专利名称：：一种甘蓝型油菜抗冻cbf转录因子基因的制作方法
技术领域：
：本发明涉及作物遗传育种领域，更具体地说涉及一种来源于甘蓝型油菜抗冻相关的基因序列。
背景技术：
：植物在其整个生活周期中，周围的环境(气候、土壤、水分营养供应、病虫害等因素)是经常变化的，适宜的环境条件能保证或促进植物正常的生长发育，而不适宜的或恶劣的环境条件则会抑制植物的生长甚至使植物死亡。干旱、低温和高盐是目前影响农作物的主要非生物限制因子(Bray，TrendsPlantSci，1997，2:48-54)，它们对作物的危害通常表现为植物体内的水分平衡的变化，又称水分胁迫或渗透胁迫。这些限制因子严重影响了作物的生长、产量和种植区域。分子生物学与现代生物技术的发展，使人们从分子水平上深入认识植物与非生物逆境之间的关系成为现实，并且为改良作物的抗非生物逆境性能开拓了新的途径。目前，植物与非生物逆境之间的关系在分子细胞水平上已有较深入的研究。理解植物对非生物逆境的响应及相关信号在植物体内的传导途径，克隆抗逆相关基因对培育抗逆性能提高的植物具有重要的指导意义。油菜(Brassican即us)是全世界广泛种植的一种重要油料作物，是我国具有传统优势的重要油料作物，也是我国第五大作物。我国油菜面积700-750万公顷，占世界油菜播种面积的26%左右，油菜籽总产约占世界油菜籽总产的28%。长江流域冬油菜区是我国油菜的重要产区，常年该区油菜面积9000万亩左右、总产1100万吨，占全国油菜总面积和总产的87%和90%，占世界油菜面积和总产的四分之一强，高于欧洲和加拿大(王汉中，中国油料作物学报，2004，26(3):98-101)。大力发展油菜和其他油料植物种植及提高产量以缓解依赖进口解决植物油短缺，不但具有食品安全的长远意义，而且关系到我国种植业结构的调整、优化和近1亿农民的增收。因此进一步改良和加强油菜基础理论和生产实践研究具有重大的意义(王汉中，中国油料作物学报，2007，29(1):101-105)。转录因子(Transcriptionfactor,TF)又称反式作用因子，是和专一性DNA序列结合并能激活或抑制其他功能基因转录的蛋白质分子。典型的转录因子一般由DNA结合域(DNA-bindingdomain)、转录调控域(Transcriptionregulationdomain)、寡聚化位点(Oligomerizationsite)禾口核定位信号(Nuclearlocalizationsignal,NLS)4个功能域组成，转录因子通过这些功能区域与启动子顺式元件(cis-actingelement)或其他转录因子的功能区域相互作用，激活或抑制基因的转录(刘强等，科学通报，2000，45:1465-1474)。CBF(C-r印eatbindingfactor)类转录因子(又称DREB/DehydrationResponsiveElementBindingProtein)，是近年来植物抗逆境研究中的热点，受到广泛关注。通过与CRT(C-r印eat)/DRE(DehydrationResponsiveElement)顺式元件的特异结合，能够调节植物体内多个基因协同表达，提高植物的抗逆能力(Yamaguchi和Shinozaki，PlantCell,1994，6:251-264;王少峡等，植物生理学通讯，2004，40:7-13)。CBF类转录因子在耐受非生物胁迫中起作用，CBF基因和CRT顺式元件结合，能够激活与低温、干旱、高盐相关的下游基因的转录(Stockinger等，ProcNatlAcadSci，USA1997,94:1035-1040)。CBF类转录因子的转基因植株中CBF的过量表达导致受胁迫诱导基因的强烈表达，从而增强转基因植株对干旱、低温、高盐耐受性(Jaglo等，Science,1998，280:104-106;Kasuga等，NatBiotechnol，1999，17:287291;Ito等，PlantCellPhysiol,2006，47:141-153;Qin等，MolBreeding，2007，19:329-340)。
发明内容本发明的目的是提供一种甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因。所说的一种甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因，是BnaCBF-2-Hyl5，它具有SEQIDNO.1的序列。上述的转录因子基因编码的蛋白质，它具有SEQIDNO.2的氨基酸序列。上述的转录因子基因BnaCBF-2-Hyl5能用于植物转化，在制备抗冻的转基因植物中的应用。上述所说的甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因BnaCBF-2-Hyl5，是通过以下方法得到1.油菜cDNA文库的构建本发明将油菜种子经1%(v/v)Na0Cl消毒后种植在黑土珍珠岩蛭石(i:i:i)混合基质中，22t:、i6h光照培养生长20d。选生长健壮的幼苗提取总rna。