专利名称：一种使微生物在高于其极限生长温度下生长的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体地涉及一种使微生物在高于其极限生长温度的
条件下生长的方法。
背景技术：
外界环境温度是影响生物体，尤其是微生物生长与生理变化的关键因素。每种微 生物均有其独特的生长温度范围，在超越其生长温度范围后无法生长。这也是微生物的基 本性质之一。例如，大肠杆菌最适生长温度为37t:，在42-44t:条件下仍能生长。在培养温 度达到46。C及其以上温度时无法生长。对于具有应用价值的工业微生物，改变其生理与生 长特性使其更有利于生产要求，是长期以来微生物菌种选育、改造及优化的主要目的。提 高生产菌种的高温耐受性以期进一步提高发酵过程的温度，是工业发酵领域长期追求的目 标。在微生物的工业发酵过程中，一般情况下，较高的微生物培养温度或微生物的较高耐热 性均可以给工业发酵带来十分有利的影响，并有助于大幅度降低能源及水资源的消耗。在 许多情况下，菌种对高温的耐受能力乃至菌种培养温度的提高，对于发酵工业生产过程具 有十分重要的应用价值与可观的商业价值。 自70年代以来，陆续发现了各种热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)，其中 大多数热休克蛋白属于分子伴侣蛋白，在细胞中担负辅助新生多肽、蛋白折叠、成熟、组装、 转运、降解，催化变性蛋白的复性，防止蛋白的凝聚变性等功能。热休克蛋白又叫应激蛋白 (stress protein, SP)，是生物体对外界剌激迅速作出的应激反应，关闭正常的基因表达， 开启一组应激基因的表达，而产生的一组结构上非常保守的特殊蛋白质。使生物体能快速、 短暂调整应激过程中细胞的存活机制，促进细胞抗损伤，并有助于细胞恢复正常的结构和 机能。从而使生物体在热、冷、高盐、有机毒物、重金属离子、氧自由基、紫外线及缺血、缺氧、 感染、基因损伤、组织创伤等不良环境和状态下生存下来。除了亚致死温度外，高盐、酸、碱、 乙醇等环境压力也可诱导热休克蛋白合成。 按照分子量大小，热休克蛋白 一 般分为五大类HSP100s (80-110kDa)， HSP90s (82-96kDa) ， HSP70s (67-76kDa) ， HSP60s (58-65kDa)和sHSP (40kDa以下)。极端嗜热 菌的分子伴侣系统十分简单，主要包括II型Ch即eronins (HSP60) ， sHSPs等。HSP70 (DnaK)、 HSP40 (DnaJ)、以及GrpE等分子伴侣在极端嗜热菌中则几乎不含有。 在工业生产上，目前越来越多地应用到微生物，然而目前普遍存在微生物耐热性 能差的问题，大大限制了其工业应用的广泛性。因此，本领域有必要开发和研究有效提高工 业微生物极限生长温度的方法，以克服上述问题。
发明内容
本发明的目的在于提供分子伴侣蛋白的用途，用于使微生物在高于其极限生长温 度的条件下生长；或用于提高微生物的高温耐受性。 本发明的另一目的在于提供一种使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长的方法。 在本发明的第一方面，提供一种分子伴侣蛋白或其编码基因的用途，用于使微生 物在高于其极限生长温度的条件下生长。 在另一优选例中，所述的"使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长"还包 括提高微生物高温耐受性，或提高微生物在高温下的生长能力。
在另一优选例中，所述的"极限生长温度"是指一种温度，在该温度下微生物可以 凭借自身系统生长和/或代谢，而当高于该温度时，微生物生长和/或代谢无法正常进行。
在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白是分离自古细菌的分子伴侣蛋白。
在另 一 优选例中，所述的古细菌选自(但不限于)极端嗜热古 菌 (hyperthermophilic archaea)，激 烈 火 球 菌 (Pyrococcus furiosus)， Pyrococcushorikoshii、Pyrococcus abyssi等。 在另一优选例中，所述的分子伴侣蛋白是Prefoldin蛋白或其蛋白亚基。
在另一优选例中，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亚基选自Prefoldin蛋白a 亚基，Prefoldin蛋白P亚基，Prefoldin蛋白a亚基和p亚基复合体(如Prefoldin蛋 白2个a亚基和4个13亚基的复合体)。 在另一优选例中，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亚基选自Prefoldin蛋白P 亚基，Prefoldin蛋白a亚基和p亚基复合体。 