双基因共表达的基因工程菌，命名为Eco/ZBL21(DE3) (pLY-NA)。
实施例3、双基因共表达质粒pLY-10的构建及转化
按实施例1的方法构建双基因共表达质粒pLY-10，并按实施例2的方法将其转化￡co//BL21 (DE3)感受态细胞，获得双酶共表达基因工程菌￡.co//BL21 (DE3) (pLY-10)，其中，制备pLY-NAL-2亚克隆的引物为
P13: GCATGC ATCCGGATATAGTTCCTCCT
P14: AGGTTGAGGCCGTTGAGCAC
其中，在引物P13中引入了限制性内切酶SphI的酶切位点(下划线所示)；同时，因
为质粒pET-29a-nal中含有一个Sphl的酶切位点，且位置合适，申请人利用了该内切酶位点，因而没有在P6和P14中引入限制性内切酶Sphl的酶切位点，却依然使得最终扩增片段的两端都含有Sphl的酶切位点。
实施例4、双基因共表达质粒pLY-9的构建及转化
按实施例1的方法构建双基因共表达质粒pLY-9，并按实施例2的方法将其转化五.co/z'DH5a感受态细胞，获得双酶共表达基因工程菌￡.co// DHa(pLY-9)，其中，制备pLY-NAL-l亚克隆的引物为
P11: AAATAGGCGTATCACGAGGC
P12: CTCGAG GTGGTATATCCAGTGATTTT
其中，在引物P12中引入了限制性内切酶的酶切位点Xho1 (下划线所示)；同时，因
为质粒中pQE30-"a/含有一个的Xhol酶切位点，且位置合适，申请人利用了该内切酶位点，因而没有在Pll中引入限制性内切酶XhoI的酶切位点，却依然使得最终扩增片段的两端都含有的Xhol酶切位点。
实施例5、 ￡.co//BL21 (DE3) (pLY-NA)、 ￡co//BL21 (DE3) (pLY-10)和五.co/,'DHa(pLY-9)的发酵
10将上述实施例中制备获得的双基因共表达的基因工程菌BL21 (DE3)(pLY-NA)、五.co"BL21 (DE3) (pLY-10)禾B五.co" DHa (pLY-9)，分另廿接禾中至lj 3ml LB液体培养基中，于37"C，培养16小时。
取上述培养16小时的菌液，以1.0X的接种量，分别转接到50ml LB液体培养基(5.co/,'DHa (pLY-9)在氨苄青霉素的选择压力培养，￡.co//BL21 (DE3) (pLY-10)和Eco/ZBL21(DE3) (pLY-NA)都在卡那霉素的选择压力下培养)中，37'C培养至对数中期(A550=0.5 1)，然后加入乳糖(终浓度为lmM)，进行诱导。
将诱导培养8小时后的菌液，于4'C， 8000rpm离心5min，收集离心沉淀，获得菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液洗涤菌体三次，每次10ml，再用10mM pH7.4的Tris-HCl裂解缓冲液10ml重悬菌体，并超声破碎细胞，于4'C， 15000rpm将细胞破碎溶液离心15min后，收获离心上清，即得到分别对应三种工程菌￡.co/i BL21 (DE3) (pLY-NA)、 ￡.co//BL21(DE3) (pLY-10)和五.coZ/DHa (pLY-9)的粗酶液I、粗酶液II和粗酶液III。
分别取上清粗酶液进行SDS-PAGE检测，并用凝胶成像系统进行扫描，分析双酶的含量。检测结果显示，所述的两种酶，N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰一D —葡萄糖胺2一异构酶，在粗酶液i、粗酶液n和粗酶液in中都有表达；其中，粗酶液I中，N-乙酰神经氨酸裂合酶占总蛋白的30%， N-乙酰一D —葡萄糖胺2 —异构酶占总蛋白的15%，粗酶液II中，N-乙酰神经氨酸裂合酶占总蛋白的29。/。， N-乙酰一D —葡萄糖胺2 —异构酶占总蛋白的17%，粗酶液III中，N-乙酰神经氨酸裂合酶占总蛋白的27。/。， N-乙酰一D—葡萄糖胺2 —异构酶占总蛋白的18%,粗酶液I的电泳结果如图IO所示。
实施例6、粗酶液转化N-乙酰一D—葡萄糖胺(GlcNAc)
取上述离心后得到的三种粗酶液各300pl，分别配制成三个lml水相反应体系(25mMTris-HCl (pH7.4)， 50mMGIcNAc， 200mM丙酮酸钠，180pMATP， 200pMMgCl2)，于3(TC条件下，120rpm转化12h。
将转化后的溶液于8(TC,热处理5min，以中止反应。
实施例7、产品检测
7.1、 质谱检测
将Neu5Ac标准品、反应底物GlcNAc和粗酶液I的12h转化反应液做质谱检测，检测结果分别如图12 14所示，根据该结果，确定有Neu5Ac生成。
7.2、 HPLC检领lJ称取购自SIGMA公司的Neu5Ac 5mg，用纯水定容到lOrnl，制备为Neu5Ac标量溶液；然后以Neu5Ac标量溶液作为对照，分别将粗酶液I、 II和III的12h转化反应液经HPLC检测(使用Agilent 1100型液相色谱仪检测，检测条件为检测波长220nm;流速lml/min;进样量5pl)，结果如图15-17所示。
同时，还对Neu5Ac标准品进行线性分析，其具体操作如下精密称取标准品，配制浓度(pg/ml)为27、 56、 112、 225、 450、 900。依次进样5pl以峰面积对浓度进行线形回归分析，得到回归方程Y-1.4133X+U879， R2=0.998，结果如图11所示。该结果表明在上述条件下Neu5Ac在27 900 pg/ml范围内峰面积与浓度关系的线性关系良好，因此，可在这个浓度范围内利用峰面积与浓度成正比，从而测定待测溶液中Neu5Ac的含量。根据图15-17的结果并经计算可得，喊液I、粗酶液II和粗酶液III产物Neu5Ac的最终生成量分别为1.3 mg/ml、 1.5mg/ml和1.7 mg/ml;质量转化率为11.8%、 13.6 %和15.4% (质量转化率的计算方法如下所示)。
转旦站转一 Neu5Ac转化后的质量 、/inn。,质虽转化率一 GlcNAc转化前的质量X 100%
上述结果显示，￡.co/i BL21(DE3) (pLY-NA)、 ￡.co//BL21 (DE3) (pLY-10)和￡.co//DHa (pLY-9)可以用于制备含有所述双酶(N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶)的粗酶液，并且证明了上述粗酶液具有转化底物GkNAc生成Neu5Ac的能力。