以总RNA为模板，Oligo(dT)为引物，参照东洋纺(上海)生物科技有限公司cDNA合成试剂盒说明(http:〃www.bio-toyobo.ch/)，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA。2.引物的设计与合成本发明设计一对引物，引物两端分别引入BamHI和SacI的酶切位点。BnaCBF-2-Hy15F:5'GGATCCATGACCTCATTTTCTGCCTTCTC-3';BnaCBF-2-Hyl5R:5'-GAGCTCTCAGAATTCATAACTCCAAAGGGACAC-3'。引物由上海生工生物工程技术有限公司合成(http://www.sangon.com/)。2.PCR的方法获得甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hy15基因片段本发明PCR扩增采用大连宝生物工程有限公司(http:〃takara.com.cn/)的PCR试剂在50iiL的体系中进行PCR反应，反应参数为94t:变性30s，55t:退火30s，72。C延伸lmin，共扩增30个循环，再72t:延伸10min。经过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约650bp的片段。3.克隆鉴定与序列测定扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司(www.axygen.com.cn/)DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司(http:〃takara.com.cn/)的pMD-18-SimpleT载体上进行克隆鉴定和序列测定。4.序列分析本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hy15基因，具有如下的碱基和氨基酸序列信息。碱基序列1TCCTGCATTA61GGGTCGGAAG121CTCAGGTAAG181TACTTTCCTA241TGGCAAATCC301AACATGCCCC361GATAAATGAT421TTTTACGGAG481GCCGTCCTTG541CGAACATAAC6011RGVRQRHSGK61RLRIPETTCP121EESMFGMPSL181ATGACCTCATTTTCTGCCTTCTCTGAAATGATGGGCTCCGAGAACGAGTCAGCGGGGAGTATTGTCCGACGCTGGCCGCGAGCTGTCCGAAGAAACCTGCAAGTTTCGGGAGACGCGTCACCCAATTTACAGAGGAGTTCGTCAGAGACATGGGTGTGCGAGGTGAGAGAGCCAAACAAGAAATCCAGGATTTGGCTCGGACCGCCGAGATCGCAGCTCGTGCTCACGGCGTCGCCGCCATAGCCCTCCGGCCTGCCTCAATTTCGCCGACTCGGCTTGGCGGCTCCGTATCCCGGAGACAAGGATATCCAGAAGGCGGCTGCTGAAGCCGCGGTGGCTTTTCAGGCTGAACGACGACGGATCATGGCCTGGACGTGGAGGAGACGATCGTGGAGGCTATGAAAACAACGATGGGTTTTATATGGACGAGGAGGAGTCCATGTTCGGGATTTGGCTAGCATGGCGGAAGGGATGCTTTTGCCGCCACCGTCGGTACGATTTATGACTTTGACGGAGATGCCGACGTGTCCCTTTGGAGTTATTAAMTSFSAFSEMMGSENESPALSGEYCPTLAASCPKKPAGRKKFRETRHPIYWVCEVREPNKKSRIWLGTFLTAEIAARAHGVAAIALRGKSACLNFADSAWKDI區AAAEAAVAFQAEINDTTTD亂DVEETIVEAIFTEE誦GFYMDELASMAEGMLLPpPSVRFEHNYDFDGDADVSLWSY*本发明所述的转录因子基因BnaCBF-2-Hyl5能用于植物转化，在培育提高植物抗冻性中的应用。本发明实现的有益效果本发明克隆了甘蓝型油菜BnaCBF-2-Hyl5转录因子基因，为了进一步分析该基因在低温逆境中的作用与功能，我们比较了转BnaCBF-2-Hyl5基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株对低温胁迫的耐受性。结果表明，野生型和转BnaCBF-2-Hyl5基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥有明显的抗冻能力，这也表明BnaCBF-2-Hy15的转入提高了拟南芥植株的抗低温的能力。图1.琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果。图2.琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。图3.琼脂糖凝胶电泳检测双酶切鉴定结果。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括双低甘蓝型油菜沪油15(BrassicanapusL.Huyoul5)的种子经过1%(v/v)Naoci消毒后种植在黑土珍珠岩蛭石(i:i:i)的基质中，22r，光照培养(ieh光照，8h黑暗，冷光源)生长20天。大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存。克隆载体pMD-18-SimpleT、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10XPCRbuffer和DNAmarker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。ABIPRIAMBig-DyeTerminatorDNA测序试剂盒购自美国应用系统公司。下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行(SambrookJ，FretsEF，Ma皿sdesTetal.In:MolecularCloning.2nded.ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)。实施例1:双低甘蓝型油菜沪油15幼苗RNA的抽提和cDNA合成(—)试验方法1、RNA的抽提加入100mL提取缓冲液(油菜RNA提取缓冲液配方CTAB3%(W/V);PVP3%(W/V)(Mw4000);EDTA25mM;NaCl2.0M;Tris-HC1100mM，pH8.0;Spermidine0.5g/L;DEPC0.1%(V/V);0.1%DEPC处理的SDS0.5%(W/V);0.1%DEPC处理的LiCl10M)到50mL聚丙烯管，65t:预热；称取5g植物材料倒入液氮使材料始终保持冻结和易碎的状态，研磨；研磨后细粉转移至预先加入65t:预热的提取缓冲液的50mL离心管；将离心管放入65t:水浴45min，并偶尔摇动以混合各成分；加入等体积氯仿_异戊醇混合液，轻柔地上下颠倒混合约10min;在18°C，于12000g离心lOmin;吸取上清液，重复5，6步骤操作；吸取上清液，加入1/4体积的10MLiCl溶液，彻底混匀，4。C放置12h;在4°C，12000g离心30min;RNA沉淀用500iiL0.5%SDS轻柔溶解，用氯仿_异戊醇混合液抽提，4°C，12000g离心30min;上清液转移至另一新的管子，加入2倍体积-2(TC冰冷的无水乙醇，充分混合，放置在_201:条件下2h，沉淀总RNA;12000g，4t:离心30min，用75%乙醇漂洗两次，保留RNA，真空风干；用200iiLDEPC处理的去离子水重新溶解，取少量用于RNA质量和浓度的检测，其6余储存于-7(TC，备用。2cDNA合成加入01igo(dT)20(10pmol/iiL)1ii1;总RNA:10lOOng;补足RNaseFreeH20至lJ12iiL。65t:，5min后，立即置于冰上。再力口入5XRTBuffer4iiL;d證Mixture(各10mM)2iiL;RNaselnhibitor(10U/")1";反转录酶1"。反转录反应过程为30。C10min;42。C20min;85。C5min;4。C5min。瞬间离心，保存。(二)试验结果采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA产物的结果见图1，图中可见明显的RNA条带。实施例2:PCR的方法获得甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hy15基因片段(—)试验方法本发明设计一对引物(BnaCBF-2-Hyl5F和BnaCBF-2-Hyl5R)，为了克隆鉴定等构建的需要，引物两端分别引入BamHI和Sacl的酶切位点。PCR反应体系10XPCRbuffer5.0iiL;dNTPs(各2.5mM)4iiL;双低甘蓝型油菜沪油15的cDNA模板1iiL(20ng);引物BnaCBF-2-Hyl5R0.5iiL;弓|物BnaCBF-2-Hyl5F0.5iiL;Ex-Taq0.4iiL(预变性后加入)；加无菌水定容至50iiL。PCR反应程序94"变性30s，55。C退火30s，72。C延伸lmin，共扩增30个循环，再72。C延伸10min。(二)试验结果经过1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物为一条约650bp的片段(见图2)。实施例3:克隆鉴定、序列测定(—)试验方法扩增片段采用杭州维特洁生化技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收后克隆到大连宝生物工程有限公司的pMD-18-SimpleT载体上进行克隆鉴定和序列测定。