专利名称：拟南芥细胞质型谷氨酰胺合成酶基因的植物表达载体的构建和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种拟南芥细胞质型谷氨酰胺合成酶
基因GS1的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-6IS7，其构建方法和应用。
背景技术：
氮是植物生长的主要柳艮帝鹏营养元素，由于耕作土壤中的氮素通常很难满足 作物对氮元素的需求，因此人们常通m土壤施用大量的氮肥来满足作物生长的需 要。氮月腿常是在高温高压^#下生产的，需要消耗大量的會巨源，而施用的化学肥 料氮只有30%左右被农作物吸收利用，其余大部分进入地下水，造成氮素的损失， 同时导致水体和环境污染，长期施用化肥还造成土壤板结等，严重影响到农业的可 持续生产。Clark等(Clark RB， Duncan RR. 1991. Improvement of plant mineral nutrition through breeding. /^eJd fro/ yfes. 27:219—24)指出人类在通过施 用化肥改变土壤环境满足植物需要方面取得了巨大成绩，但这种途径并不是最实用 和经济的办法，可以运用遗传学方法提高植物对土壤环境逆境的适应性。因lt隨过 植物基因工程的方法，提高植物本身的氮素同化能力，是一种最自然、最科学、最 环保的方式。
植物通常通过两种途径获取所需氮元素从土壤中吸收硝酸盐并将其还原为 氨，豆科植物也可通过生物固氮的方式从大气中吸收氮气并将其还原为氨。由硝酸 盐和氮气还原产生的氨经GS/G0GAT (谷氨鹏安合成酶/谷氨酸合成酶)循环被植物同 化。GS在有ATP供能的前提下催化Glu结合鹏生成Gln， G0GAT将Gin的氨基基团 转移给a -酮戊二酸从而生成两分子的Glu (Ireland RJ， Lea PJ. 1999. The enzymes of glutamine, glutamate， asparagine， and aspartate metabolism. i/ BK Singh, ed， Plant Amino Acids, Biochemistry and Biotechnology. Marcel Dekker， New York, pp 49 - 109)。
植物的GS是由八个亚基构成的聚体，其分子量在320-380kD之间(Stewart GR， Mann AF， Fentem PA . 1980. Enzymes of glutamate formation: glutamatedehydrogenase, glutamine synthetase and glutamate synthase. // BJ Miflin， ed， The Biochemistry of Plants, Vol. 5， Academic Press, New York, pp 271 -327)。 进一步的生化研究表明在植物中存在不同的GS的同工酶，分别定位在叶绿体(GS2) 和细胞质(GS1)中(HirelB， Gadal P. 1980. Glutamine synthetase in rice.尸7朋t /^w'o丄66:619-623)。在迄今研究到的高等植物中，GS2由单一的核基因编码并 且是叶片中起主要作用的GS同工酶，而GS1则是由一个基因家族的多个同源基因编 码的，并且多种植物的f57基因已经被成功地克隆出来(Tischer et al. ， 1986; Gebhardt et al. ， 1986; Tingey et al.，丽，1988; Bennett et al. ， 1989; Boron and Legocki， 1993; Roche et al. ， 1993; Marsolier et al. ， 1995; Temple et al. ， 1995)。 GS1在植物叶片中的表达量较低，而在韧皮部则具有较高 水平的表达。这些S同工酶的组织特异性和亚细胞水平的特异性表达说明它们的功 能是不相重叠的(Tingey SV， Tsai F-Y， Edwards JW， Walker EL, Coruzzi GM. 1988. Chloroplast and cytosolic glutamine synthetase are encoded by homologous nuclear genes which are differentially expressed in vivo. J Biol Chem. 263 :9651 - 9657;Oliveira IC， Coruzzi G. 1999. Carbon and amino acids reciprocally modulate the expression of glutamine synthetase in Arabidopsis thaliana. 尸7朋t尸/^j'o丄121: 301 -309)。在植物的光呼吸过程中，氨在线粒体中被释放， 释放的总量可能超过同期初级氮同化作用所吸收的氨的十倍，释放的氨进入叶绿体 中由GS2进行再同化。由于光呼吸释放出的氨有一个从线粒体出来通过细胞质再进 入叶绿体的过程，在这个过程中，会有一部分氨滞留在细胞质中，因itbM过基因工 程的方法在过量表达细胞质型^堪因有可能提高转基因植物的氨的再同化效率。 