综上所述，本发明提供的质粒pLY-NA，可转化大肠杆菌，获得工程菌；获得的工程菌经发酵培养后，获得的菌体中含有所需的两种目的酶(N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶)，所述的两种目的酶存在于菌体破碎离心后上清中，获得的离心上清该粗酶液具有转化底物GlcNAc生成Neu5Ac的能力。
因此，本发明提供的质粒pLY-NA、 pLY-9和pLY-10，及其转化大肠杆菌获得的工程菌，均可用于制备Neu5Ac。使用本发明提供的方法制备Neu5Ac，可将通常两步酶法制备Neu5Ac时所需的两菌两次发酵的方法简化为单菌(￡.co//BL21(DE3) (pLY-NA)、五.co"BL21 (DE3) (pLY-10)或Eco/z'DHa (pLY-9))的一次发酵，便可实现制备两种生物催化剂的目的，简化了产酶菌的发酵工艺。同时，所述双基因共表达质粒含有N-乙酰神经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶的基因，转化工程菌后，可表达所述的两种酶，从而可通过一次的反应过程，将GlcNAc催化生成Neu5Ac，大大简化了生产工艺过程，提高了生产效率和Neu5Ac的产率。
12序列表
〈110〉上海来益生物药物研究开发中心有限公司〈120〉 P5071052
〈130〉 一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌及其构建方法〈160〉 4
〈170〉 Patentln version 3.1
<210>〈211〉〈212〉〈213〉
1
7822DNA
质粒pLY-NA
〈400〉 1
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt l加
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttac 180
tcaaggcctc gaattgttgc caacacagat acaaagcacg gggtacatga朋acatccct 240
tccatttacc gcctttgaga tttaacagca cttccccacg gcgatttaag tagccaaacc 300
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atggcatgst agcgcccgga agagagtcaB ttcagggtgg tgaatgtgaa accagtaacg 3240
ttatacgatg tcgcagagta tgccggtgtc tcttatcaga ccgtttcccg cgtggtgaac 3300
caggccagcc acgtttctgc g8犯acgcgg gaaaaagtgg aagcggcgat ggcggagctg 3360
aattacattc ccaaccgcgt ggcacaacaa ctggcgggca aacagtcgtt gctgattggc 3420
gttgccacct ccagtctggc cctgcacgcg ccgtcgcaaa ttgtcgcggc gattaaatct 3480cgcgccgatc aactgggtgc cagcgtggtg gtgtcgatgg tagaacgaag cggcgtcgaa 3540
gcctgtaaag cggcggtgca caatcttctc gcgcaacgcg tcagtgggct gatcattaac 3600
tatccgctgg atgaccagga tgccattgct gtggaagctg cctgcactaa tgttccggcg 3660
ttatttcttg atgtctctga ccagacaccc atcaacagta ttattttctc ccatgaagac 3720
ggtacgcgac tgggcgtgga gcatctggtc gcattgggtc accagcaaat cgcgctgtta 3780
gcgggcccat taagttctgt ctcggcgcgt ctgcgtctgg ctggctggca taaatatctc 3840
actcgcaatc aaattcagcc gatagcggaa cgggaaggcg actggagtgc catgtccggt 3900
tttcaacaaa ccatgcaaat gctgaatgag ggcatcgttc ccactgcgat gctggttgcc 3%0
aacgatc卿tggcgctggg cgcaatgcgc gccattaccg agtccgggct gcgcgttggt 4020
gcggacatct cggtagtggg atacgacgat accgaagaca gctcatgtta tatcccgccg 4080
ttaaccacca tcaaacagga ttttcgcctg ctggggcaaa ccagcgtgga ccgcttgctg 4140
caactctctc agggccaggc ggtgaagggc aatcagctgt tgcccgtctc actggtgaaa 4200
agaaaaacca ccctggcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca 4260
ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg ggcagtgagc gcaacgcaat 4320
taatgtaagt tagctcactc attaggcacc gggatctcga ccgatgccct tgagagcctt 4380
caacccagtc agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac 4440
tgtcttcttt atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg 4500
cgaggaccgc tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat 4560
cttgcacgcc ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa 4620
