专利名称：尿道炎衣原体细胞培养维持液的制作方法
尿道炎衣原体细胞培养维持液 技术领域 本发明涉及一种尿道炎衣原体细胞培养维持液；特别是一种尿道炎 衣原体细胞培养维持液的配方及其制备方法。其主要成分是氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢 钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、氯化钙、水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、2-巯基乙醇、 青霉素、链霉素、庆大霉素、EDTA、0. 5%酚红。沙眼衣原体生殖道感染是最常见性传播性疾 病之一。沙眼衣原体还被认为是盆腔炎及其后遗症——输卵管不孕和异位妊娠的重要病 因。孕妇患沙眼衣原体宫颈炎，胎儿经产道分娩时可感染沙眼衣原体结膜炎和肺炎。衣原 体细胞培养法是检查衣原体最敏感、最可靠的方法。该细胞培养维持液能够培养检测生殖 道衣原体，具有指导临床诊断和治疗的作用，为防止滥用抗菌药物也具有重要意义。常用 McCoy细胞或Hela229单层细胞培养，通过观察细胞病变(肿大，变性，脱落)及细胞内特征 性包涵体可确定诊断。其敏感性约为80% 90%，特异性为100%。并可用于药物敏感试 验，还可检测治疗后病人是否存在活的衣原体，以判定疗效。该方法操作繁锁、费时，设备昂 贵，技术性强，临床不易推广。沙眼衣原体需要在实验室做细胞培养进行分离，因此，多年来 细胞培养一直做为衣原体检测的"金标准"，细胞培养对设备、技术、标本采集和运送等的要 求都非常高，从尿道、宫颈采集的柱状细胞，不宜混有多核细胞及粘液脓性分泌物，不宜含 有过多的杂质。对采集拭子也有要求应是棉拭子而不应是木制拭子，因为木制拭了可能抑 制衣原体生长。宫颈内标本有细胞刷可采集到更从的细胞以提高培养的敏感性。标本必须 放置在特制的转运培基中，冷冻，24小时内包埋到细胞培养盘中。培养时McCoy细胞的状态 也会影响最终结果。当McCoy细胞过度生长、变形、破裂甚至完全失去细胞形态时，则无从 观察细胞中的包涵体。 细胞培养无论在花费上、设备、技术方面都要求非常高，对于细胞培养来讲，花费 和时间是影响衣原体细胞培养作为诊断方法使用和推广的最大障碍。很多研究人员在细胞 培养方法的改进上进了多方面探索。
技术背景 生殖道感染发病率很高，流行范围很广，其病原菌50%为沙眼衣原 体；30%为尿素分解衣原体；20%由其他致病菌感染引起。所有沙眼衣原体均可在细胞培 养中生长，现多采用McCoy或HeLa229细胞株，在接种衣原体前，以X线照射细胞，或于细胞 培养中加入代谢抑制如细胞松弛素B、 DEAE葡聚糖呈放线菌酮，其目的在于细胞生长代谢 缓慢，以利于衣原体的寄生性生长。细胞培养无论在花费上、设备、技术方面都要求非常高， 对于细胞培养来讲，花费和时间是影响衣原体细胞培养作为诊断方法使用和推广的最大障 碍。目前，细胞培养仍是诊断衣原全感染最为可靠的实验方法，习惯上把细胞培养作为"金 标准"。用细胞培养的方法来确定衣原体的感染涉及4个方面的影响因素①尽可能采集含 有较多上皮细胞的样本；②在转运培基中添加抗生素以防止标本中细菌的过度生长；③使 用抗代谢药物抑制组织细胞的复制；④使用碘、Giemsa、免疫荧光染色来鉴定感染细胞中的 衣原体。本发明的目的在于提供一种尿道炎衣原体细胞培养维持液，与其它类试剂相比具 备下列特点尿道炎衣原体细胞培养维持液，营养丰富、配制简单、选择性强和变色灵敏，与 传统试剂比较，检出率高，污染小，临床应用效果满意.检测方法简单、时间短、准确性强。 可防止标本中细菌的过度生长，培养组织细胞的复制得以抑制。
发明内容
本发明的要点在于选择合适的组分，并进行合理混配，经加温、溶
解、混合、冷却、分装、高温灭菌等工艺而成一种尿道炎衣原体细胞培养维持液。 本发明选择的培养基配方如下(克、ml/每升蒸馏水)氯化钠70. 0-90. 0 ;磷酸氢