Hirel等人(1992， 1997)将来自大豆GSl基因与CaMV 35S启动子融合起来并转入烟 草中，观察到转基因植株叶片的叶肉细胞中自身的W7基因的表达受到相应的诱导， 但是在正常的生长条件下转基因植株的生长状况以及叶片中GS1活性与对照植株相 比没有明显变化。Fernando Gallardo等人(1999)在白杨中过量表达了来自松树的 胞质型GS并使其表达受到CaMV 35S启动子的调控，这是通过过量表达胞质型6"堪因 提高树木的氮素利用率的首次尝试。Vincent等人(1997)在百脉根中以CaMV 35S启动子调控来自大豆的胞质型GS的过量表达，发现胞质型GS的上调表达会促进植物的 生长和发育，导致植物较早的开花并促进植物的衰老。Fuentes等(2001)在烟草 过量表达了来自紫花苜蓿的657基因，同样以CaMV 35S启动子调控其表达，发现转基 因株系叶片的GS活性比对照植株高6倍，光合能力得到明显增强，并且在低氮剝牛 下显示出优于对照植株的生长能力，表现在其茎的伸长、根的干重以及叶片面积均 远远超出对照植株。近年来也有学者试图通过过量表达多^GS基因以提高氮素同化 能力。例如，Sun等人(2005)利用RT-PCR技术克隆出大豆的GS1和GS2的cDNA并 将两个基因共同连入p2GS双元植物表达载体并转入水稻中，使得657基因和6^邀因 的表达分别受至UActl启动子和Ubi启动子的调控，结果说明转基因植株对低氮剝牛 的耐受力明显优于对照植株。这些实验数据提供了大量i正据表明GS的过量表达将影 响植物的光^il率，提高植物对低氮胁迫的耐受力，也证明了通过基因工程技术提 高植物的氮素利用率的方法是可行的。但至今尚未有含有拟南芥基因组中存在的细 胞质型的6^7基因的植物表达载体的相关报道。
从GS/GOGAT途径中可以看出，植物对氮素的禾拥不仅需要氮元素，还需要大 量的碳骨架a-酮戊二酸，这表明植物的碳代谢和氮代谢之间存在紧密的联系，而 调节植物碳骨架的产生过程可能也是一种改善植物氮吸收的潜在途径。Dof (DNA binding with one finger)蛋白是植物所特有的一类转录因子，它含有一个独特的 富含Cys残基的单锌指保守结构域命名为Dof结构域(YanagisawaS. 1995. A novel DNA binding domain that may form a single zinc finger motif. 7Vk^/eic勿V Afes. 23:3403-3410)。目前，已在多种单子叶植物和双子叶植物中发现了 Dof蛋白， 研究表明它们在高等植物的基因表达调控中起重要作用(郭晓芳，严海燕.2005. 植物中的Dof蛋白和Dof转录因子家族.植物生理学通讯.41 (4) :419-423)。在多 种植物的基因启动子区都发现有Dof蛋白结合元件，这表明Dof蛋白有多种功能， 参与植物多种生命活动的调控。对玉米Dofl研究发现，Dof 1转录因子是包括丙酮 酸激酶和磷,醇式丙酮酸羧化酶基因表达在内的一系列有机酸多基因表达的激 活剂(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)基因的调控元件(Yanagisawa S. 2000. Dofl and Dof2 transcription factors are associated with expressionof multiple genes involved in'carbon metabolism in maize, v^/ant 乂 21:281-288)。因此，Dofl是碳代谢一个关键调节因子，过量表达Dofl可提高植物碳代谢 能力，在一定程度上可以iSS植物的氮素同化能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高植物氮素利用能力的谷氨鹏安合成酶基因的植 物表达载体，该载体是含有拟南芥细胞质谷氨,安合成酶基因(即G57基因)的植 物表达载体；同时提供该载体的构建方法，以及该载体在制备具有较高氮素利用率 的转基因植物中的应用。
本发明所提供的用于提高植物氮素利用能力的载体，是具有光诱导启动子和细 胞质型谷氨^l安合成酶基因cDNA的植物表达载体。
上述载体中，所述的谷氨MJK合成酶基因的cDNA来源于拟南芥 (v4raWoA^s ^3^a^)。所述的来源于拟南芥的谷氨酰胺合成酶基因657的cDNA GenBank登录号为AY063967。
上述谷氨酰胺合成酶基因cDNA的上游为Rubisco小亚基的光诱导型启动子。
上述载体中，用于构建所属植物表达载体的起始载体为pH2GW7 (购自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。
'本发明的上述植物表达载体pH2-35S-PrbcS-657由下述方法构建而成
(1) 从GenBank中査找拟南芥细胞质型657编码区的全长cDNA序列，并设计
序列如下的一对弓胸
GS1 5: 5， _ CACCATGGCTTCACTTGCAGATTTMTC -3， GS1 3: 5， _ GMTTCTCATGGTTTCCAMGGATTGTGG -3，
5，端引物GS15， 5，端添加CACC特征序列，并由此生成AfcoI酶切位点；3， 端引物GS13,末端添加^^位点酶切；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到 657基因的编码区全长cDNA;
