与大鼠精子发生相关的基因序列的制作方法

专利名称：与大鼠精子发生相关的基因序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种基因工程技术领域的基因序列，更具体地说，是涉及一 种与大鼠精子发生相关的基因序列。
背景技术：
精子发生是复杂的过程，这过程包括精原干细胞(spermatogonial stem cells, SSCs)经过有丝分裂、减数分裂，依次分化为A型精原细胞、B型精原细 胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞，最后生成成熟的精子。在这一分 化过程中，每一特定的阶段都受到严谨的调控。由于每个阶段都有细胞特异性和 发育阶段特异性的结构形成，因此，众多阶段特异性基因的转录和表达就成为了 形成生精细胞阶段特异性结构及发挥特定细胞功能的基础。一旦其中的任一阶段 发生变异，都有可能影响最终精子的生成。现今，在发达国家的已婚人群中，有 将近15%的夫妇存在不孕不育的问题，而其中男性不育将近占到了一半。在我国， 男性不育也占到了 33. 15%。其中遗传因素占原发性男性不育的60%，并且大多数 以常染色体隐性方式遗传。目前，由于性激素的滥用和环境污染等问题，男性不 育呈上升趋势，这就越来越引起人们的关注和重视。从而研究这些精子发生过程 中阶段性转录和表达的基因，阐明精子发生的分子机制，对人类的生殖健康、避 孕疫苗的研制和男性不育的防治就具有十分重要的意义。
此外，畜牧业作为以种植业为基础的第二性产业，现今己成为中央为推动粮 食生产区的农业结构调整，增加农民收入的重要举措。而在畜牧业中，往往一只 雄性要负担好几只雌性的配种任务，因此如何从根本上提高雄性的繁殖能力就成 了推动畜牧业发展的重要内容。
但是迄今为止，人们对参与精子发生的各基因的研究还处在初级阶段，虽然 已经对少数的相关基因的作用进行了研究，但是还存在大量的、未知的作用基因 没有被发现
发明内容
.本发明的目的在于通过实验从大鼠睾丸中克隆出的一个新的、还未见报道的 基因，在其他物种中，也没有其同源基因的有关报道，提供一种与大鼠精子发生 相关的基因序列。利用这个新基因在大鼠睾丸中具有阶段性转录和表达的特性， 为进一步研究雄性不育、开发雄性相关避孕药具有重要的作用；此外，对于畜牧 业来说，该基因的克隆及功能也将为进一步开发与研制提高雄性生殖能力的饲料 具有十分积极的促进作用。本发明通过实验从大鼠睾丸中克隆出一个具有阶段性 转录和表达特性的全新基因，由于其在大鼠生殖细胞(rat germ cells)中具有表 达，因此将其命名为rGecl。
本发明是通过以下技术方案实现的-
本发明所分离出或纯化的与大鼠精子发生相关基因编码的核苷酸序列及其 蛋白分子序列，所述的核苷酸序列，是指包括在已经分离出或纯化的与大鼠基 因具有高度同源性的核苷酸序列的DNA分子，该分子与SEQ ID NO. 3中的从第 459-1214位的核苷酸序列至少有70%的同源性。
所述的基因，其mRNA全长为1705bp，其开放阅读框的启示密码子始于第459 位核苷酸，终于第1214位核苷酸，编码一条含252个氨基酸的多肽。
或者在中度严紧条件下，所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO. 3中的从第 459-1214位的核苷酸序列杂交。较佳地是所述的核苷酸序列能编码与SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列一致的多肽。更佳地是所述的核苷酸序列能与SEQ ID NO. 3中从第459-1214位的核苷酸序列一致。这就包括SEQ ID NO. 3中的第 459-1214位的核苷酸序列、其简并序列及SEQ ID NO. 3中的第459-1214位的核 苷酸序列的变异形式。简并序列是指SEQ ID N0.3序列的第459-1214位核苷酸 中有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代而产生的序列。该 术语还指那些能在中度严紧条件下、更佳地是能在高度严紧条件下与SEQ ID NO. 3中第459-1214位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。SEQ ID NO. 3中的第 459-1214位的核苷酸序列的变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、 插入和/或取代(通常为l-90个，较佳地为l-6 0个，更佳地为l-20个，最佳地 为1-10个)，以及在5'和/或3'端添加数个核苷酸(通常为60个以内，较佳地为 30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)。