二钠0. 5-0. 7 ;磷酸二氢钾0. 5-0. 7 ;氯化钾3. 0_5. 0 ;硫酸镁1. 5-3. 0葡萄糖8. 0-12. 0 ;
氯化钙1. 0-2. 0 ;水解乳白蛋白2. 0-3. 0 ;小牛血清10. 0-12. 0ml ;1%谷氨酰胺1. 0_1. 2ml ;
2-巯基乙醇0. 5-0. 6 ;青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml) 10. 0-15. 0ml ;EDTA 0. 1-0. 3 ;
0. 5%酚红3. 0-5. 0ml ;双蒸水加至1000ml ;调pH至7. 2-7. 4。 氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、氯化f丐、是组织细胞的 体液平衡必不可少的物质；水解乳白蛋白、小牛血清、1%谷氨酰胺、是组织细胞的营养平衡 必不可少的物质；青霉素、链霉素、庆大霉素是细胞培养过程中防止污染必不可少的物质； 2-巯基乙醇、EDTA是细胞培养过程中起到组织块的消化以提高细胞的产量。小牛血清使用 前要灭活(56°C，30min)，以消除补体活性。动物血清个体差异大，故而每一批血清都要严格 检测，同时进行无菌试验。优质血清应该为淡黄色，透明，无溶血，无沉淀，灭活后颜色稍深。 生化检测总蛋白含量3. 5 4. 5g/100ml，球蛋白不高于2g/100ml，保证试验条件的稳定。试 验中加入小牛血清后，培养基的pH可能还会变化，故亦可先加入小牛血清后调pH值。培养 液配好后，应先抽取少许放入培养瓶内，于37t:温箱内置24 48hr，以检测培养液是否有 污染。每次配液量以两周左右为宜，一次配液不要太多，防止营养成分(主要为谷氨酰胺) 损失，造成实验繁琐或者污染。
本发明产品的制备方法是 1)、将氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、EDTA按比例进行 加温、溶解； 2)、将氯化钙按比例加热溶解于蒸馏水中，冷至54°C ; 3)、将溶解的1)混合液缓缓加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷却后 调PH7. 2-7. 4，加酚红； 4)、将溶解的1%谷氨酰胺、2_巯基乙醇按比例加入上述混合液中，压力蒸汽灭菌 115。C，20-30min，冷至50°C ; 5)、在无菌条件下加无菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均匀；无菌 分装，冷藏备用。
本发明具有以下优点(l)尿道炎衣原体细胞培养维持液，营养丰富、配制简单； (2)临床应用效果满意，解决了床边接种的困难，污染小；(3)检测方法简单、时间短、选择 性强、变色灵敏、检出率高；(4)可防止标本中细菌的过度生长，培养组织细胞的复制得以 抑制。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明
按照下表所列数据(克、ml/每升蒸馏水)及其所述步骤进行配置
配方一
氯化钠70. 0-90. 0;磷酸氢二钠O. 5-0. 7;磷酸二氢钾0. 5-0. 7;氯化钾3.0-5. 0;硫酸 镁1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0;氯化钙1.0-2.0;水解乳白蛋白2. 0-3. 0;小牛血清10. 0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1.0-1.2 ml; 2—巯基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、链霉素、.庆大霉素(10000U /ml) 10. 0-15. 0 ml; EDTA 0.1-0.3; 0. 5 %酚红3. 0-5. 0 ml;双蒸水加至1000 ml;调pH至 7. 2—7. 4。
配方二
氯化钠70. 0-80. 0;磷酸氢二钠0. 6-0. 7;磷酸二氢钾0. 6-0. 7;氯化钾4.0-5.0;硫酸 镁2. 5-3. 0葡萄糖9.0-12.0;氯化钙1.5-2. 0;水解乳A蛋A 2. 5-3. 0;小牛血清11.0-12. 0 ml; 1%谷氨酰胺1. 1-1. 2 ml; 2—巯基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U /m1)12. 0-丄5. 0 ml; EDTA 0. 2-0. 3; 0. 5 %酚红4. 0-5. 0 ml;双蒸水加至1000 ml;调pH至 7. 2 — 7. 4。
配方三
氯化钠80. 0-90. 0;磷酸氢二钠0. 5-0. 6;磷酸二氢钾0. 5-0. 6;氯化钾3. 0-4. 0;硫酸 镁1.5-2. O葡萄糖8.0-10.0;氯化钙1.0-1.5;水解乳白蛋白2. 0-2. 5;小牛血清IO. 0-11. 0 ml; 1%谷氨酰胺l.O-丄.1 ml; 2—巯基乙醇0. 5-0. 6;青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U /ml) 10. 0-13. 0 m丄;EDTA 0.卜0. 2; 0. 5 %酚红3. 0-4. 0 m丄;双蒸水加至1000 ml;调pH至 7. 2 — 7. 4。
权利要求
本发明涉及一种尿道炎衣原体细胞培养维持液，特别是一种尿道炎衣原体细胞培养维持液的配方及其制备方法，其特征在于具有如下配方(克、ml/每升蒸馏水)氯化钠70.0-90.0；磷酸氢二钠0.5-0.7；磷酸二氢钾0.5-0.7；氯化钾3.0-5.0；硫酸镁1.5-3.0葡萄糖8.0-12.0；氯化钙1.0-2.0；水解乳白蛋白2.0-3.0；小牛血清10.0-12.0ml；1％谷氨酰胺1.0-1.2ml；2-巯基乙醇0.5-0.6；青霉素、链霉素、庆大霉素(10000U/ml)10.0-15.0ml；EDTA 0.1-0.3；0.5％酚红3.0-5.0ml；双蒸水加至1000ml；调pH至7.2-7.4。
2. —种权利要求1所述尿道炎衣原体细胞培养维持液的制备方法，其特征在于具有如下的步骤1) 、将氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、葡萄糖、EDTA按比例进行加 温、溶解；2) 、将氯化钙按比例加热溶解于蒸馏水中，冷至54°C ;3) 、将溶解的1)混合液缓缓加入到溶解的2)溶液中，(注意沉淀)混合、冷却后调 PH7. 2-7. 4，加酚红；4) 、将溶解的1%谷氨酰胺、2-巯基乙醇按比例加入上述混合液中，压力蒸汽灭菌 115。C，20-30min，冷至50°C ;5) 、在无菌条件下加无菌的水解乳白蛋白、小牛血清、混合抗生素混合均匀；无菌分装， 冷藏备用。
全文摘要
本发明涉及一种尿道炎衣原体细胞培养维持液；特别是一种尿道炎衣原体细胞培养维持液的配方及其制备方法。沙眼衣原体生殖道感染是最常见性传播性疾病之一。沙眼衣原体还被认为是盆腔炎及其后遗症——输卵管不孕和异位妊娠的重要病因。孕妇患沙眼衣原体宫颈炎，胎儿经产道分娩时可感染沙眼衣原体结膜炎和肺炎。衣原体细胞培养法是检查衣原体最敏感、最可靠的方法。该细胞维持液能够培养检测生殖道衣原体，具有指导临床诊断和治疗的作用，为防止滥用抗菌药物也具有重要意义。本发明具有以下优点(1)尿道炎衣原体细胞培养维持液营养丰富、配制简单；(2)临床应用效果满意，解决了床边接种的困难，污染小；(3)检测方法简单、时间短、选择性强、变色灵敏、检出率高；(4)可防止标本中细菌的过度生长，培养组织细胞的复制得以抑制。
文档编号C12Q1/04GK101698872SQ20081009341
公开日2010年4月28日 申请日期2008年4月21日 优先权日2008年4月21日
发明者曲奕 申请人:曲奕