(2) 回收并纯化^7全长基因cDNA片段的编码区基因片段，并将其连接到 pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组 质粒pMD-6"67;(3) 构建入门载体pENTR*-PrbcS-657，用Afcol和￡boM切割
pENTR*-PrbcS^T-^F载体(pENTR*-PrbcS-*T~GFP的构建见本申请人的另一项专 利申请，申请号为200710066422. 9)和pMD-657,回收载体pENTR*-PrbcS片段和 6!S7基因编码区cDNA片段，然后连接、转化、抽提质米锁行PCR检观,酶切检测， 获得入门载体pENTR*-PrbcS-^S7;
(4) 构建657基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-6S7，通过Gateway技术的 LR反应把PrbcS-^57亚克隆到植物表达载体pH2GW7 (Gateway的目的载体，比利时 VIB/Gent公司)中，获得^7基因的植物表达载体pH2-35S-PrbcS-f57。
本发明利用光诱导型启动子PrbcS构建657基因的植物表达载体，以便在转基 因植物叶片的细胞质中过量表达6157基因，提高转基因植株对光呼吸作用释放的氨 的再同化能力，从而提高转基因植物的氮素利用率。
图l:拟南芥总RNA的提取，所有泳道均为所提拟南芥总RNA;
图2: 657基因的TA克隆策略； 图3: GS1基因的扩增和TA克隆；
(A)以拟南芥RNA为底物反转录成cDNA进行RT-PCR。 M:DL2000 DNA marker; 1-3: 6^7基因的RT-PCR扩增产物。(B)重组质粒pMD18-657的电泳检测。1:正对 照(分子量为3. 7kb的质粒DNA); 2-3:重组质粒pMD18"GSl。(C)重组质粒pMD18-657 的PCR检测。M:DL2000 DNA marker; 1:以pMD18-657为模板用GS15和GS13引物 扩增的PCR产物。
图4:入门载体pENT妙-PrbcS-657的构建策略；
图5:入门载体pENT砂-PrbcS-GSl的检测；
(A) PENTR*-PrbcS-6!S7质粒的电泳检测。1:正对照(分子量为4. 8kb的质粒 DNA) ;2-3: pENTR*_PrbcS-657质粒DNA。(B) pENTR*-PrbcS-6IS7的PCR检测。 M:DNA markerlll;1-5: pENTR*-PrbcS—的PCR检测(引物为GS15和GS13) ;6: 正对照(以pMD18-6157为模板的PCR产物，引物为GS15和GS13) ;7:负对照(以 pENTR*-PrbcS-*T-^F为模板的PCR产物，引物为GS15和GS13); (C):pENTR*-PrbcS-6"57以fcoRI以及AfcoI双酶切检测。1、 DL2000 DNA marker; 2、 入DNA/历'77d III DNA marker; 3-4:负对照(pENTR*-PrbcS-氺T-6F尸的酶切产物)； 5-8: pENTR*-PrbcS-^57的酶切产物。
图6: 6!S7植物表达载体的构建策略；
图7: ^S7植物表达载体的检测；
(A) pH2-35S-PrbcS-G57质粒的电泳检测。1:质粒pH2GW7; 2:质粒 pH2-35S-PrbcS-G57; (B) pH2-35S-PrbcS-6"67的PCR检观U。 M:DL2000 DNA marker; l:正对照(以pMD18-^67质粒为模板扩增的PCR产物，引物为PrbcS5和GS13) ;2: 负对照(以pH2GW7为模板扩增的PCR产物，引物为PrbcS5和GS13) ;3-7:以 pH2-35S-PrbcS-6167为模板扩增的PCR产物，引物为PrbcS5和GS13。
图8:农杆菌菌落的PCR检测；
M:DL2000 DNA marker; 1:正对照(以pMD18-6IS7为模板，使用GS1部分内部 序列上下游引物进行扩增的PCR产物)；2:负对照(以水为模板，使用GS1部分 内部序列上下游引物进行扩增的PCR产物)；3-7: pH2-35S-PrbcS-6S7的农杆菌转 化子菌落的PCR (弓,为GS1部分内部序列上下游引物)扩增产物。
图9:转基因烟草的PCR检测；
(A)转657烟草的基因组电泳图。1-4:野生型转^S7烟草的基因组。(B)转^57 和/to/7烟草的基因组电泳图。1-8:转^^和"o/7烟草的基因组。(C)转6^烟 草的PCR检测。M:DNAmarkerlII;1-4:负对照(分别为以P7-1、 WT_1、 WT-2、 P7-2 为模板的PCR扩增产物，弓I物为GS1内部部分序列的上下游引物)；5-6:转^S7的 植株；7:正对照(以pMD18-6^质粒为模板的扩增产物，引物为GS1内部部分序 列的上下游引物)。(D)转657和"o/7基因的PCR检测。M:DNAmarkerIII;l:负对 照(未转基因的野生型)；2:负对照(只转入PCK基因的P7型烟草)；3:正对照 (以pMD18-6IS7为模板扩增的产物，弓胸为GS1基因内部部分序列的上下游引物); 4-8:转C67和化/7基因烟草的基因组PCR产物(因此处是将GS1基因转入已经检 测过成功转入"o/7基因的烟草中，故只对GS1基因的转入情7皿行了 PCR检测)。 图10:转657和"o/7基因烟草的RT-PCR检测；(A) 转657和Zfe/7基因烟草的总RNA电泳图。1-2:转双基因植株的总RNA。