在另一优选例中，Prefoldin蛋白a亚基是(a)SEQ ID NO :1所示的氨基酸序 列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO :1所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1_20个，更佳地 1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有使微生物在高于 其极限生长温度的条件下生长功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO:l所示氨基酸序 列的蛋白的生物活性片段。 在另一优选例中，Prefoldin蛋白P亚基是(a)SEQ ID NO :2所示的氨基酸序 列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO :2所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1_20个，更佳地 1-10个，更佳地1-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有使微生物在高于 其极限生长温度的条件下生长功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO :2所示氨基酸序 列的蛋白的生物活性片段。 在本发明的第二方面，提供一种使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长的 方法，所述方法包括将外源的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微生物的细胞内，使所 述微生物细胞表达分子伴侣蛋白。 在另一优选例中，所述将外源的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微生物的细 胞内的方法包括 (i)提供一重组表达载体，该重组表达载体含有一基因表达盒，所述表达盒含有外 源的分子伴侣蛋白的编码基因；禾口 (ii)将(i)的重组表达载体转化到所述微生物的细胞内，从而使得所述细胞内含 有所述重组表达载体或者其基因组中整合有所述外源的分子伴侣蛋白。
在另一优选例中，所述的微生物选自(但不限于)原核微生物，真核细胞，古细菌。 在另一优选例中，所述的微生物是大肠杆菌。
在本发明的第三方面，提供一种制备能在高于其极限生长温度下生长的微生物的 方法，所述方法包括将外源的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微生物的细胞内，使所 述微生物细胞表达分子伴侣蛋白，从而获得所述的微生物。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1. PCR分别扩增3个基因。 其中，泳道l :PFDa基因；泳道2:PFDP基因；泳道3:含PFDP基因的目的基因。
图2. SDS-PAGE分析纯化获得的3种蛋白。 其中，泳道1 :蛋白PFDa ;泳道2 :蛋白PFD P ;泳道3 :蛋白PFD。 图3.重组蛋白(PFD a ( ■ ) ， PFD 13 ( ▲)，以及PFD a 213 4 (*))对溶菌酶活性保护
作用的比较，以空白( )为对照。其中 a.溶菌酶的浓度与添加的蛋白浓度之比为1 : 1.67;
b.溶菌酶的浓度与添加的蛋白浓度之比为1 : 1;
c.溶菌酶的浓度与添加的蛋白浓度之比为1 : 0.5。 图4. 4种重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)加热存活率的比较。其中，A : BL21 (DE) 3 (pET21b) ;B :BL21 (DE) 3 (pPFD a ) ;C :BL21 (DE) 3 (pPFD P ) D :BL21 (DE) 3 (pPFD)。
图5.重组大肠杆菌(BL21 (DE3) (pET21b) ( ) ， BL21 (DE3) (pPFD 。)(■)， BL21(DE3) (pPFDP) (▲)及BL21(DE3) (pPFD) (o))过量表达相应重组蛋白质后在不同温度
下的生长情况。其中，a :37。C ;b :46。C ;C :48。C ;d :50。C。
具体实施例方式
本发明人经过广泛的研究，意外地发现将一些具有特定功能的蛋白重组表达在微
生物细胞内可以有效地提高微生物的高温耐受能力，使微生物在高于其极限生长温度的条 件下生长。所述具有特定功能的蛋白优选的是分子伴侣蛋白类蛋白。在此基础上完成了本 发明。 如本文所用，所述的"极限生长温度"是指一种温度，在该温度下微生物可以凭借 自身系统生长和/或代谢，而当高于该温度时，微生物生长和/或代谢无法正常进行。对于 不同的微生物，该极限生长温度是不同的，对应于已知微生物的极限生长温度是本领域公 知的。例如，大肠杆菌的极限生长温度是44-46°C 。 如本文所用，所述的"高温"是指高于微生物最适生长温度的温度；例如，大肠杆菌 的最适生长温度是37°C ，所述的高温是高于37°C的温度，例如是40-50°C 。更特别地，所述 的"高温"是指高于微生物本身固有的极限生长温度的温度；例如大肠杆菌的极限生长温度 是44-46°C ，所述的高温是高于44-46°C的温度，例如是44_50°C (较佳地是46_49°C )。