gcaggccatt atcgccggca tggcggcccc acgggtgcgc atgatcgtgc tcctgtcgtt 4680
gaggacccgg ctaggctggc ggggttgcct tactggttag cagaatgaat caccgatacg 4740
cgagcgaacg tgaagcgact gctgctgcaa aacgtctgcg acctgagcaa caacatgaat 4800
ggtcttcggt ttccgtgttt cgtaaagtct ggaaacgcgg aagtcagcgc cctgcaccat 4860<formula>formula see original document page 17</formula>cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 6240
cttgatccgg ca犯caaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 6300
ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 6360
ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gaacaataaa actgtctgct 6420
tacataaaca gtaatacaag gggtgttatg agccatattc aacgggaaac gtcttgctct 6480
aggccgcgat taaattccaa catggatgct gatttatatg ggtata犯tg ggctxgcgat 6540
aatgtcgggc犯tcaggtgc gacaatctat cgattgtatg ggaagcccga tgcgccagag 6600
ttgtttctga aacatggcaa aggtagcgtt gccaatgatg ttacag已tga gatggtcaga 6660
ctaaactggc tg3Cgg犯tt tatgcctctt ccgaccatca agcattttat ccgtactcct 6720
gatgatgcat ggttactcac cactgcgaix cccgggaaaa cagcattcca ggtattagaa 6780
gaatatcctg attcaggtga aaatattgtt gatgcgctgg cagtgttcct gcgccggttg 6840
cattcgattc ctgtttgtaa ttgtcctttt犯cagcgatc gcgtatttcg tctcgctcag 6900
gcgcaatcac gaatgaataa cggtttggtt gatgcgagtg attttgatga cgagcgtaat 6960
ggctggcctg ttgaacaagt ctggaaagaa atgcataaac ttttgccatt ctcaccggat 7020
tcagtcgtca ctcatggtga tttctcactt gataacctta tttttgacga ggggaaatta 7080
ataggttgta ttgatgttgg acgagtcgga atcgcagacc gataccagga tcttgccatc 7140
ctatggaact gcctcggtga gttttctcct tcattacaga aacggctttt tcaaaaatat 7200
ggtattgata atcctgatat gaataaattg cagtttcatt tgatgctcga tgagtttttc 7260
taagaattaa ttcatgagcg gatacatatt tgastgtatt tagaaaeiata aacsaatagg 7320
ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc acctgaaatt gta肪cgtta atattttgtt 7380
aaaattcgcg ttawttttt gttaaatcag ctcatttttt aaccMtagg ccgaaatcgg 7440
caaaatccct tataaatcaa aagaatagac cgagataggg ttgagtgttg ttccagt"ttg 7500
gaacaagagt ccactattaa agaacgtgga ctcc犯cgtx aaagggcgaa aaaccgtcta 7560
18<formula>formula see original document page 19</formula>tggctttcgg cggtgctgac gcaaccgacg tgggcgatga gtttaatctt acctttcgcc 900
tcttcggcga cgatttccag tacctgttca cgctcggaaa ggctttgtac aaaggcctcg 960
ccggtcgaac cacccacgta taaaccgtcg atgccctgct gaatattgaa ctgaaccagg 1020
cgacgcagac tcgctttatc cagtgcttgt tgttggtcaa aaggagtcag gagtgcagcc 1080
attacgccac gtaaattcgt tgccatatgt atatctcctt cttaaagtta aacsaaatta 1140
tttctagagg ggaattgtta tccgctcaca attcccctat agtgagtcgt attaatttcg 1200
cgggatcgag atcgatctcg atcctctacg ccggacgcat cgtggccggc atcaccggcg 1260
ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac cgatggggaa gatcgggctc 1320
gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat ggtggcaggc cccgtggccg 1380
ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct tgcggcggcg gtgctc 1436