(B) 转657和Zb/7基因烟草的RT-PCR电泳图。M: DNA markerIII; 1-2:转双 基因植株(弓胸为^57基因上下游弓胸)的PCR产物。因此处是将GS1基因转入已 经检测过成功转入/b/7基因的烟草中，故只对GS1基因的转入情况进行了 PCR检
图11:转657和/to/7基因烟草的生长情况；
将野生型、转/fef7基因烟草(光诱导型启动子PrbcS)、转Zfc/7和6IS7基因烟 草由无菌培养条件下移栽入珍珠岩中，施以低氮营养液培养2个月后拍照(A、 B) 继续培养两2个月后移入土壤中，在温室自然条件下培养1个月后观察其表型变化 并拍照(C)。
(A) 1:未转基因的野生型烟草；2-4:转化/7基因的烟草。
(B) 1:未转基因的野生型烟草；2-5:转6IS7和Zb/7基因的烟草。
(C) 1-2:转6^和"o/7基因的烟草；3:转Zb/7基因的烟草；4:未转基因 的野生型烟草。
图12:转657和"0/7基因烟草的株高测量；
将野生型、转Zfe/7基因(光诱导型)烟草、转Zb/7基因(组成型)烟草和转 Zb/7和6^7双基因烟草由无菌培养条件下移栽入珍珠岩中，施以低氮营养液培养四 个月后移入土壤中，在温室自然条件下培养1个月后观察其表型变化并测量其株高。
图13:转6157和Zfe/7基因烟草的D-Glucose含量测定；
图14:转6157和"o/Y基因烟草的L-Malate含量测定；
图15:转6157和Z o/7基因烟草的GS1相对酶活测定。
具体实施例方式
试剂与仪器
试剂主要分为分子生物学实验试剂、植物遗传转化所需的培养基以及转基因植 物鉴定和检测所需的各种试剂。各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、反转录酶、 RNA酶抑制剂、dNTP等为宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂細自博 大泰克生物技术有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂盒、Gateway LR clonaseEnzyme Mix kit购自invitrogen公司。其余试齐lj均为国产分析纯。 仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。
所有弓,序列均在大连宝生物公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说 明均为常规方法。
实施例1:拟南芥总RNA的提取与检测
本发明中拟南芥UraZ7y0bps^s z^gJia朋，ecotype, Columbia)总RNA的制备 采用TRNzol Reagent (购自invitrogen公司)法。取新鲜叶片组织O.l g，在液 氮中迅速充分研磨至粉末状，加入1 ml的TRIzoL RNA提取液，混匀后室温静置5 min，加入0.2 ml氯仿，剧烈振荡混匀，4 °C， 12000 rpm离心15 min，转移上层 水相到新管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置IO min。 4 °C， 12000 rpm离 心10min，弃上清，沉淀以lml75X的乙醇清洗一次，真空干燥沉淀，加入20"1 焦碳酸二乙酯(DEPC)处理水充分溶解RNA，取2 u 1总RNA用1. 2%的琼脂糖凝胶 进行电泳检测，结果(图l)说明提取到的总RNA质量符合要求。
实施例2: 657基因的扩增与TA克隆
"57基因的扩增及TA克隆的策略如图2所示，首先从GenBank中査找拟南芥胞 质型编码区的全长cDNA序列，并设计序列如下的一对弓胸 GS1 5: 5， _ CACCATGGCTTCACTTGCAGATTTMTC -3， GS1 3: 5， _ GMTTCTCATGGTTTCCAAAGGATTGTGG -3,
5，端引物GS15， 5，端添加CACC特征序列，并由此生成肷ol酶切位点；3， 端引物GS1 3,末端添加^boM位点酶切。
用拟南芥总RNA为模板，使用RevertAid -MuLV Reverse Transcriptase Kit (Fermentas)进行cDNA的合成。取植物总RNA 0.1-0. 5 u g， oligo (dT) 50ng， 10 mMdNTPmix 1 u 1，用DEPC处理水补足至10 u 1，混匀后，短暂离心将其收集于 管底，置于65'C恒温干热加热器中加热5min，冰浴10min,加入反应混合物9 ul (10Xreaction buffer 4ul， 25 mM MgCl2 4 ul， 0.1 M DTT 2 ti 1， RNA酶抑 制剂1 yl)，混匀，短暂离心将其收集于管底，25 。C保温2 min，加入1 ul RevertAid -MuLV Reverse Transcriptase,混匀，短暂离心将其收集于管底，25 °C保温20 min，然后42 。C保温70 min，合成cDNA。 -20 。C保存备用。