上面所述的核苷酸序列或其片段可以采用PCR扩增法、重组法或人工合成等
4方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开 放阅读框序列来设计引物，用市售的cDNA库或按本领域常规方法所制备的cDNA 库作为模板进行扩增而得到相关序列。当序列较长时，常常需要两次或多次PCR 扩增，然后把扩增出的片段按正确的次序拼接起来。 一旦获得了有关的序列，就 可以采用各种方法进行大批量地获得该序列。通常是将其克隆入载体，再转入菌 株或是细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主中分离得到该序列。
所述的基因编码，具有SEQIDN0.3所示的氨基酸序列的蛋白或多肽、其变 异形式、活性片段，或活性衍生物。
所述的蛋白或多肽，是指分离出的或纯化的与大鼠基因蛋白具有高度同源 性的蛋白或多肽，该多肽为具有SEQ ID N0.3中的氨基酸序列的多肽。
所述的蛋白或多肽，利用该蛋白或多肽获得的抗血清。
最佳地是该多肽的氨基酸序列完全与SEQ ID NO. 3氨基酸序列一致。其变异 形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代(通常为1-90 个，较佳地1-60个，更佳地l-20个，最佳地1-10个)，以及在C末端和/或N 末端添加一个或数个氨基酸(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为 IO个以内，最佳地为5个以内)。例如，在本领域中，用性质相近或相似的氨基 酸进行取代(称为保守性变异)，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末 端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。其类似物 与天然的大鼠多肽的差别可以是不影响序列的修饰形式上的差异，也可以是氨基 酸序列上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的突变体。诱导突变 体可以通过采用辐射或诱变剂的方法产生，还可通过已知分子生物学的技术(如 通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中)产生。这些类似物还包括含有不同 于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及含有非天然存在的氨基酸 (如e、 Y-氨基酸)的类似物。修饰的形式包括体内或体外的多肽的化学衍生
形式，如磷酸化、糖基化、乙酰化或羧基化等。应该指出的是，本发明的多肽
并不限于上述列举的代表性多肽。
所述的分离出或纯化的DNA，是指在cDNA水平上，利用引物对该基因的扩 增和利用纯化试剂盒对扩增产物进行纯化。
上面所述的蛋白或多肽可采用重组法生产，也可用固相技术，人工直接合成。例如，通过使用肽合成仪来自动合成肽。也可以分别合成本发明蛋白的各片段， 然后用化学方法加以连接而形成全长的分子。利用本发明的与大鼠蛋白具有高度 同源性的蛋白，进行各种实验方法，可筛选出与之发生相互作用的物质、或者受 体、抑制剂或拮抗剂等。
本发明提供了一种载体，它包含所述的DNA分子。在本发明中，可选用本领 域中已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒、病毒载体、粘粒等。在生产本 发明的大鼠蛋白的多肽时，可以将大鼠蛋白的编码序列可操作地连于表达调控序 列，从而形成大鼠蛋白表达载体，可用于后续对该基因功能的研究或是构建该基 因过量表达的模型。术语"可操作地连于"指DNA连接完成后，编码该蛋白的 DNA序列的活性能被与之位于同一线性DNA序列的其他部分所影响。例如，如果 信号肽DNA、启动子控制序列、核糖体结合位点等都可操作地连于编码序列。
所述的核苷酸序列，对于可用作探针的核苷酸分子，该分子具有SEQ ID NO. 3 核苷酸序列中所示的第459-1214位核苷酸序列中10-600个连续核苷酸。较佳地 是具有100-500个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码大鼠蛋白 的核酸分子。