如本文所用，所述的"使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长"也指提高 微生物高温耐受性，或提高微生物在极端高温下的生长能力。例如，一种微生物在培养温 度达到46t:及其以上温度时无法生长，在46°C以下可以生长，该46°C的温度即是所述微生 物的极限生长温度；而提高微生物的极限生长温度后，该微生物仍可生长的最高温度高于
546°C ，如达到47°C ， 48t:或更高。又例如， 一种微生物在常规情况下，最适生长温度为37°C ，
高于该温度不利于该微生物的生长，如在44t:生长速度缓慢、不生长或逐渐死亡；而提高 微生物的高温耐受性后，其在44t:或更高的温度下也能较好地生长。 本发明人意外地发现使来源于古细菌如极端嗜热菌的分子伴侣蛋白 Prefoldin(也称为pfu-prefoldin)重组表达(优选过表达)在微生物细胞内可以很有效 地提高微生物的高温耐受能力，使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长。因此，本发 明提供了一种分子伴侣蛋白或其编码基因的用途，用于使微生物在高于其极限生长温度的 条件下生长。 基于本发明人的上述新发现，本发明还提供了一种使微生物在高于其极限生长温 度的条件下生长的方法，所述方法包括将外源的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微 生物的细胞内，使所述微生物细胞表达分子伴侣蛋白。 所述的分子伴侣蛋白可以是任何合适的来源于分子伴侣蛋白家族的蛋白，只要其 在被微生物重组表达后能够显著提高微生物高温生长能力。 任何适合的分子伴侣蛋白均可应用于本发明。所述的分子伴侣蛋白包括全长的 分子伴侣蛋白或其生物活性片段(或称为活性片段)。经过一个或多个氨基酸残基的取 代、缺失或添加而形成的分子伴侣蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。分子伴侣蛋白或 其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其 活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容 易地被实施，并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般 来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等 MolecularBiology of The Gene，第四片反，1987， The Benjamin/Cummings Pub.Co.P224。
任何一种分子伴侣蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，分子伴 侣蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的分子伴侣蛋白的全 部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50 %的全长分子伴侣蛋白的 活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长分子伴侣蛋白的60%、70%、80%、 90%、95%、99%、或100%的活性。 作为本发明的优选方式，所述的分子伴侣蛋白是分离自古细菌的分子伴侣蛋白。 所述的古细菌可以是但不限于极端嗜热古菌(Hyperthermophilicarchaea)，包括但不限
于Pyrococcus furiosus，Pyrococcus horikoshii或Pyrococcus abyssi等。 作为本发明的特别优选的方式，所述的分子伴侣蛋白是Prefoldin蛋白或其蛋 白亚基。Prefoldin是一种辅助伴侣，一般认为它能捕获蛋白折叠中间态，将其转运到II 型Ch即eronin，并与Ch即eronin—起使变性蛋白进行正确折叠复性。古细菌Prefoldin 仅有两种亚基，a和|3亚基，而真核生物的Prefoldin由两个不同的但相关的a类亚 基和四个相关的P类亚基组成(Leroux， M. R.等(1999) ;MtGimC， a novel archaeal
ch邻erone related to the eukaryotic ch即eronin cofactorGimC/prefoldin. EMB0
J. 18,6730-6743)。来源于极端嗜热古菌的Prefoldin由两个a亚基和四个|3亚基组成类 似"水母"形状的蛋白质寡聚体，其结构由两个13折叠桶构成，六个长长的巻曲的触手伸展 到外面，触手顶端露出疏水区域，有证据表明，巻曲是变性蛋白多价结合所要求的(Siegert