用^67基因上下游特异性引物GS15和GS13作RT-PCR,在RT-PCR反应混合液 中加入3 u 1的cDNA作为模板，同时加入50ng的特异性弓胸GS15和GS13、 2. 5 y 1 dNTP (2. 5mM， ) 2. 5 u 1的lOXExtaq反应Buffer和0. 25 u 1的Extaq (5U/ u 1聚 合酶(日本宝生物)，加双蒸水使反应终体积为25ul。在PCR仪上于9fC加热2 分钟，然后按照94i:、 30秒，55°C、 30秒，72°C、 1分钟的程序进行30个循环的 反应，最后在72。C延长反应10分钟的程序进行PCR反应扩增得到(^7基因。反应 完成后，通过琼脂糖凝胶电泳分离GS1的PCR扩增产物(图3A)回收并纯化^57编 码区全长片段(l. Okb)，然后用宝生物(TaKaRa)的TA克隆试剂盒将其连接到pMD18-T (大连宝生物公司)载体上，实验操作按试剂盒的说明书进行，反应过夜后用反应 混合液转化大肠杆菌感受态DH5 a (购自天根生化科技公司)，采用碱裂解法提取质 粒DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳(图3B)，选取大小和理论值相符的重组质粒pMD18-657 做进一步的PCR检测，用657基因上下游特异性引物GS15和GS13作PCR,亚克隆 成功的重组质粒均能扩增出1. Okb左右的G67基因DNA片段(图3C)。根据阳性重 组质粒pMD18-载体两端的多克隆位点，用Afcat和fcoRI双酶切重组质粒，经 1%琼脂糖凝胶电泳检领鹏切产物，连接成功的重组质粒pMD18-657产生2条带，一 条为1.0kb左右的^S7基因DNA插入片段，另一条为2. 7kb的载体片段，经序列分 析证明该载体中的插入片段是657的编码区全长片段。再次确认是连接成功的质粒 后，重新转化大肠杆菌DH5 a ，挑单个菌落进行液体培养，用试剂盒纯化质粒 pMD18-657。
实施例3: Gateway入门克隆载体pENT胖-PrbcS"GSl的构建
pENTR*-PrbcS~GSl的构建策略如图4所示，用(Fermentas)和fcoRI (Fermentas)切开纯化的质粒载体pENTR*_PrbcS-^-fi^(专利申请号为 200710066422. 9)和pMD18-657，通过琼脂糖凝胶电泳分离已切开的载体和插入片 段，从凝胶中回收pENT砂-PrbcS-求T-^P被切割后产生的载体片段pENTR*_PrbcS (3. 8kb)及pMD18-657被切割产生的GS1被切割产生的657基因的DNA片段 (l.Okb),然后用宝生物(TaKaRa)的连接酶试剂盒连接pENTR*-PrbcS和&7基因的DNA片段产生入门载体pENTR*-PrbcS-6I57。用连接反应混合物转化高效率(108) 的大肠杆菌感受态(DH5ci，天根生化科孝i)，把转化好的大疡杆菌涂于加有卡那霉 素(Km, 50ug/ml)的LB平板上，于37° C过夜培养，筛选Km抗性重组子菌落， 从Km抗性重组子菌落中提取质粒(图5A)，以6^57基因上下游弓胸进行PCR扩增检 测(图5B)，连接成功的质粒载体pENT妙-PrbcS-657可扩增出大小为1.0kb的6S/ 基因片段。用lol (Fermentas)和AcgRI (Fermentas)双酶切重组质粒进行检测, 连接成功的质粒在琼脂糖凝胶电泳图上产生两条带，分子量小的一条为1. Okb，另 一条为3.8kb (图5C)。再次确认是连接成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a ， 挑单个菌落以液体LB进行培养，用试剂盒纯化质粒pENTR*-PrbcS-^S7。 实施例4: ^7基因植物^i&载体的构建
基因植物表达载体的构建策略如图6所示，通过Gateway技术的LR反应把 pENTI^-PrbcS-6"57亚克隆到植物表达载体pH2GW7 (Gateway的目的载体，购自比利 时VIB/Gent公司)中。具体的做法是用质粒抽提试剂盒纯化Gateway的目的载体 pH2GW7，在Gateway的LR反应体系中加pENTR*-PrbcS-G67和pH2GW7各150ng， 1 u 1LR ClonaseII Enzyme Mix (Invitrogen)，混匀于25° C反应过夜，通过整合 酶的作用把PrbcS-657整合到pH2GW7中获得657的植物表达载体质粒 pH2-35S-PrbcS-657。用反应混合物转化高效率(108)的大肠杆菌感受态(DH5a， 天根生化科技)，把转化好的大肠杆菌涂于加有壮观霉素(Spe， 50u g/ml)的LB 平板上，于37° C过夜培养，筛选Spe抗性重组子菌落，从Spe抗性重组子菌落中 提取质粒(图7A)，用于PrbcS区域中的特异性弓嫩PrbcS5和基因的下游特异 性弓l物GS13进行PCR检测，整合成功的质粒均能扩增出一条1. 2kb左右的条带(图 7B)，确认是重组成功的质粒后，重新转化大肠杆菌DH5 a ，挑单个菌落以液体LB 进行培养，用试剂盒纯化质粒。
实施例5:用6^7基因的植物表达载,化农杆菌 制备农杆菌感受态细胞，用电脉冲法将上述构建好的植物表达载体 pH2-35S-PrbcS-657转入农杆菌(C58C1 (pPMP90))中，在加有壮观霉素的LB平板 上筛选转化子。取少量质粒加入农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，将混合物加入到预冷的电转化杯中，轻轻敲击杯身使混合液落至杯底，将电转化杯置于电转化仪
