专利名称：：一种ev-71病毒毒种、人用灭活疫苗及其制备方法
技术领域：
：本发明属于人类^防医学的
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及病毒毒种及其制备方法。同时，本发明还涉及用所述毒种制成的人用灭活疫苗及其制备方法。
背景技术：
：EV-71(肠道病毒71型)感染是手足口病的主要形式之一。EV-71属于肠道病毒家族，为小RNA病毒，具有典型的二十面体结构，无包膜，通常通过肠道排泄物—口传播，在一定情况下，也可经呼吸道传播。该病毒所导致的感染通常表现为手足口出现特征性的疱疹，并伴有一定程度的发热感冒症状。重症时可以引起神经系统、呼吸系统的病变，在发病人群中具有一定的死亡率。目前，已知该病在全世界范围内存在。上世纪90年代以前，在发达国家由于公共卫生条件的改善，该病毒感染已几乎绝迹。但90年代以后，该病毒在全球各地区的发病率渐有上升。同时，由于该病毒的高传播率和其感染的重症病人可出现严重的神经系统及呼吸系统症状，因而它同时受到了.作为生物恐怖因子的相应关注。在上世纪90年代后期和二十一世纪初始，该病毒感染在我国台湾地区和英国曾出现大范围的流行，并导致了一定的感染死亡率，从而受到了人们的进一步关注。2008年，我国安徽省阜阳地区亦出现了较大规模的流行，而且感染者主要出现在婴幼儿，因此引起了社会各界的严重关切。对此，我国卫生部自2008年5月起，将该疾病正式列入法定报告的传染病种类之中。根据现有分子流行病学的分析表明，EV-71病毒共有7个血清型(A、0、C、Asial、SouthAfricanTerritories1、2、3)，每个血清型中又有多个亚型，但在免疫原性方面，各血清型均有较大程度的交叉。现有的资料表明，在我国多数地区的优势血清型为C型，优势流行亚型为C4亚型。但迄今为止，尽管该病毒感染在我国各地区均已引起较多的发病，但仍无有效的特异性疫苗应用。因此，在强调提高我国人口健康质量的前提下，EV-71疫苗的研究显得更为迫切与重要。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种安全有效的人用EV-71灭活疫苗及其制备方法。同时，本发明还提供所述疫苗的毒种及其制备方法。本发明技术方案的提出是基于下述思路EV-71作为肠道病毒成员，其疫苗的研制具有多种类似的例子可循，主要的疫苗可能形式包括有减毒活疫苗以及灭活疫苗，但前者存在着回复突变、毒力返祖，以及其它尚未知晓的疫苗相关疾病可能性。因此，作为一种具有安全性和应急意义的疫苗，灭活疫苗具有相对的优势。但其要求该疫苗毒株具有较强的免疫原性和较好的生长复制能力。同时，#为新型的预防性疫苗，使用合适的细胞基质可提升该疫苗的质量品质。目前已广泛使用于灭活疫苗生产制备的传代细胞基质主要包括两类一是来自非洲绿猴肾的Vero细胞，二是来自人胚肺的二倍体成纤维细胞。前者对病毒疫苗具有较快的生产增殖能力，但因属于异源物种细胞，因此在疫苗的纯化制备方面具有较高的质量要求。后者尽管在病毒疫苗的生长复制支持能力方面相对较Vero细胞稍差，但其作为来源于人的细胞，具有更好的安全性。在上述前提下，本发明所描述的EV-71为来源于EV-71感染重症病人的分离株，具有较强的组织培养生长能力，同时在动物体内表现了较好的免疫原性。而且，已适应生长于人源二倍体细胞株，在保证具有较高安全性的同时，亦具有较好的增殖复制能力。本发明的目的通过以下技术方案予以实现。A.本发明提供了一种EV-71灭活疫苗的毒种，该毒种的分类命名为肠道病毒71型，保藏编号为CGMCCNq.2701。其包括原始种子、主种子和工作种子三个库；具有序列表所示的结构和下述特征1.该毒种经混悬吸附方法接种KMB-17细胞后3-4天即可出现典型细胞病变现象；2.该毒种在KMB-17细胞上的生长动力曲线表明，当该病毒以混悬形式接种于KMB-17细胞时，在八小时内接种细胞即可出现初步的典型病变，同时，该病变可在24-48小时内出现高峰，对此时的病毒收获液进行滴度检测表明,其滴度通常为7.5±0.3LogCCID5。;3.该毒种按原倍及1:IO稀释度，以0.25ml/只乳鼠的剂量接种3-4日龄乳鼠时，可引起乳鼠在3-5天内出现典型的四肢迟缓型麻痹症状，但此致麻痹作用可由该毒种免疫动物(小鼠或其它实验动物)后所得到的特异性抗血清中和后消除；4.该毒种以1:IO稀释度按O.5ml/只剂量免疫恒河猴一次后，可诱导动物产生特异性中和抗体。通常该抗体可以在1:256~1:1280的稀释度范围内中和1000CCID5。