本发明通过核苷酸序列测定分析，最终获得甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hy15基因，它具有如下的SEQIDNo1碱基和SEQIDNo2氨基酸序列信息。(二)试验结果经过BamHI和SacI的双酶切鉴定，得到含有甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hyl5基因插入的克隆(图3)。测序分析结果显示甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hy15基因编码阅读框由645bp组成，编码一个214个氨基酸的蛋白质。实施例4:拟南芥转化(—)试验方法1农杆菌的准备1)挑取农杆菌单菌接种于5mLLB液体培养基(利福平50yg/mL，氯霉素100yg/mL)中，28。C，250转/分钟培养20h。2)取lmL菌液转接入20_30mLLB液体培养基(利福平50yg/mL，氯霉素100yg/mL)中，28。C，250转/分钟培养约12h，测OD600"1.5。3)8000转/分钟，4t:，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液(5%蔗糖，0.05%SilwetL-77)并稀释至0D600"0.8。2拟南芥蘸花法转化1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约lOs后取出，全部转化完毕后，托盘中加入水，用保鲜膜罩住拟南芥，以保持湿润环境，水平放置22t:避光培养，24h去掉保鲜膜直立培养。2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以对花序上发育的不同时期的花蕾进行转化，提高转化效率。3)生长约两个月后，收集种子，4t:冰箱贮存待用。(二)试验结果经过蘸花法转化的拟南芥生长约两个月后，正常开花结子。实施例5:拟南芥种子的筛选(—)试验方法1)称25-30mg种子放入1.5mL离心管。2)lmL75%乙醇消毒lmin(不停摇晃振荡)，8000转/分钟离心5s，去上清。3)加入lmL过滤后的漂白粉(5%)消毒15min(不停摇晃振荡，充分消毒)，8000转/分钟离心5s，去上清。4)无菌水洗涤3-4次。5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板(潮霉素50iig/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰箱放置两天，22°C，16h光照培养6天。6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株(T。)培养至开花结实，收集T。植株上所结L种子。实施例6:转录因子基因BnaCBF-2-Hy15转化植物后的抗冻分析将转基因拟南芥自交纯合2代，获得3个纯合转化株系，收取种子。播种后，幼苗生长10-20天，转入fC低温驯化24小时，然后转入-2(TC处理30分钟，然后再移置到正常温度，观察植物的耐冷效果。(二)试验结果结果表明，野生型和转BnaCBF-2-Hyl5基因拟南芥植株在存活率上有明显的差异，转基因植株比野生型拟南芥抗冻能力有明显提高。经过抗冻处理的转基因与野生型拟南芥的存活率如表l所示。表1转基因与野生型拟南芥的抗冻后存活率编号存活率(％)对照22.4转BnaCBF-2-Hy15基因株系168.2转BnaCBF-2-Hy15基因株系264.28<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表〈110〉上海市农业科学院〈120〉一种甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因〈130>0811541〈160>2〈170〉Patentlnversion3.3〈210>SEQIDNo1〈211>645〈212>DNA〈213〉甘蓝型油菜(Brassican即us)1TCCTGCATTA61GGGTCGGAAG121CTCAGGTAAG181TACTTTCCTA241TGGCAAATCC301AACATGCCCC361GATAAATGAT421TTTTACGGAG481GCCGTCCTTG541CGAACATAAC601ATGACCTCATTTTCTGCCTTCTCTGAAATGATGGGCTCCGAGAACGAGTCAGCGGGGAGTATTGTCCGACGCTGGCCGCGAGCTGTCCGAAGAAACCTGCAAGTTTCGGGAGACGCGTCACCCAATTTACAGAGGAGTTCGTCAGAGACATGGGTGTGCGAGGTGAGAGAGCCAAACAAGAAATCCAGGATTTGGCTCGGACCGCCGAGATCGCAGCTCGTGCTCACGGCGTCGCCGCCATAGCCCTCCGGCCTGCCTCAATTTCGCCGACTCGGCTTGGCGGCTCCGTATCCCGGAGACAAGGATATCCAGAAGGCGGCTGCTGAAGCCGCGGTGGCTTTTCAGGCTGAACGACGACGGATCATGGCCTGGACGTGGAGGAGACGATCGTGGAGGCTATGAAAACAACGATGGGTTTTATATGGACGAGGAGGAGTCCATGTTCGGGATTTGGCTAGCATGGCGGAAGGGATGCTTTTGCCGCCACCGTCGGTACGATTTATGACTTTGACGGAGATGCCGACGTGTCCCTTTGGAGTTATTAA〈210>SEQIDNo2〈211>214〈212>PRT〈213〉甘蓝型油菜(Brassica卿us)0136]MetThrSerPheSerAlaPheSerGluMetMetGlySerGluAsnGlu0137]1510150138]SerProAlaLeuSerGlyGluTyrCysProThrLeuAlaAlaSerCys0139]2025300140]ProLysLysProAlaGlyArgLysLysPheArgGluThrArgHisPro0141]3540450142]lieTyrArgGlyValArgGinArgHisSerGlyLysTrpValCysGlu0143]5055600144]ValArgGluProAsnLysLysSerArglieTrpLeuGlyThrPheLeu0145]657075800146]ThrAlaGlulieAlaAlaArgAlaHisGlyValAlaAlalieAlaLeu0147]8590950148]ArgGlyLysSerAlaCysLeuAsnPheAlaAspSerAlaTrpArgLeu0149]1001051100150]ArglieProGluThrThrCysProLysAsplieGinLysAlaAlaAla0151]1151201250152]GluAlaAlaValAlaPheGinAlaGlulieAsnAspThrThrThrAsp0153]1301351400154]HisGlyLeuAspValGluGluThrlieValGluAlaliePheThrGlu0155]1451501551600156]GluAsnAsnAspGlyPheTyrMetAspGluGluGluSerMetPheGly0157]1651701750158]MetProSerLeuLeuAlaSerMetAlaGluGlyMetLeuLeuProPro0159]1801851900160]ProSerValArgPheGluHisAsnTyrAspPheAspGlyAspAlaAsp0161]1952002050162]ValSerLeuTrpSerTyr0163]210权利要求一种甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因，其碱基序列如SEQIDNo1。2.权利要求1所述的甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNo2。3.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因的制备方法，包括如下步骤1)油菜cDNA文库的构建选取油菜幼苗提取总RNA，以总RNA为模板、01igo(dT)为引物，在AMV反转录酶的作用下合成cDNA;2)设计一对引物BnaCBF-2-Hyl5F:5'-GGATCCATGACCTCATTTTCTGCCTTCTC-3'和BnaCBF-2-Hy15R:5，-GAGCTCTCAGAATTCATAACTCCAAAGGGACAC-3，，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hyl5基因片段；3)上述扩增片段回收后克隆入T载体，测序后获得油菜抗冻CBF转录因子BnaCBF-2-Hyl5基因。4.如权利要求1所述的转录因子基因，在制备抗冻的转基因植物中的应用。全文摘要本发明提供了一种甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子基因及其制备方法和用途。所述的油菜抗冻CBF转录因子基因是BnaCBF-2-Hy15，其碱基序列如SEQIDNo1。本发明利用聚合酶扩增技术从油菜幼苗中克隆甘蓝型油菜抗冻CBF转录因子的基因序列，所获得的CBF转录因子基因能用于植物转化，培育提高植物抗冻性。文档编号C12N15/10GK101736011SQ200810203369公开日2010年6月16日申请日期2008年11月25日优先权日2008年11月25日发明者付晓燕,姚泉洪,庄静,彭日荷,朱波,李贤,熊爱生,田永生,薛永,赵伟,金晓芬,高峰申请人:上海市农业科学院