(BI0-RAD)滑槽中，用的点击杯和200欧姆，2. 5Kv/0. 2cm的参数进行电击， 点击后立即取出电转化杯，迅速加入0. 5mlS0C培养基，混匀，转移到1.5ml的离 心管中；28° C， 200卬m摇床培养3-5h;室温下，7500rpm离心lmin，弃大部分上 清，保留100ul将细胞悬浮；把农杆菌涂布于加有壮观霉素(Spe， 50ug/ml)的 LB固体培养基上，28° C培养2天获得单菌落;首先挑取农杆菌单菌落于20 u lddH20 中，98° C处理15分钟后取出10 u 1农杆菌裂解液作为PCR反应的模板。用(SS7基 因上下游特异性弓嫩作PCR检测，转化成功的菌落能扩增出1. Okb的657基因条带 (图8)，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物。
实施例6:用含有基因植物^&载体的农杆菌转化植物 首先挑取携带有pH2-35S-PrbcS-657质粒的农杆菌单菌落接种于50ml的LB液 体培养基(含Spe， 100ug/ml)， 180rpm， 28° C培养2h，待菌液ODeoo至1. 0左右， 3500rpm，离心10min，沉淀菌体。再用10 ml左右的MS液体培养基悬浮菌体，3000 rpm离心10min，沉淀菌体。重复以上操作2 3次。最后用加入一定体积的MS液 体培养基重悬浮，使菌体的OD,值为0. 5，静置l h备用。
本发明选取容易转化的植物烟草作转化实验。制备烟草0Wco"a/7a c「.J朋说的无菌苗，把无菌苗的叶片切成小片叶盘，将其用以上制备好的农杆菌 菌液浸染15 20 min，用无菌吸水纸吸干后，平铺于愈伤组织诱导培养基MS1
(MS+NMO. 21 u g/ml+BAPO. 02 u g/ml)上黑暗共培养2天，将外植体转移至含壮观 霉素(50"g/ml)的芽诱导培养基MS4 (MS+NMO. 53"g/ml+BAPO. 5ug/ml)上进行 芽的诱导，获得转入6IS7基因的植株。
实施例7: ^7基因在转基因植物中的插入情况和转录水平的检测 为了确认从转化的烟草叶盘产生的转基因植株确实含有^S7基因，用PCR方法 对筛选到的转基因植株作进一步的鉴定。首先采用CTAB法提取植物基因组称取 0.1 g植物叶片置于1. 5 ml离心管中，加液氮用特制研#^开磨至粉状。加入900 u 1 预热到65 。C的2XCTAB缓冲液(Tris-HC1 pH7. 5 lOOmM， EDTA 20mM， NaCl 1. 4M， CTAB2%)， 65 °C水浴20min，中间每隔2 min摇匀一次，取出冷却至室温，再加入500 "l氯仿异戊醇(24: l)混合液，旋转摇匀，4°C, 7500 rpm，离心10min， 转移上清至一新的离心管。重复上述步骤。加入1/10体积3M pH5. 2 NaOAc和等体 积的异丙醇，摇匀后4 。C ， 12000 rpm，离心20 min。弃上清，用75%乙醇清洗 两次后^B喿，用含有咖ase的1X TE缓冲液溶解并降解RNA，取2 u 1以1%琼脂糖 凝胶电泳检测(图9A和9B)。以植物基因组DNA为模板，用6S7基因内部部分序列 的上下游特异性弓l物作PCR检测，成功转入^57基因的植株均能扩增出670bp左右 的DNA条带(图9C和9D)。经PCR确认的转基因植株用于RT-PCR分析。
为了考察在含有657基因的转基因烟草株系中^S7基因的转录情况，从转基因 植物中抽取总RNA，反转录成cDNA后用于RT-PCR分析，检测657基因在转基因植 物中的转录水平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA，以1. 0%琼脂糖凝 胶电泳检测(图10A)后，使用RevertAid -MuLV Reverse Transcriptase Kit
(Fermentas)进行cDNA的合成。以cDNA为模板，用基因上下游特异性弓胸 作PCR反应，成功转入6"57基因的植株均能扩增出1. 0kb的GS1条带(图10B), 证明基因可以在转基因植物中成功地转录。经RT-PCR确认的转基因植株用于 氮素营养相关实验的分析。
实施例8:转6157和基因植物在低氮营养割牛下的生长情况 为了检测657在转基因烟草中是否发挥预期的作用，分别将无菌的转入 和657基因的转基因植物小苗、只转入单基因的转基因植物小苗以及野生型 小苗移栽入珍珠岩中，每周施用两次等量的低氮营养液(Ca(N03)2*4H20 59mg/L， NMOs 20mg/L,使氮元素的使用终浓度达到lmMol/L)，在25° C持续光照培养2个 月后拍照(图11A、 B)，继续培养2个月后移栽入土壤中，于温室自然条件下培养 l个月(不施营养液)观察植物表型变化(图11C)。结果说明在低氮培养条件下， 只转入Zfe/7单基因的转基因植物比野生型植株长势fflm(图IIA)，而同时转入^57 和Zfo/7基因的植物与对照植株相比尚未显示出生长优势(图11B)，于温室自然条 件下培养1个月后，同时转入657和"o/7基因的植物与对照植株相比显示出其明 显的生长优势(图11C)，说明转入的^57基因和化/7基因育巨够在植物中发挥预期 作用，提高了植物在低氮营养条件下同化氮素的能力。实施例9:转6S/和Zto/7基因植物在低氮营养条件下的D^lucose含量的测定
选用酶法测定植物抽提液中D"葡萄糖(EHGlucose)的含量。D"葡萄糖在己糖 激酶的催化下，由ATP供能，可生成6-磷酸葡萄糖和ADP，产生的6-磷酸葡萄糖在 6-磷酸葡萄糖脱氢酶的作用下，被NADP+氧化为6-磷酸葡萄糖酸并生成NADPH。由 于产生的NADPH在340nm处具有特征性的光吸收值，通过测定反应前后反应体系在 340nm处的光吸收值的差值，可以对反应物中的D-葡萄^量进行定量。取0.5g 的新鲜植物材料,在液氮中fflil研磨成粉末状，加入4ml磷酸钾缓冲液(KH2P040. 27g， K2HP04 1.83g， PH7.6)充分研磨，4° C， 12000rpm离心20min，将上清转移入新管 中，-20° C保存备用(用于D-Glucose， L-Malate的含量测定)。