本发明提供了检测样品中是否存在编码大鼠蛋白的核苷酸序列的方法。它包 括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否能与之发生结合。该样品可 以是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于大鼠基因的核苷酸序列，并可 位于该序列的两侧或中间。引物长度一般为15-50个核苷酸。在本发明中，可用 Northern印迹法技术分析各样品中与大鼠蛋白具有高度同源性的基因产物的表 达，即分析其RNA转录物在细胞中的存在与否和数量。
所述的氨基酸序列，对于可用作制备抗体的氨基酸分子，该分子具有SEQID NO.氨基酸序列中所示的10-252个连续氨基酸。该多肽可用于制备抗体，并用所 得的抗体检测样品中是否存在大鼠蛋白分子。
本发明提供了检测样品中是否存在大鼠蛋白的方法。它包括用上述的制备的 抗体与样品进行杂交，然后检测抗体是否能与之发生结合。在本发明中，可用 Western杂交法技术分析各样品中与大鼠蛋白具有高度同源性的基因产物的表 达，即分析其蛋白在细胞中的存在与否和数量。
本发明提供的通过实验发现并克隆得到了新的与精子发生相关的大鼠基因，增加了我们在对精子发生研究方面的认识。有利于我们进一步研究精子发生的分 子机制以及对与之有关的疾病的研究，对治疗男性不育、研制男性避孕药以及开 发具有提高畜牧业中雄性繁殖能力的词料也都具有重要的作用。因此，本发明具
有很大实际应用价值。


图l大鼠基因在不同时期的大鼠睾丸中的表达差异分析示意图； 图中A为Northern Blot的结果，B为Western Blot的结果。 图2大鼠基因在不同时期的大鼠睾丸中的表达细胞分析示意图中A: 1日龄睾丸；B: 5日龄睾丸；C:成年睾丸；D:阴性对照
具体实施例方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案 为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于 下述的实施例。下列实施例中未列出具体实验方法的，通常按照《分子克隆实
验指南》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)或《精编 分子生物学基本实验指南》(中国科学出版社，2005)中所述的操作方法，或 按照制造厂商所建议的条件进行。 实施例1
大鼠基因的筛选及全长克隆
1. 取组织
雄性大鼠，取睾丸，准备抽取RNA。
2. 提取RNA
取睾丸于1. 5ml的EP管中，加入TRIzol试剂，用均浆器在冰中进行均浆， 然后室温放置5min，加入氯仿，剧烈混匀，并室温放置3min。然后4'C最大速 度离心15min，取水相。最后可采用无水乙醇及乙酸钠进行浓縮。用分光光度计 测定RNA含量。
3. 反转录PCR (RT-PCR)合成筛选探针
对上述所得RNA进行反转录合成第一链cDNA，并采用PCR方法合成用于筛 选的探针。所用的PCR引物对为G0N001 (SEQI,.l) +GON002 (SEQIDN0.2)。 然后采用Promega公司的随机引物标记试剂盒将Y -P32标记到探针上。4.克隆基因的全长
通过cDNA文库筛选以及3' -RACE方法克隆得到与精子发生相关基因的 cDNA全长序列。
(1) cDNA文库筛选
用上述标记好的探针进行对Stratagen提供的Lambda ZAP* II Library的 cDNA文库进行筛选，挑选出阳性克隆，得到其中片段，并进行进一步的克隆及 研究。
(2) 3， -RACE
根据Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒的说明书进行。然后将 各测序结果进行拼接，得到该基因的全长序列(SEQ ID NO. 3)。 实施例2
大鼠基因的序列信息
本发明的大鼠基因的全长cDNA的长度为1705bp，详细序列见SEQ ID NO. 3， 其中开放阅读框位于459-1214位核苷酸(共756个核苷酸)。根据全长cDNA推 导出基因的氨基酸序列，共252个氨基酸残基，分子量为22138.45Da，等电点 (pi)为4. 59。详细序列见SEQ ID NO. 3。
实施例3
大鼠蛋白特异性抗体的制备。
1. 合成目标肽段
由Invitrogen公司制备小肽，其氨基酸序列为LVEE腿認HEGNGTD。
2. 制备抗体
以上述小肽作抗原免疫兔子，并加以纯化，得到兔源的大鼠基因蛋白特异性 纯化抗体。 实施例4
大鼠基因在大鼠不同时期的睾丸中的表达谱分析
1. 组织的收集
取l日龄、3日龄、5日龄、10日龄、15日龄、20日龄及成年大鼠睾丸。
2. Northern杂交分析
1) . RNA的提取利用TRIzol试剂提取上述各组织的RNA[参考《分子克隆:
8实验指南》有关RNA的制备章节(Sambrook等，2001)]。