〈210〉 3 <211〉 5824 〈212〉 腿 <213〉 质粒pLY-9
〈400〉 3
ctcgaga犯t cataa犯犯t ttatttgctt tgtgagcgga t犯caattat aatagattca 60
attgtgagcg gataacaatt "tceic￡LcageL￡L ttcattaaag aggagaaa"tt aactatgaga 120
ggatcgcatc accatcacca tcacggatcc atggcaacga atttacgtgg cgtaatggct 180
gcactcctga ctccttttga ccaacaacaa gcactggata aagcgagtct gcgtcgcctg 240
gttcagttca atattcagca gggcatcgac ggtttatacg tgggtggttc gaccggcgag 300
gcctttgtac犯agcctttc cgagcgtgaa caggtactgg aaatcgtcgc cgaagaggcg 360
aaaggtaaga ttaaactcat cgcccacgtc ggttgcgtca gcaccgccga aagccaacaa 420
cttgcggcat cggctaaacg ttatggcttc gatgccgtct ccgccgtcac gccgttctac 480
tatcctttca gctttgaaga acactgcgat cactatcggg caattattga ttcggcggat 540ggtttgccga tggtggtgta caacattcca gccctgagtg gggtaaaact gaccctggat 600
cagatcaaca cacttgttac attgcctggc gtaggtgcgc tgaaacagac ctctggcgat 660
ctctatcaga tggagcagat ccgtcgtgaa catcctgatc ttgtgctcta taacggttac 720
gacgaaatct tcgcctctgg tctgctggcg ggcgctgatg gtggtatcgg cagtacctac 780
aacatcatgg gctggcgcta tcaggggatc gttaaggcgc tgaaagaagg cgatatccag 840
accgcgcaga aactgca犯c tgaatgcaat a犯gtcattg atttactgat ca犯acgggc 900
gtattccgcg gcctgaaaac tgtcctccat tatatggatg tcgtttctgt gccgctgtgc 960
cgcaaaccgt ttggaccggt agatgaaaaa tatctgccag aactgaaggc gctggcccag 1020
cagttgatgc犯gagcgcgg gtga犯gctt aattagctga gcttggactc ctgttgatag 1080
atccagtaat gacctcagaa ctccatctgg atttgttcag aacgctcggt tgccgccggg 1140
cgttttttat tggtgagaat ccaagctagc ttggcgagat tttcaggagc taaggaagct 1200
aaaatggaga aaaaaatcac tggatatacc acctcgaga已atcataaaaa atttatttgc 1260
tttgtgagcg gataacaatt ataatagatt caattgtgag cggata已caa tttcacacag 1320
aattcattaa agaggagaaa ttaactatga gaggatcgca tcaccstcac catcacggat 1380
ccatggggaa aaacttacaa gcactggcgc aactttacaa aaatgccctc ctcaacgacg 1440
tactcccgtt ttgggaaBac cactccctgg atacggaagg cggttatttt acctgtcttg 1500
atcgccaggg taaggtgtat gacacagata aatttatttg gctgcaa犯c cgccaagtct 1560
ggactttttc catgctgtgt aaccagctag aaaaacggga aaactggctc aaaattgcta 1620
gtaacggtgc taaatttctt gccc犯catg gcagagacgc agagggaaac tggtattttg 1680
ccctcacccg tggaggtgaa ccattagtac agccttacaa tattttttct gattgttttg 1740
cagcgatggc ctttagccaa tatgctctcg cctxtggtga agagtgggca aaagatgtgg 1800
ctatgcaagc atataacaat gttttgcgtc gcaaagataa tcccaaaggc aaatatacca 1860
aaacctatcc cggcacacgc cccatgaaag ccttagctgt gccaatgatt ttagctaacc 1920
21<formula>formula see original document page 22</formula>cgcaaggcga caaggtgctg atgccgctgg cgattcaggt tcatcatgcc gtUgtgatg 3300
gcttccatgt cggcag犯tg cttaatgaat tacaacagta ctgcgatgag tggcagggcg 3360
gggcgtaatt tttttaaggc agttattggt gcccttaaac gcctggggta atgactctct 3420
agcttgaggc atcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc 3480
tgttgtttgt cggtgaacgc tctcctgagt aggacaaatc cgccctctag agctgcctcg 3540