R.等(2000)Structure ofthe molecular chaperone prefoldin :unique interaction ofmultiple coiled coiltentacles with unfolded proteins. Cell, 103 (4) :621-632)。以往 的研究发现Pyrococcus horikoshii 0T3 (PhPFD)的Prefoldin能避免猪心柠檬酸合成酶 等在高温环境下聚合失活，最近的研究还发现过量表达来源于Pyrococcus horikoshii0T3 的重组Prefoldin后能赋予大肠杆菌宿主一定的有机溶剂耐受性(0kochi M.等(2007) Increase of organic solvent tolerance by overexpression of manXYZ inEscherichia coli.Appl Microbiol Biotechnol. 73 :1394-1399)。 作为本发明的优选方式，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亚基是Prefoldin蛋白 a亚基，Prefoldin蛋白P亚基，Prefoldin蛋白a亚基和p亚基复合体(如Prefoldin 蛋白2个a亚基和4个|3亚基的复合体，即Prefoldin a 2|34)。微生物细胞内重组表达 Prefoldin蛋白P亚基或Prefoldin蛋白a亚基和|3亚基复合体具有特别优异的提高微 生物耐热性效果，使得微生物在高于其极限生长温度的条件下正常生长和增殖。
更优选地，Prefoldin蛋白a亚基是(a) SEQ ID NO :l所示的氨基酸序列的蛋白； 或(b)将SEQ ID NO :1所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1-20个，更佳地1-10个，更 佳地l-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高微生物高温耐受性功能 的由(a)衍生的蛋白；或(c)SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。或者， Prefoldin蛋白P亚基是(a) SEQ IDNO :2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)将SEQ ID NO : 2所示氨基酸序列经过一个或多个(优选1-20个，更佳地1-10个，更佳地1-5个)氨基酸 残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有提高微生物高温耐受性功能的由(a)衍生的蛋 白；或(c)SEQ ID N0:2所示氨基酸序列的蛋白的生物活性片段。 所述的Prefoldin蛋白的a亚基的氨基酸序列还可参见Genbank登录号 NP_578104。所述的Prefoldin蛋白的P亚基的氨基酸序列还可参见Genbank登录号 NP—578111. 1。 分子伴侣蛋白的编码基因是容易获得的，在蛋白已知的情况下，本领域人员均了 解如何获得分子伴侣蛋白的编码基因，例如可以采用PCR扩增的方式从基因组中获得，获 得采用化学合成的方式。例如，所述的Prefoldin蛋白a的亚基的编码基因可参见Genbank 登录号PF0375。所述的Prefoldin蛋白的P亚基的编码基因可参见Genbank登录号 PF0382。更优选地，所述的Prefoldin蛋白的a亚基的编码基因通过以下方式获得以上 游引物5' -ATGGAAAACAATAAGGAATTGGAAAAGGTTGCT-3'(或5' -CGGGATCCATGGAAAACAATA AGGAATTGGAAAAGGTTGCT-3' (SEQ ID NO :3))和和下游引物5' -TCACTTCTTAAGCTTGAAGC-T CATTGCTTG-3'(或5' -GGAATTCTCACTTCTTAAGCTTGAAGC-TCATTGCTTG-3' (SEQ ID NO :4)) 从极端嗜热古菌的(如Pyrococcus furiosus)基因组中PCR扩增获得。所述的Prefoldin 蛋白的P亚基的编码基因通过以下方式获得以上游引物5' -ATGCAAAACATT
CCACCCCAAGT-3'(或5' -CGGGATCCATGCAAAACATTCCACCCCAAGT-3' (SEQ ID NO : 5));和下游引物5' -TCATCCAGCGGTTGGAGGTCTTAGGGCTGCCTGAATC-3 '(或5' -GGAATTC TCATCCAGCGGTTGGAGGTCTTAGGGCTGCCTGAATC-3' (SEQ ID NO :6))从极端嗜热古菌的(如 Pyrococcus furiosus)基因组中PCR扩增获得，该扩增产物编码的蛋白是Prefoldin蛋白 的13亚基片段，该片段的表达具有较佳的提高微生物高温耐受性的效果。此外，与上述扩 增获得的基因序列简并的序列也是可用的。 将外源的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微生物的细胞内的方法是本领域人员熟知的。通常的方法是，获得编码所述的分子伴侣蛋白的生物活性片段的基因序列， 将其连入合适的表达载体，再转入微生物细胞。更具体的步骤是(i)提供一重组表达载 体，该重组表达载体含有一基因表达盒，所述表达盒含有外源的分子伴侣蛋白的编码基因； (ii)将(i)的重组表达载体转化到所述微生物的细胞内，从而使得所述细胞内含有所述重 组表达载体或者其基因组中整合有所述外源的分子伴侣蛋白。通过选择合适的表达载体， 或者在表达载体上选择合适的启动子或增强子等以促进分子伴侣蛋白的表达是本领域人 员熟知的。根据需要，所述的重组表达载体上还可含有其它外源蛋白的基因表达盒。