2) . RNA的定量参考《分子克隆实验指南》(Sambrook等，2001)，用 分光光度计测0D260: RNA含量计算1 OD260 = 40吗/ml。
3) .总RNA用甲醛变性胶电泳分离l)称取l. lg琼脂糖，加入到108.65ml 无菌水中，加热融化，转入55。C水浴中。2)取6.25ml 20X电泳缓冲液加入到 55°C的凝胶溶液中，混匀。3)再于通风橱中取10. Oral甲醛，加入到55°C的凝 胶溶液中，混匀。4)迅速倒入制胶板中，室温水平放置30分钟，待胶凝固。5) 将提取的RNA (25吗)溶解于RNA变性溶液中，在65°C下加热5分钟，然后立 即置于冰上。6)在样品中加入2ul IOX上样缓冲液，混匀。7)在电泳液未盖 过胶的条件下点样，5V/cm电压电泳2-3小时左右。
4) . RNA尼龙膜上转移1)转移之前，将尼龙膜用20XSSC浸泡。2)电 泳好的胶先在浸胶液(50mM NaOH, lOmMNaCl)中浸泡20分钟，然后再在lOmM Tris-HCl (pH=7. 5)中浸泡20分钟，最后用20XSSC浸泡20分钟。3)将湿润的 膜准确地盖在胶上，将三张与膜大小相同的滤纸置20XSSC溶液中湿润，盖在膜 上，赶尽气泡。4)滤纸上放一叠与膜大小相同的吸水纸，在吸水纸上放一玻璃 板和一重物，水平放置，转移12-20小时。5)转移后，将膜于紫外交联仪中紫 外交联1分钟。
5) .膜上杂交信号的检出1)将膜浸在Rapid-hyb缓冲液(Amersham Bioscienses)中，65°C下预杂交30分钟。2)将用Y-P"标记的探针在沸水中 变性5分钟，直接加入l)的杂交液中，于65。C杂交3小时。3)取出膜，置于 洗膜液I (2XSSC， 0. 1%SDS)中，漂洗2次，每次5分钟。然后，转入洗膜液 II (0. 1XSSC， 0. 1%SDS)中于65。C漂洗15分钟。4)用X光片压片30-90分钟， 然后显影、定影。
Northern杂交结果表明基因在早期的大鼠睾丸(1日龄、3日龄、5日龄、 10日龄、15日龄)中有着很强的表达，而在20日龄以后的大鼠睾丸中表达量明 显下降(图1A)。
3. Western杂交分析
提取上述取的的总蛋白，
2)提蛋白收集不同时期的大鼠睾丸，加入蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂，机械捣碎，提取总蛋白[参考《精编分子生物学基本实验指南》有关蛋白质的提 取及浓度测定章节(奥斯伯等主编，2005)]。
3) 总蛋白用SDS-PAGE电泳分离A. 12%分离胶配制双蒸水3. 35ml， 1.5M0L/L Tris-HCl (pH8. 8)2. 5ml， 10%SDS 0. lml， 30%丙烯酰胺4. 0ml， 10%过 硫酸胺50 u 1 ， TEMED 5 u 1 ; B. 4%浓缩胶配制双蒸水1. 22ml ， 0. 5M0L/L Tris-HCl (pH6. 8)0. 5ml， 10%SDS 20ul， 30%丙烯酰胺0. 26ml， 10% 过硫酸胺10ul， TEMED 2ul; C.待胶凝固后，取下梳子；D.样品加等量上样 缓冲液混匀，IO(TC煮沸5min， 12000rpm离心5min，上样后稳压条件下电泳， 浓縮胶70V、分离胶140V，至溴酚蓝迁移到凝胶底部时，停止电泳。
4) 蛋白向硝酸纤维素膜转移A.在转移缓冲液中浸泡约30min与凝胶同样 大小的Hybond膜和两张3mm滤纸；B. SDS-PAGE结束后，取出凝胶，将膜、凝 胶和滤纸按海绵垫-滤纸-凝胶-Hybond膜-滤纸-海绵垫的结构，装入转印夹中， 各层间不能有气泡，转印时凝胶侧接负极，Hybond膜侧接正极，转印电泳槽置 冰浴中，100V恒压转印2小时；C.转印结束后，按加样孔的位置，剪下分子量 标准的膜条用丽春红染色，观察转印效果。
5) 膜上目标蛋白的检出A.置于封闭液中室温振摇1小时；B.取出后置 于合适稀释度的一抗(大鼠基因特异性抗体或e-tublin抗体中，室温振摇2 小时；C.取出膜用洗涤液洗2-3次，每次5min; D.然后置于带有服P的相应 二抗中，室温振荡l小时；E.取出膜用洗涤液洗2-3次，每次5min; F.最后 将膜置于ECL显色液中，并用X光片压片5-60分钟，然后显影、定影。
结果同样也表明大鼠基因蛋白在早期的大鼠睾丸(5日龄、10日龄、15日龄) 中有着很强的表达，而在20日龄以后的大鼠睾丸中大鼠基因的表达量明显下降 (图1B)。
综上所述，Northern和Western杂交同时表明大鼠基因在大鼠睾丸中具 有阶段性表达的特性。这说明大鼠基因与大鼠的睾丸发育具有一定的相关性。 实施例5
大鼠基因蛋白在大鼠睾丸中的表达细胞种类分析
1. 组织1日龄、5日龄、成年睾丸