cgcgtttcgg tgatgacggt gaa犯cctct gacacatgca gctcccggag acggtcacag 3600
cttgtctgta agcggatgcc gggagc卿c aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg 3660
gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtagcga tagcggagtg tatactggct 3720
taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc 3780
gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga 3840
ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3900
acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3960
aaaggccagg aaccgta犯a aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 4020
tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cga犯cccga caggactata 4080
aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 4140
gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 4200
acgctgtagg tatxtcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc犯gctgggct gtgtgcacga 4260
accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 4320
ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 4380
gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4440
gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4500
ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4560
gattacgcgc ag犯犯aaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4620cgctcagtgg犯cgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4680
cttcacctag atcctttteL6L attaaaaatg aagttttaaa tcaatctELaa gtatatatga 4740
gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg 4800
tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga 4860
gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc 4920
agatttatca gcaataaacc sgccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac 4980
tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc 5040
agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtx 5100
gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc 5160
catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt 5220
ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc 5280
atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg 5340
tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg gataataccg cgccacatag 5400
cagaacttta aaagtgctca tcattggstaa acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat 5460
cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt gcacccaact gatcttcagc 5520
atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcsaaaaca gg犯ggcaaa atgccgcaaa 5580 aaaggg犯ta agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt ttca^tatts
ttgaagcatt tatcagggtt eittgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttagaa 5700
aaataaac犯ataggggttc cgcgcacstt tccccgaaaa gtgccacctg acgtctaaga 5760
aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc cctttcgtct 5820
<210> 4 〈211〉 7797〈212〉 腿
〈213〉 质粒pLY-10
〈400〉 4
atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60
ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa cixagcttcc tttcgggctt 120
tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gc卿ctttt 180
aactcaaggc ctcgaattgt tgccaacaca gatacaaagc acggggtaca tgaaaacatc 240
ccttccattt accgcctttg agatttaaca gcacttcccc acggcgattt aagtagccaa 300
accactcacc atattctggg tcagcaaaat gctgccaaga ataatcgtgc attttttgat 360
accattccca acagacttca cgacctgtca aacgataacc catcgccaaa gccaccaaag 420
attctaaatg cacccaccac aatttttgat cccattccaa ttgttgtggg ggatgacctg 480
ctgcatccat犯agtaatac aagccgccat actctttatc ccaggcgaaa ttgaggatat 540
ttaacaccac atcaactgct tggttaatag tcttgctgtc gtttttccgt cgggcgatgt 600
ccataataaa ccacatcgcc tcaataccgt gaccagggtt犯tcagccgc ccttcaa犯c 660
aatcaatgtg ggaaccatcg ggggcaacat tttcatacat c犯tcctcgt tctttgtcga 720
gaaagtcact cataacttcc tgaacggttg cactcaagac attttctaga gtctcctggg 780
gaagcaacca ttccatttct aaggtcaggt tagctaaaat cattggcaca gctaaggctt 840
tcatggggcg tgtgccggga taggttttgg tatatttgcc tttgggatta tctttgcgac 900
gcaaaacatt gttatatgct tgcatagcca catcttttgc ccactcttca ccagaggcga %0
gagcatattg gctaaaggcc atcgctgcaa aacaatcaga aaaaatattg taaggctgta 1020
ctaatggttc acctccacgg gtgagggcaa aataccagtt tccctctgcg tctctgccat 1080
gttgggcaag aaatttagca ccgttactag caattttgag ccagttttcc cgtttttcta 1140
gctggttaca cagcatggaa aaagtccaga cttggcggtt ttgcagccaa ataaatttat 1200
ctgtgtcata caccttaccc tggcgatcaa gacaggtaaa ataaccgcct tccgtatcca 1260
25<formula>formula see original document page 26</formula>tcgaaccacc gcagactcgc cgccacgtaa t卿ggggaa 3tcgagatcg 鄉tgcggtt cttcgggctc
3CtgttgggC
caacctacta cgg3caccat gtc犯ttcag gtgtctctta cgcggg犯aa
￡l￡LC￡L￡LCtggC
acgcgccgtc tggtggtgtc ttctcgcgca ttgctgtgga caccc3tcaa tggtcgcatt cgcgtctgcg
Cgg咖ggg3
atgagggcat
cacgt已t犯a tttatccagt attcgttgcc ttgttatccg atctcgatcc gctggcgcct atgagcgctt gccatctcct ctgggctgct cg犯tggcgc ggtggtgaat tcagaccgtt 3gtgga^gcg gggcaaacag gcaaattgtc gatggt卿a acgcgtcagt agctgcctgc cagtattatt
gggtC織3g
tctggctggc aggcgactgg cgttcccact
ccgtcgatgc gcttgttgtt atatgtatat ctcacaattc tctacgccgg atatcgccga gUtcggcgt tgcatgcacc tcctaatgca a犯acctttc
gtg3犯CC3g
tcccgcgtgg gcg3tggcgg tcgttgctga gcggcgatts cgaagcggcg gggctgatca actaatgttc ttctcccatg caaatcgcgc
agtgccstgt gcgstgctgg
cctgctgaat ggtcaa鄉g ctccttctta ccctatagtg acgcatcgtg catcaccgat 鹏城ggtg attccttgcg ggagtcgcat gcggt3tggc
tga^ccaggc
3gCtg朋tt3
ttggcgttgc 犯tctcgcgc tcg犯gcctg ttaactatcc cggcgtt已tt
tgttagcggg atctcactcg ccggttttca ttgccaacga 27
attgaactga agtcaggagt
agtcgtatta gccggcatca gggga卿tc gcaggccccg gcggcggtgc 鄉gg卿gc atgatagcgc
Cg￡ltgtCgC3
cagccacgtt cattcccaac cacctccagt cgatcaactg t3犯gcggcg
gCtgg3tgM
tcttgatgtc gcgactgggc cccattaagt
acaaaccatg tc卿tggcg
accaggcgac gcEigccatta 犯attatttc atttcgcggg ccggcgccac gggctcgcca tggccggggg tcaacggcct gtcgagatcc ccgg3卿ga gagtatgccg tctgcga已aa cgcgtggcac ctggccctgc ggtgccagcg gtgcacaatc caggatgcca tctgaccaga gtggagcatc tctgtctcgg