本发明的方法适用于多种微生物，所述的微生物可以是原核微生物，真核细胞，古 细菌等。所述微生物的一个具体的例子是大肠杆菌。所述的微生物可以是内源含有完整的 自身分子伴侣蛋白系统，但在外源给予分子伴侣蛋白后，耐热性进一步提高。
当所述的微生物是一种工业生产用的微生物时，所述的微生物还可内源性或外源 性地表达其它的蛋白质或产生其它代谢产物(如工业上有用的产物)。例如，所述的微生物 中可转入至少一种分子伴侣蛋白以外的其它外源蛋白的编码基因，并表达该外源蛋白。
在本发明的较佳实施例中，本发明人从极端嗜热古菌的基因组DNA中克隆得到 Prefoldin基因，在大肠杆菌中获得重组表达，并分别纯化得到Prefoldin的a亚基、|3亚 基及成熟Profoldin蛋白。体外实验结果显示，在高温条件下，13亚基及成熟Profoldin 蛋白的作用对于溶菌酶具有明显的保护作用。并且还意外发现，Prefoldin单个亚基 或Prefoldin能够显著提高宿主大肠杆菌在高温处理下的存活率。不仅如此，重组表达 PrefoldinP亚基或同时重组表达a亚基与|3亚基的大肠杆菌宿主细胞能够在高于正常 大肠杆菌极限生长温度的条件下生长。本发明的新发现首次表明并证实来源于极端嗜热菌 的分子伴侣Prefoldin的重组表达能够明显地提高宿主菌的极限生长温度。
本发明的主要优点在于 (1)本发明首次表明并证实外源分子伴侣蛋白在微生物中的重组表达可以有效地 提高微生物的极限生长温度。从而不需要复杂的选育步骤即可获得大量的耐高温的微生 物。 (2)本发明为未来微生物(特别是工业微生物)菌种的改造、应用与优化提供了一 个全新的途径，并有助于深刻认识生命现象的本质。 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。
I.材料和方法
材料 pET21b载体购自Novagen公司，Pfu DNA聚合酶、质粒抽提试剂盒、DNA琼脂糖电 泳胶回收试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司，BamHI、 EcoRI、 Xbal、 Sail、 T4DNA连 接酶、Taq DNA聚合酶购自大连宝生物工程有限公司。
极端嗜热古菌(Pyrococcus furiosus)基因组的提取 约0. 5g Pyrococcus furiosus DSM3638 (购自DSMZ ;德国菌种与细胞保藏中心)湿菌体中，加入7.5ml TNE(0.1M Tris HCl (pH7. 5) ， 0. 1M NaCl， 50mMEDTA) ， lml 10%十二 烷基肌氨酸钠，lml 10% SDS，O. 5ml蛋白酶K(lmg/ml)，混合均匀，5(TC水浴保温3小时，用 酚抽提2次，再用氯仿抽提1次，加入0. 42ml 5M NaCl，再加入2倍体积无水乙醇沉淀DNA， 12000rpm，离心10分钟，37。C烘箱晾干，加入含0. lmg/ml RNase A的TE， 37。C水浴1小时以 除去RNA。 Pfu-Prefoldin的基因克隆及重组表达 比对Pyrococcus furiosus禾口 Pyrococcus horikoshii的序列，获取编码
PFDa亚基禾口 P亚基的基因(Kawarabayasi Y.等(1998) ;Complete sequence and
geneorganization of the genome of a hyPer—thermophilic archaebacteri咖，
Pyrococcushorikoshii 0T3 ;DNA Res. 5，55-76.)。 PFDa的引物为 上游引物(SEQ ID NO :3): 5' -CGGGATCCATGGAAAACAATAAGGAATTGGAAAAGGTTGCT-3'，
下游引物(SEQ ID NO :4): 5' -GGAATTCTCACTTCTTAAGCTTGAAGCTCATTGCTTG-3'; 以Pyrococcus furiosus基因组为模板PCR扩增，然后克隆到经BamHI/EcoRI酶
切的pET21b载体上，得到含有PFD a亚基编码序列的表达载体pPFD a 。 PFDP的引物为 上游引物(SEQ ID NO :5): 5' -CGGGATCCATGCAAAACATTCCACCCCAAGT-3'， 下游引物(SEQ ID NO :6): 5' -GGAATTCTCATCCAGCGGTTGGAGGTCTTAGGGCTGCCTGAATC-3'; 以Pyrococcus furiosus基因组为模板PCR扩增，然后克隆到经BamHI/EcoRI酶
切的pET21b载体上，得到含有PFD 13亚基编码序列的表达载体pPFD P 。
共表达质粒PFD的构建如下以pPFD P为模板，引物为 上游引物(SEQ ID NO :7): 5' -GCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA-3'，