向每个反应体系中加入lml Solution2 (NADP 110mg， ATP 260mg，溶于45ml 蒸馏水中)，1.9ml蒸馏水，再加入100 u 1上述抽提液，将上述混合液加入比色杯 中，3min后读取340nm处光吸收值Ai。再向反应体系中加入5. 8IU的服(己糖激 酶)和2.9IU的G6PDH (6-磷酸葡萄糖脱氢酶)以启动反应，15min后读取340nm 处光吸收值A2。根据反应方程c=3. 020 X180. 16 X (A厂A》/ e X1. 00 X 0. 100 X1000
(gD-glucose/1 sample)(其中e 二6. 3 aXmrnol—iXcm1))可计算出反应液中 D-glucose的浓度(图13)。结果说明野生型烟草植株中D-glucose的含量最低， 只转入单基因的转基因植物比野生型植株中D"glucose含量略高，而同时转 入和657基因的转基因植物的D-glucose含量大大高于野生型。
实施例10:转6S7和仏/7基因植物在低氮营养^f牛下的L^nalate含量的测定
通过酶法测定植物组织抽提液中L-malate (L-苹果酸)的含量。L-malate在 苹果酸脱氢酶的作用下可被NAD+氧化并产生NADH，生成的NADH在340nm处有特征 性的光吸收，通过测定反应前后反应体系在340nm处的光吸收值的差值，可以对反 应液中L-malate的含量进行定量。
取O. lml上述抽提液，95° C处理2min后，4° C， 12000rpm离心15min，取上 清入一新管中；加入0. 25ml蒸馏水和0. 45mlTris-HCl缓冲液(PH9. 0)，混匀后加 入NAD+溶液(30mg/ml) 60ul，读取在340nm处的光吸收值A。之后加入2ulMDH (16.5IU/ul)，反应3min后读取340nm处的光吸收值A2。根据以下方程c二(A2-A「0. 0043)/0. 0133 (mg L-malate/1 sample)可计算出反应液中L-malate的 浓度(图14)。结果说明野生型烟草植株中L-malate的含量最高，只转入/b/7单 基因的转基因植物比野生型植株中L-malate含量略低，而同时转入Zb/7和657基 因的转基因植物的D-glucose含量大大远低于野生型。
实施例11、转"7和化/7基因植物在低氮营养条件下的GS相对酶活性的测定
通过酶法对植株的GS相对酶活性进行测定。首先对植物叶片中的总蛋白进行 抽提。取新鲜植物叶片0.2g，加入lml蛋白抽提液(由100mMTris-HCl (pH7.5) 4 ml; 10% (V/V)甘油4 ml; 10 mM巯基乙醇(merEtOH) 28.5 u 1; 1慮PMSF 0.4 ml; 5% (W/V) PVP 2 g配制而成)研磨，移至EP管中，13000 r/min， 4 。C 离心25 min。将上清移到新的EP管中，采用Bradford Reagent (BIO-RAD)在595nm
处测定蛋白浓度后进行酶活性测定。
在5ml的离心管中，加入1.8ml的反应液(含184uM的谷氨酸；90mM的 MgS04;12mM的羟胺；lOOmM的咪锉；36慮的ATP)，再加入200ug的植物蛋白提取液， 以ddH20补足到2ml，在28。C温育15min后，加入lml的FeCl3反应终止液(由10g 三氯乙酸，8g FeCl3加入到250ml 0.5M盐酸中配制而成)以终止反应，4000rpm离 心10min，测定上清液在500nm处的光吸收{直，由于产生的L-谷氨酉划安在500nm处 具有特征性的光吸收值，故可以此反应出反应物中的GS的相对酶活性(图15)。结 果表明，野生型烟草植株中GS的相对酶活性最低，只转入/ o/7单基因的转基因植 物比野生型植株中的GS酶活性略高，而同时转入和657基因的转基因植物的 GS相对酶活性最高，表明转入的6157基因的确赋予植物与对照相比较高的GS的活 性，从而提高了植物在低氮营养割牛下同化氮素的能力。
权利要求
1、一种重组植物表达载体，含有拟南芥细胞质型谷氨酰胺合成酶基因即GS1基因。
2、 权利要求l的重组载体，用于构建所述植物表达载体的起始载体为pH2GW7。
3、 权利要求1的重组载体，其中6"67基因cDNA上游添加有Rubisco小亚基的 光诱导型启动子PrbcS。
4、 权利要求1的重组载体，为pH2-35S-PrbcS-657，在起始载体pH2GW7上连 有启动子PrbcS，其后紧接^57基因。