C3gCCg3t3g
caaettgctga ctgggcgc犯
2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960tgcgcgccat
gcctgctggg agggcaatca cgcaaaccgc cccgactgga gc獄gggat gcgcggggc3 gg総ggtgc acgatgatcg gtcactggtc gccccacggg tgccttactg
tgctgctggc tgagtgattt tccagtaacc atcggtatca
gagaaactca
C6LCgCtgettg
taccgagtcc agacagctcs gcaaaccagc gctgttgccc ctctccccgc
33gCgggC3g
ctcgaccgat tgact已tcgt cggcagcgct gcctgtcgct ccgccscca^ tgcgcatgat gttagcagaa ctgcgacctg cgcgg鄉tc taccctgtgg ttctctggtc gggcatgttc ttacccccat ccgcccttaa acgagctgga agctttaccg
gggctgcgcg tgttatatcc gtggaccgct gtctcactgg gcgttggccg
tg3gCgC33C
gcccttgaga cgccgcactt ctgggtcatt tgcggtattc acgtttcggc cgtgctcctg tgaatcaccg
agcgccctgc aacacct&ca ccgccgcatc atcatcagta gaacagaaat catggcccgc cgcggatg已a cagctgcctc
ttggtgcgga cgccgttaac tgctgcaact tg朋aaga犯
gC38ttaatg gccttcaacc atgactgtct ttcggcg郷 ggaatcttgc g卿已gcsgg txgttgagga at已cgcgagc tg犯tggtct accattatgt tctgtattaa cataccgcca acccgtatcg cccccttaca tttatcagaa c已ggc已gaca gcgcgtttcg
catctcggta cac cat caaa ctctcagggc aaccaccctg gcagctggca taagttagct cagtcagctc tctttatcat accgctttcg acgccctcgc ccattatcgc cccggctagg gaacgtgaag tcggtttccg tccggatctg cgaagcgctg gttgtttacc tgagcatcct cggaggcatc gccagacatt tctgtgaatc gtgatgeicgg
gtgggatacg caggattttc caggcggtga gcgcccaata cgacaggttt cactcattag cttccggtgg gcaactcgta ctggagcgcg tcaagccttc cggcatggcg ctggcggggt cgactgctgc tgtttcgtaa catcgcagga gcattgaccc ctcacaacgt ctctcgtttc agtgaccaaa aacgcttctg gcttcacgac tgaaaacctc
4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga 5340
caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag 5400
tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 5460
tgagagtgca ccatatatgc ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga ga^aataccg 5520
catcaggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg 5580
gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa 5640
cgcaggaaag a^catgtgag caaaaggcca gca犯aggcc aggaaccgta aaaaggccgc 5700
gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa a1xgacgctc 5760
aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 5820
ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 5880
cccttxggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 5940
ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 6000
cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 6060
agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 6120
gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 6180
gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 6240
tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 6300
agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 6360 agggattttg gtcatgaaca ataaaactgt ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg
ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt gctctaggcc gcgattaaat txcaacatgg 6480
atgctgattt atatgggtat aaatgggctc gcgataatgt cgggcaatca ggtgcgacaa 6540
tctatcgatt gtatgggaag cccgatgcgc cagagttgtt tctga犯cat ggcaaaggta 6600
gcgttgccaa tgatgttaca gatgagatgg tcagactaaa ctggctgacg gaatttatgc 6660
29<formula>formula see original document page 30</formula>
权利要求
1、一种双基因共表达质粒，其特征在于，所述质粒包含N-乙酰神经氨酸裂合酶基因、N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因以及一种合适的表达载体。
2、 如权利要求l所述的质粒，其特征在于，所述表达载体选自pET30a 、 pET29a或 pQE30。
3、 如权利要求l所述的质粒，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸裂合酶基因其序列 如SEQ ID NO : 1的1854—2747 、 SEQ ID NO: 3的151陽1044、或SEQ ID NO: 4的1829-2722所示。
4、 如权利要求1所述的质粒，其特征在于，所述N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因 其序列如SEQIDNO: 1的179 — 1342、 SEQ ID NO: 3的1383-2546、或SEQIDNO: 4 的182-1345所示。
5、 如权利要求l一4中任一项所述的质粒，其特征在于，所述质粒序列如SEQ ID NO: 1、 SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示。
6、 如权利要求l一5中任一项所述质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下 步骤A) 设计并合成合适的引物，进行PCR扩增并与合适载体连接，制备包含N-乙酰神 经氨酸裂合酶基因的亚克隆质粒；B) 酶切包含N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因的质粒，获得N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因酶切片段；C) 用与B步骤中同样的酶，酶切A步骤获得的亚克隆质粒，获得质粒酶切片段；D) 连接步骤B和C获得的酶切片段。
7、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述载体选自pET30a 、pET29a或pQE30。
8、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰神经氨酸裂合酶基因其序列 如SEQIDNO: 1的1854—2747、SEQIDNO:3的151掘4、或SEQIDNO:4的1829-2722所示。
9、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因 其序列如SEQ ID NO: 1的179—1342、 SEQ ID NO: 3的1383-2546、或SEQ ID NO: 4 的182-1345所示。
10、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述质粒序列如SEQIDNO: l或SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示。
11、 如权利要求l一5中任一项所述的质粒转化获得的工程菌。
12、 如权利要求ll所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌菌株为大肠杆菌。
13、 如权利要求ll所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌经培养后表达N-乙酰神 经氨酸裂合酶和N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶。
14、 如权利要求11一13所述的工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤A、 将权利要求l一6所述的双基因共表达质粒转化感受态细胞并在选择性培养基上培养；B、 挑选阳性转化子。
15、 如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括将获得的阳性转化子进行扩增 培养的步骤。
16、 一种生产Neu5Ac的方法，其特征在于，将权利要求U — 13所述的工程菌发酵 培养获得的菌体破碎后离心，将离心上清加入GlcNAc反应液，催化生成Neu5Ac。
全文摘要
本发明提供了一种双基因共表达质粒、其转化的工程菌及其构建方法。本发明提供的双基因共表达质粒包含N-乙酰神经氨酸裂合酶基因、N-乙酰-D-葡萄糖胺2-异构酶基因和一种合适的表达载体，将质粒转化大肠杆菌可获得工程菌，将工程菌发酵培养获得的菌体破碎后离心，再将离心上清加入GlcNAc反应液，可催化生成Neu5Ac。本发明提供的质粒及相应工程菌，均可用于制备Neu5Ac。同时，使用本发明提供的方法制备Neu5Ac，可将通常两步酶法制备Neu5Ac时所需的两菌两次发酵的方法简化为单菌一次发酵，便可实现制备两种生物催化剂的目的，简化了产酶菌的发酵工艺和生产工艺过程，提高了生产效率和Neu5Ac的产率。
文档编号C12N15/52GK101525627SQ200810034359
公开日2009年9月9日 申请日期2008年3月7日 优先权日2008年3月7日
发明者兴 夏, 梅 戈, 丽 朱, 潘广文, 王天骄, 王立军, 罗敏玉, 陈代杰, 维 魏 申请人:上海来益生物药物研究开发中心有限责任公司;浙江医药股份有限公司新昌制药厂