下游引物(SEQ ID NO :8): 5' -ACGCGTCGACGGAGCTCGAATTCTCATCCAGCGGTTG-3'; PCR扩增后克隆到经Xbal/Sall酶切的pPFD a上，得到共表达载体pPFD。PCR扩增程序为94。C变性3min，94。C 30s，56。C 30s，72。C lmin， 30个循环，72。C延
伸10min，4。C保存。 测序正确的质粒分别转化到E. coli BL21(DE)3中，得到 E.coliBL21(DE)3(pPFDa)，E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P ) ， E. coli BL21 (DE) 3 (pPFD);同时转 化pET21b作对照。 重组Prefoldin的表达和纯化 挑取-70。C保存的菌株E. coli BL21(DE)3(pPFDa)，E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P )， E. coli BL21(DE)3(pPFD)于LB液体培养基(含100 y g/ml的氨苄青霉素)中，37"过夜培 养，以1%接种于同样的培养基中培养3小时，至0D达到0. 6-0. 7时，加入IPTG至终浓度lmmol/L，诱导3小时，离心收集菌体，随后重悬于超声破碎缓冲液中(50mM Tris-HCl缓冲 液，含O. 5M NaCl， pH 8. 0)，置冰水中超声破碎，4°C 15000g离心40分钟，上清随后上样于 Ni2+亲和层析柱，0-0. 5M咪唑梯度洗脱，获得纯化的蛋白。 将纯化的PFD a亚基和PFD P亚基按照浓度1 : 2混合，8(TC水浴加热30min，可 得到PFDa^4。 SDS-PAGE电泳分析蛋白的分布和纯度。蛋白的浓度则用Bradford法测定，以牛血 清白蛋白作为标准。 Prefoldin对溶菌酶热保护作用的测定 反应体系为0. 1M磷酸氢钠缓冲液，PH 7. O，溶菌酶的终浓度为0. 18mg/ml，分别以 1 : 1.67、1 : 1、1 : 0. 5的终浓度分别加入PFDa ，PFDP ，PFD，和重组蛋白PFDa2P4，9(TC 加热0， 10， 20， 30， 40分钟。 溶菌酶的作用底物为小球菌，O. 25mg/ml，缓冲体系为0. 1M磷酸钾缓冲液，ffl 6. 2，样品每隔10分钟取样，加入到小球菌反应体系，在450nm处测得0D值每分钟递减 量，根据相对活力百分比可比较加热前和加热后的溶菌酶活性(参见Garcia-Orozco K. D. 等 (2005) Recombinant bacterial expression of the lysozymefrom the tobacco—hornworm Manduca sexta with activity at low temperatures. Biotechnol Lett. 27 :1075-1080.)。 重组大肠杆菌加热后存活率的测定 挑取于-70 °C 储存的菌种E.coli BL21 (DE)3(pET21b)、 E.coliBL21(DE)3(pPFDa)、 E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P ) 、 E. coli BL21 (DE) 3 (pPFD)于 20/100ml LB(含100iig/ml氨苄青霉素)锥形瓶中培养过夜，测0D600,根据吸光值以 相同接种量接到20/100ml LB培养基(含100 y g/ml氨苄青霉素)，待0D600为0. 6左 右，加IPTG至终浓度O. lmM，诱导2. 5h，各分装400iU到4支试管中，于50°C水浴分别 加热0、lh，再用灭过菌的0. 9 % NaCl稀释到适当倍数，均匀涂布到LB平板上，过夜培 养后数菌落，计算细菌加热后的存活率(参见Takeuchi S. (2006)Analytical assays of human HSP27and thermal—stresssurvival of Escherichia coli cells that overexpress it. Biochem Biophys ResComm皿.341 (4) :1252-1256; 或Plater M丄， 等(1996)Effects of site_directedmutations on the ch即erone-like activity of the alphaB-crystallin. J Biol Chem. Nov8 ;271 (45) :28558-66 ;或Soto A.等(1999) Heterologous expression of a plant smallheat—shock protein enhances Escherichia coli viability under heat and coldstress. Plant Physiol. ，120 (2) :521-528)。