的EV-71病毒在敏感细胞上的感染(包括Vero细胞、KMB-17细胞、RD细胞)。5.该毒种经1:4000的甲醛灭活后，不再具有感染性，但能够保留其免疫原性。当其以100jug/ml抗原蛋白量皮下一次接种小鼠后，可引起小鼠出现滴度可能为64-128的特异性中和抗体，二次接种后可引起小鼠出现滴度可能为1024~2048的特异性中和抗体反应。B.本发明提供了所述毒种的制备方法，该方法釆用下述顺序的步骤1.分离于手足口病重症病人的EV-71病毒株，以下呼吸道分泌液方式以棉拭子取得，经无菌过滤后，以混悬吸附方式接种于Vero细胞，在3~4天发生病变后，继续以Vero细胞传代2代，同时以RT-PCR方法获得病毒全基因组序列，将其翻译为蛋白质的氨基酸序列；2.该病毒株接种人二倍体细胞株KMB-17，出现细胞病变后收获病毒，并继续在KMB-17单层细胞上进行两次蚀斑克隆纯化过程，最终挑选蚀斑克隆FY-23该克隆在KMB-17细胞中生长4代后作为原始种子(P-7)，随后继续以混悬吸附方式在KMB-17细胞中传代生长3代后作为主种子(P-10),随后继续同法生长至P-15作为工作种子；3.对原始种子、主种子、工作种子三个代次的毒种分别进行了鉴别实验、滴度测定、无菌检定、支原体检定、免疫原性检定等，证明其具有良好的免疫原性及在KMB-17细胞上的良好繁殖能力，最终形成了EV-71的三级毒种库。C.本发明提供了一种人用EV-71灭活疫苗，该疫苗由下列成分组成EV-71灭活纯化抗原lOOliig/ml氢氧化铝0.8~lmg/ml硫柳汞0.05~0.lmg/mlD.本发明提供了所述灭活疫苗的制备方法，该方法釆用下列步骤1.根据KMB-17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB-17细胞，弃去培养液，以0.1%胰酶消化细胞后，弃去胰酶液，以原培养液体积的4%体积，DMEM悬浮细胞；2.在上述细胞悬液中加入本发明的第15代的EV-71病毒液，接种量moi0.02-0.05。混匀后置于37'C，适时轻轻摇动。30min后，将该混悬液转至培养瓶中，加入定量细胞生长培养液，置37。C3-4天，待细胞贴壁并完全病变后，收集收获液；3.病毒收获液按1:4000比例加入甲醛37°C3天灭活病毒，再经透析浓缩至原体积的5%，上样于Sepharose4FF柱层析纯化，收集纯化后的病毒颗粒峰，电泳及HPLC确定病毒颗粒纯度高于95%，釆用Lowry法测定蛋白浓度，配比稀释调整浓度为lmg/ml;4.将上述灭活病毒原液过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至100ug/ml，同时加入A1(0H)3至终浓度为0.1%，硫柳汞为0.01%，该产品即为所需的EV-71灭活疫苗成品。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.提供了一种可用于制备人EV-71灭活疫苗的疫苗毒种，该毒种至今尚无同类品问世，而且，该毒种具有有效的免疫原性和在细胞上较好的生长复制能力。2.提供了一种使用KMB-17人二倍体细胞基质制备的人EV-17灭活疫苗的生产制备方法，该疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。3.提供了一种混悬吸附技术方法，以保证EV-71疫苗毒种在KMB-17细胞上的有效感染及在该基质上的良好生长。保藏生物材料的说明本发明所涉及的毒种，已2008年10月13曰在位于中国北京巿朝阳区大屯路的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，分类命名为肠道病毒71型，保藏编号为保藏编号为CGMCC:Nb.2701。图1为该毒种经悬浮吸附方法接种KMB-17细胞后3-4天即可出现典型细胞病变现象(表现为细胞变圆、折光性增强、肿胀等)；图2为该毒种在KMB-17细胞上的生长动力曲线。于病毒接种KMB-17细胞后的不同时间点取样进行感染性滴度检测，结果表明接种细胞八小时内即可出现初步的典型病变，同时，该病变可在24-48小时内出现高峰，其滴度通常为7.5±0.3LogCCID5。/ml;图3为原始种子、主种子、工作种子三个代次的毒种免疫小鼠后经中和抗体效价检测证明均具有良好的免疫原性；图4为疫苗半成品加入A1(0H)3至0.lmg/ml经混合后，皮下注射小鼠两次(O、l月)，可在动物体内产生高于1024效价的抗EV-71中和抗体，与此同时，佐剂对照组并不能引发相应的抗体产生。具体实施方式通过借助以下实施例将更加详细地说明本发明。