2. 石蜡包埋各睾丸组织的石蜡包埋方法参考《精编分子生物学基本实验
10指南》有关组织的石蜡包埋的章节(奥斯伯等主编，2005)。然后对各不同时期 的睾丸进行包埋块进行切片。
3.原位杂交原位杂交的基本方法参照《精编分子生物学基本实验指南》 相关原位杂交实验的章节(奥斯伯等主编，2005)。
1) 探针的制备采用Ambion公司提供的T7RNA或T3RNA pn1 m八vnn八—ni.,nTM:;+玄ii会 1、1*琉伤|| /i出-旦^il66丰";大哉/feb力未苣未)5
制备RNA探针探针。然后参照Roche公司提供的DIG RNA labeling Kit的说明书标记该核酸探针。
2) 原位杂交的最后显色采用Roche公司提供的DIG Nucleic Acid Detection Kit,并参照其说明对结果进行显色。
原位杂交的结果表明大鼠基因主要在睾丸的生殖细胞中进行表达(如图2所 示)。本发明涉及的序列及记号分列如下 (1 ) SEQ ID NO. 1的信息
(i) 序列特征-
(A) 长度20bp
(B) 类型核苷酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子烈性寡核苷酸
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 1 CAGGGGAATCCGACTGTTTA
(2) SEQ ID NO. 2的信息
(i) 序列特征
(A) 长度20bp
(B) 类型核苷酸
(C) 链型单链
(D) 拓扑结构线性
(ii) 分子烈性寡核苷酸
(iii) 序列描述SEQ ID NO. 2 TCCGTAGGTAGGGACAGTGG
(3) SEQ ID NO. 3的信息 〈110〉上海交通大学
〈120〉大鼠基因序列
〈160〉 2
〈210〉 1
〈211〉 1705
〈212〉画
〈213〉大鼠(Rattus norvegicus) <400> 1
ctggtgcgga ccaggggaat ccgactgttt aattaaaaca aagcatcgcg aaggcccgcg 60 gcgggtgttg acgcgatgtg atttctgccc agtgctctga atgtcaaagt gaagaaattc 120
12<formula>formula see original document page 13</formula>
权利要求
1、一种与大鼠精子发生相关的基因序列，其特征在于，所分离出或纯化的与大鼠精子发生相关基因编码的核苷酸序列及其蛋白分子序列，所述的核苷酸序列，是指包括在已经分离出或纯化的与大鼠基因具有高度同源性的核苷酸序列的DNA分子，该分子与SEQ ID NO.3中的从第459-1214位的核苷酸序列至少有70％的同源性。
2、 如权利要求l所述的与大鼠精子发生相关的基因序列，其特征是，所述 的基因，其mRNA全长为1705bp，其开放阅读框的启示密码子始于第459位核苷 酸，终于第1214位核苷酸，编码一条含252个氨基酸的多肽。
3、 如权利要求l所述的与大鼠精子发生相关的基因序列，其特征是，所述 的核苷酸序列，对于用作探针的核苷酸分子，该分子具有SEQ ID NO. 3核苷酸序 列中所示的第459-1214位核苷酸序列中10-600个连续核苷酸。
4、 如权利要求l所述的与大鼠精子发生相关的基因序列，其特征是，所述 的基因编码，具有SEQ ID N0.3所示的氨基酸序列的蛋白或多肽、其变异形式、 活性片段，或活性衍生物。
5、 如权利要求3所述的与大鼠精子发生相关的基因序列，其特征是，所述 的蛋白或多肽，是指分离出的或纯化的与大鼠基因蛋白具有高度同源性的蛋白或多肽，该多肽为具有SEQ ID N0.3中的氨基酸序列的多肽。
6、 如权利要求4或者5所述的与大鼠精子发生相关的基因序列，其特征是，所述的蛋白或多肽，利用该蛋白或多肽获得的抗血清。
全文摘要
一种基因工程技术领域的与大鼠精子发生相关的基因序列。本发明所分离出或纯化的与大鼠精子发生相关基因编码的核苷酸序列及其蛋白分子序列，所述的核苷酸序列，是指包括在已经分离出或纯化的与大鼠基因具有高度同源性的核苷酸序列的DNA分子，该分子与SEQ ID NO.3中的从第459-1214位的核苷酸序列至少有70％的同源性。本发明涉及的基因对于我们研究精子发生的分子机制以及与之相关的疾病具有重要的作用，同时也对于我们了解男性生殖、开发男性避孕药以及如何提高畜牧业中雄性繁殖能力提供了新的信息。
文档编号C12N15/12GK101475937SQ200810203440
公开日2009年7月8日 申请日期2008年11月27日 优先权日2008年11月27日
发明者际 吴, 杨兆娟 申请人:上海交通大学