重组大肠杆菌生长极限温度的测定 挑取于-70 °C 储存的菌种E.coli BL21 (DE)3(pET21b)、 E.coliBL21(DE)3(pPFDa)、 E.coli BL21 (DE) 3 (pPFD P ) 、 E. coli BL21 (DE) 3 (pPFD)于 20/100ml LB(含100iig/ml氨苄青霉素)锥形瓶中培养过夜，测0D600,根据吸光值以相 同接种量接到20/100ml LB培养基(含100 y g/ml氨苄青霉素)，待0D600为0. 6左右，加 IPTG至终浓度0. lmM，诱导2. 5h，各分装20ml到4个250ml锥形瓶中，再加入20ml新鲜LB 培养基，分别于37t:、46t:、48t:、5(rC水浴摇床(150rpm)中进行培养，每隔1小时测定菌体 生长情况(0D600值)。
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II.实施例 实施例l.重组Prefoldin的克隆、表达和纯化 以P. furiosus基因组DNA为模板，PCR扩增得到PFD a 、 PFD P禾P PFD基因，鉴 定结果如图1。将上述扩增产物分别克隆到载体pET21b上，测序正确后，转化到E.coli BL21(DE)3中，IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳分析显示，PFD a禾P PFD P亚基的分子量分别 为16. 4kDa和13. 2kDa。根据其N末端的His-tag， Ni2+亲和层析可获得纯度较高的蛋白， 鉴定结果如图2。 将纯化获得的PFD a亚基和PFD P亚基蛋白按照浓度1 : 2混合，再于8(TC水浴 加热30min，从而获得重组蛋白PFD a 213 4。
实施例2.防止溶菌酶热变性的测定 鸡卵白溶菌酶常被用于作为模型蛋白，这是因为它的变性和折叠机理被研究得比 较详细。当不同浓度的PFD加入一起孵育时，可以发现溶菌酶活性下降显著变得缓慢，并且 这种保护效果随着PFD加入量的增加而提高，如图3。
实施例3.重组大肠杆菌加热存活率的测定 将IPTG诱导后过量表达相应重组蛋白质的大肠杆菌菌株BL21 (DE) 3 (pET2 lb)、 BL21 (DE) 3(pPFD a ) 、BL21 (DE) 3 (pPFD P ) 、BL21 (DE) 3 (pPFD)转移到50。C水浴中分别加热0、 lh，以37t:为对照，再用灭过菌的0. 9% NaCl稀释适当倍数后，均匀涂布到LB固体培养基 上，过夜培养后可以发现表达PFD a 、 PFD 13 、 PFD的菌株存活率分别较不表达PFD菌株提高 约2倍、12倍和10倍，如图4。 SDS-PAGE结果可以发现，PFD蛋白质为可溶性表达。实验结 果表明过量表达的重组PFD大大提高了大肠杆菌宿主对高温的耐受性。
实施例4.重组大肠杆菌生长极限温度的测定 菌株E.coli BL21 (DE) 3(pET21b) 、 E. coli BL2 1 (DE) 3 (pPFD a )、 E. coliBL21(DE)3(pPFDe)、 E. coli BL21 (DE)3(pPFD)于LB(含100 ii g/ml氨节青霉素) 液体培养基中培养，当IPTG诱导表达相应重组蛋白质后，菌株E. coliBL21(DE)3(pPFD) 在37。C时的生长情况明显好于对照。如图5a。菌株E. coliBL21 (DE)3(pPFDa ) 、 E. coli BL21 (DE)3(pPFDP ) 、 E. coli BL21 (DE)3(pPFD)在46。C及48。C都可继续生长，而对照菌株 E. coli BL21(DE)3(pET21b)则生长停滞，且OD值持续下降，如图5b，图5c。当培养温度上 升至大肠杆菌致死温度5(TC时，4种菌株均生长停止，如图5d。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 序列表 〈110〉中国科学院上海生命科学研究院 〈120〉 一种使微生物在高于其极限生长温度下生长的方法 〈130>087472 〈160>8 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>146〈212>PRT〈213〉古细菌(Pyrococcusfuriosus)〈400>1MetGluAsn Asn Lys GluLeuGluLysVal Ala TyrGluTyrGinVal151015ValGinAla Gin Ala GinLeuLeuAlaGin Asn LeuGluLeuLeuSer202530LeuAlaGin Ala Glu ValGinThrValLys Glu ThrLeuGluAsnLeu354045MetLyslie Glu Asp GluAsnProGlulie Leu ValProlieGlyAla505560GlySerPhe Leu Lys GlyLyslieValAsp Lys AsnAsnAlalielie65707580SerValGly Ser Gly TyrAlaValGluLys Thr LeuGluAspAlalie859095LysTyrLeu Asp Glu ArglieLysGluTyr Asp GluAlalieArgLys100105110ThrGinGlu