需要指出的是，以下实施例仅仅是说明性的，本发明的保护范围并不受这些实施例的限制。实施例1一一EV-71灭活疫苗毒种FY-23的病毒的收集及鉴定从手足口重症病人呼吸道用棉拭子所取的分泌物，经接种于Vero细胞出现细胞病变后继续在同样细胞中传代两次，再行转种KMB-17细胞生长至第7代时，首先取病毒液lml，按常规方法进行RT-PCR,分段获取病毒基因的cDNA序列，并按常规方法连接该片段进入puc-18载体中，进行常规的核苷酸测序分析，并以此序列在同类基因库中进行比对确证其结果。其次，利用抗EV-71特异性血清，按l:4稀释后，与该病毒IO倍稀释液等量混合，37匸放置1小时，再接种Vero细胞或KMB17细胞，37匸培养一周后观察病变结果，与无特异血清对照相较，抗体中和应完全抑制细胞出现病变。以该毒种原倍或1:IO稀释后，样品0.25ml/只注射入3-4日龄乳鼠脑内，经3-5天后，乳鼠应出现四肢瘫痪，并逐渐死亡；而用抗EV-71特异性血清中和该病毒后，可以去除此毒种致乳鼠麻痹的能力。以该毒种的第7、第10或是第15代中任何一个代次以IO倍稀释的0.5ml接种小鼠腹腔，均能在一个月后诱导动物产生特异性的抗EV-71中和抗体，其中和效价可在64-128之间。实施例2用EV-71疫苗毒种第15代工作种子混悬吸附方法接种KMB-17细胞株，37'C培养生长5天，待细胞完全病变后，收获病毒液，经甲醛灭活、透析浓縮、柱层析纯化、含量测定、相关稀释配比，加入氢氧化铝吸附制备的疫苗，由下列成分组成EV-71灭活纯化抗原100ng/ml、氢氧化铝0.8~lmg/ml、硫柳汞0.05-0.lng/ml。—一EV-71灭活疫苗制备过程中的混悬吸附方法取生长致密的单层KMB-17细胞，经O.1%胰酶消化后，去除消化液，以原培养液体积的5%悬浮细胞，加入0.2-0.5ml病毒液，其moi为0.05，混勾后置37'C孵育30分钟，并于其中加以轻摇，随后将该混悬液体转入培养瓶中，加入适量生长培养液，37'C培养至细胞贴壁后并出现完全病变收获。实施例4一一EV-71灭活疫苗制备过程的分步检测病毒收获物、病毒原液、半成品均为无异物、无沉淀的澄清液体，无菌检测、支原体检测均应为阴性，无异常毒素，PH7.2-8.0(见表-1)。表-l:病毒收获物、病毒原液、半成品的检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>病毒收获液进行滴度检定时，其滴度应在7.0-7.51ogCCID50/ml。疫苗半成品加入A1(0H)3至0.lmg/ml经混合后，皮下注射小鼠两次(O、l月)，可在动物体内产生高于1024效价的抗EV-71中和抗体，与此同时，佐剂对照组并不能引发相应的抗体产生(见图-4)。实施例5—一EV-71灭活疫苗成品的安全性检测疫苗成品按O.5ml/只量注射体重为18-20g小鼠腹腔，共20只，一月内应无死亡，小鼠体重增加应同于正常生理盐水对照组(见表-2)。表-2:疫苗成品安全性检测结果<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>疫苗成品甲醛含量应不高于50jLig/剂，细菌内毒素不高于100EU/剂。应在无菌检测中为阴性(见表-3)。表-3:疫苗成品检测结果'<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>11序列表SEQUENCELISTING<110>医学生物学研究所<120>EV71病毒毒种FY-23株VPl基因序列<130>1<140>20081010<141>2008-10-10<160>1<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>891<212>DNA<213>Enterovirus71<400>1cagggagatagggtggcagatgtaattgaaagttccataggagatagcgtgagcagagcc60ctcactcacgctctaccagcacccacaggccagaacacacaggtgagcagccatcgactg120gatacaggcaaggttccagcactccaagctgctgaaattggagcatcatcaaatgctagt180gacgagagcatgattgagacacgctgtgttcttaactcgcacagtacagctgagaccact240cttgatagtttcttcagcagggcgggattagttggagagatagatctccctcttgagggc300acaactaacccaaatggttatgccaactgggacatagatataacaggttacgcgcaaatg360cgtagaaaggtagagctattcacctacatgcgctttgatgcagagttcacttttgttgcg420tgcacacccaccggggaagtcgtcccacaattgctccaatatatgtttgtgccacctgga480gcccctaagccagattctagggaatcccttgcatggcaaaccgccactaacccctcagtt540tttgtcaagctgtcagaccctccagcgcaggtttcagtgccattcatgtcacctgcgagt600gcttatcaatggttttatgacggatatcccacattcggagaacacaaacaggagaaagat660cttgaatacggggcatgttctaataacatgatgggcacgttctcagtgcggactgtgggg720acctccaagtccaagtaccctttagtggttaggatttacatgagaatgaagcacgtcagg780gcgtggatacctcgcccgatgcgtaaccagaactacctattcaaagccaacccaaattac840gctggcaactccattaaaccaactggtgccagtcgcacagcgatcaccact89权利要求1.一种EV-71灭活疫苗的毒种，其特征在于该毒种的分类命名为肠道病毒71型，保藏编号为CGMCC№.2701。2.—种权利要求1所述毒种的制备方法，其特征在于釆用以下步骤-.(1)分离于手足口病重症病人的EV-71病毒株，以下呼吸道分泌液方式以棉拭子取得，经无菌过滤后，以混悬吸附方式接种于Vero细胞，在3~4天发生病变后，继续以Vero细胞传代2代，同时以RT-PCR方法获得病毒全基因组序列，将其翻译为蛋白质的氨基酸序列；(2)该病毒株接种人二倍体细胞株KMB-17，出现细胞病变后收获病毒，并继续在KMB-17单层细胞上进行两次蚀斑克隆纯化过程，最终挑选蚀斑克隆FY-23该克隆在KMB-17细胞中生长4代后作为原始种子(P-7),随后继续以混悬吸附方式在KMB-17细胞中传代生长3代后作为主种子(P-IO)，随后继续同法生长至P-15作为工作种子；(3)对原始种子、主种子、工作种子三个代次的毒种分别进行了鉴别实验、滴度测定、无菌检定、支原体检定、免疫原性检定等，证明其具有良好的免疫原性及在KMB-17细胞上的良好繁殖能力，最终形成了EV-71的三级毒种库。3.—种人用EV-71灭活疫苗，该疫苗由下列成分组成EV-71灭活纯化抗原100|jg/ml氢氧化铝0.8~lmg/ml硫柳汞0.05~0.lmg/ml。4.一种权利要求3所述的灭活疫苗的制备方法，该方法采用下列步骤(I)根据KMB-17细胞生产检定规程，挑选生长致密的第28代KMB-17细胞，弃去培养液，以0.1%胰酶消化细胞后，弃去胰酶液，以原培养液体积的4%体积，DMEM悬浮细胞；(2)在上述细胞悬液中加入本发明的第15代的EV-71病毒液，接种量moi0.02~0.05。混匀后置于37。C，适时轻轻摇动。30min后，将该混悬液转至培养瓶中，加入定量细胞生长培养液，置37°C3~4天，待细胞贴壁并完全病变后，收集收获液；(3)病毒收获液按1:4000比例加入甲醛37°C3天灭活病毒，再经透析浓縮至原体积的5%，上样于Sepharose4FF柱层析纯化，收集纯化后的病毒颗粒峰，电泳及HPLC确定病毒颗粒纯度高于95%，釆用Lowry法测定蛋白浓度，配比稀释调整浓度为lmg/ml;(4)将上述灭活病毒原液过滤除菌后，以磷酸缓冲液调整稀释至100jug/ml,同时加入A1(0H)3至终浓度为0.1%，硫柳汞为0.01%，该产品即为所需的EV-71灭活疫苗成品。全文摘要本发明公开了一种EV-71病毒毒种、人用灭活疫苗及其制备方法。其毒种的分类命名为肠道病毒71型，保藏编号为CGMCC№.2701，所制成的人用EV-71灭活疫苗的组成为EV-71活纯化抗原100μg/ml，氢氧化铝0.8～1mg/ml，硫柳汞0.05～0.1mg/ml。试验表明该疫苗制品具有良好的免疫原性和安全性。文档编号C12N7/00GK101402944SQ20081023358公开日2009年4月8日申请日期2008年11月17日优先权日2008年11月17日发明者刘云霞,刘龙丁,唐松清,崔萍芳,李琦涵,燕梁,王丽春,董承红,谢忠平,马绍辉申请人:中国医学科学院医学生物学研究所