5、 权利要求1的重组载体，由下述方法构建而成 (1)拟南芥657基因的扩增从GenBank中査找拟南芥657基因编码区cDNA序列，并设计序列如下的一对引物GS1 5: 5， _ CACCATGGCTTCACTTGCAGATTTMTC -3， GS1 3: 5， _ GAATTCTCATGGTTTCCAAAGGATTGTGG _3，5'端引物GS15， 5'端添加CACC特征序列，并由此生成iVcot酶切位点；3' 端引物GS13，末端添加^boM位点酶切；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到 《57基因的编码区全长cDNA;(2) 回收并纯化6IS7全长基因cDNA片段的编码区基因片段，并将其连接到 pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组 质粒pMEHG57;(3) 构建入门载体pENT脉-PrbcS-6S7，用餘ol和fcoM切割 pENTR^PrbcS-W-fi^载体(pENTR*-PrbcS-*T-GFP的构建见本申请人的另一项专 利申请，申请号为200710066422. 9)和pMD-6167，回收载体pENTR*_PrbcS片段和 ^S7基因编码区cDNA片段，然后连接、转化、抽提质禾腿行PCR检测和酶切检测， 获得入门载体p丽R氺-PrbcS-657;(4)构建657基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-6^7，通过Gateway技术的 LR反应把PrbcS-657亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得657基因的植物表达 载体pH2-35S-PrbcS-6I57。
6、 权利要求1细胞质型谷氨酰胺合成酶基因的cDNA来源于拟南芥，其 GenBank登录号为AY063967 。
7、 权利要求1的重组植物表达载体的构建方法，其特征在于(1) 从GenBank中查找拟南芥胞质型编码区的全长cDNA序列，并设计序列如下的一对引物GS1 5: 5， - CACCATGGCTTCACTTGCAGATTTMTC -3， GS1 3: 5， - GMTTCTCATGGTTTCCAMGGATTGTGG -3，5，端引物GS15， 5'端添加CACC特征序列，并由此生成Afcot酶切位点；3， 端引物GS13，末端添加^^[位点酶切；以拟南芥第一链cDNA为模版扩增，得到 657基因的编码区全长cDNA;(2) 回收并纯化657全长基因cDNA片段的编码区基因片段，并将其连接到 pMD18-T载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组 质粒pMD-6IS7;(3) 构建入门载体pENT妙-PrbcS-6S7，用tVcoI和fco旦切割 pENT砂-PrbcS-求T-^P载体(pENTR*-PrbcS-*T_GFP的构建见本申请人的另一项专 利申请，申请号为200710066422. 9)和pMD_6I57，回收载体pENTR*-PrbcS片段和 6^7基因编码区cDNA片段，然后连接、转化、抽提质禾锁行PCR检测和酶切检测， 获得入门载体pENTR*-PrbcS-657;(4) 构建657基因植物表达载体pH2-35S-PrbcS-657，通过Gateway技术的 LR反应把PrbcS-G67亚克隆到植物表达载体pH2GW7中，获得6157基因的植物表达 载体pH2-35S-PrbcS-f67。
8、 权利要求1-5之一的重组植物载体在制备农杆菌转基因植株中的应用。
9、 含有权利要求1的重组植物载体的农杆菌转基因植株。
10、 权利要求9的农杆菌转基因植株，由下述方法制得用电脉冲法将植物表 达载体pH2-35S-PrbcS-657转入农杆菌C58C1 (pPMP90)中，筛选转化子菌落，以农 杆菌菌落的裂解液作为PCR反应的模板，用6157基因的上下游特异性弓l物做PCR检 测转化子菌落，经菌落PCR确认的转化子菌落用于转化植物；挑取携带有质粒pH2-35S-PrbcS-的农杆菌单菌落接种于液体培养基中培养，离心收集菌体，再 用MS液体培养基悬浮，用悬浮的农杆菌感染容易分化的植物组织，然后通过组织 培养获得转基因小苗，再利用抗生素筛选获得转基因植株。
11、权利要求1-5之一的重组植物载体在制备具有较高氮素利用率的转基因烟 草中的应用。
全文摘要
本发明含有拟南芥细胞质型谷氨酰胺合成酶基因GS1且能提高植物氮素利用率的专用植物表达载体pH2-35S-PrbcS-GS1。利用RT-PCR的方法从模式植物拟南芥中克隆出GS1基因，用光诱导型启动子(Rubisco小亚基的启动子)调控其在植物叶片中过量表达，并通过叶盘转化法将其转入pPZP221-PrbcS-Dof1型转基因烟草中。实验结果表明在转基因烟草中GS1基因能够正常转录，在低氮营养条件下，在室内2000LUX 24小时光照和25°生长条件下，转入Dof1单基因(以光诱导型启动子PrbcS调控其表达)的植物的生长情况略优于对照植株(未转基因的野生型)，转入温室自然生长条件下后，同时转入GS1和Dof1基因的烟草的生长情况比对照植株相比尚显示出明显的生长优势，说明同时过量表达GS1和Dof1基因能够更大程度的提高叶片中GS/GOGAT(谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合成酶)途径的效率，从而提高植物氮素利用率。本载体能广泛用于农作物的分子育种，提高其氮素利用率及对低氮营养条件胁迫的耐受力，在少施甚至不施氮肥的条件下能获较高产量。
文档编号C12N15/52GK101407824SQ20081023362
公开日2009年4月15日 申请日期2008年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者冰 傅, 李昆志, 潘丽峰, 王艺霖, 王莎莎, 艳 赵, 陈丽梅 申请人:昆明理工大学