Ala Leu AsnGluLeuGinLys Arg AlaAlaGluLeuAla115120125LysLysAla Gin Glu lieGinGinLysGin Ala MetSerPheLysLeu130135140LysLys145〈210>2〈211>117〈212>PRT〈213〉古细菌(Pyrococcusfuriosus)〈400>2MetGinAsn lie Pro ProGinValGinAla Met LeuGlyGinLeuGlu151015SerTyrGin Gin Gin LeuGinLeuVallie Gin GinLysGinLysVal202530GinAlaAsp Leu Asn GluAlaLysLysAla Leu GluGlulieGluLys354045LeuThrAsp Asp Ala VallieTyrLysThr Val GlyThrLeulieVal505560LysThrThr Lys Glu LysAlaLeuGinGlu Leu LysGluLysValGlu65707580:0155] Thr Leu Glu Val Arg Leu Asn Ala Leu Asn Arg Gin Glu Gin Lys lie
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:0183] 〈400>5
:0184] cgggatccat gcaaaacatt ccaccccaag t 31 <210>6 〈211〉44 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈221>misc—feature 〈223〉引物 〈400>6 ggaattctca tccagcggtt ggaggtctta gggctgcctg aatc 44 〈210>7
〈211>35<212>DNA〈213〉人工序列〈22l〉misc—feature〈223〉引物<400>7gctctagaaa taattttgtttaactttaag〈210>8〈211>37<212>DNA〈213〉人工序列〈22l>misc—feature〈223〉引物<400>8acgcgtcgac ggagctcgaattctcatccagcggttg
权利要求
一种分子伴侣蛋白或其编码基因的用途，用于使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长。
2. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的分子伴侣蛋白是分离自古细菌的分 子伴侣蛋白。
3. 如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的古细菌选自极端嗜热古菌，激烈火 球菌，Pyrococcus horikoshii， Pyrococcus abyssi。
4. 如权利要求l所述的用途，其特征在于，所述的分子伴侣蛋白是Prefoldin蛋白或其蛋白亚基。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Prefoldin蛋白或其蛋白亚基选自 Prefoldin蛋白a亚基，Prefoldin蛋白P亚基，或Prefoldin蛋白a亚基和p亚基复 合体。
6. —种使微生物在高于其极限生长温度的条件下生长的方法，所述方法包括将外源 的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微生物的细胞内，使所述微生物细胞表达分子伴侣 蛋白。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述将外源的分子伴侣蛋白的编码基因导 入到所述微生物的细胞内的方法包括(i) 提供一重组表达载体，该重组表达载体含有一基因表达盒，所述表达盒含有外源的 分子伴侣蛋白的编码基因；禾口(ii) 将(i)的重组表达载体转化到所述微生物的细胞内，从而使得所述细胞内含有所 述重组表达载体或者其基因组中整合有所述外源的分子伴侣蛋白。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的微生物选自原核微生物，真核细胞， 古细菌。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的微生物是大肠杆菌。
10. —种制备能在高于其极限生长温度下生长的微生物的方法，所述方法包括将外 源的分子伴侣蛋白的编码基因导入到所述微生物的细胞内，使所述微生物细胞表达分子伴 侣蛋白，从而获得所述的微生物。
全文摘要
本发明涉及一种使微生物在高于其极限生长温度下生长的方法。本发明还提供了分子伴侣蛋白的用途。本发明为微生物(特别是工业微生物)菌种的改造、应用与优化提供了全新的途径。
文档编号C12N15/31GK101748134SQ20081020355
公开日2010年6月23日 申请日期2008年11月28日 优先权日2008年11月28日
发明者张毅, 杨胜利, 陈辉 申请人:中国科学院上海生命科学研究院