专利名称：耶尔森氏菌属菌株km1和由其制备的低温碱性脂肪酶及其纯化方法
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体地，涉及一株低温细菌菌株，即低》显细菌菌 株耶尔森氏菌属(rei^j'Ws sp. ) KMl,以及由该菌株作原料纯化而得的耐有机溶 剂的低温碱性脂肪酶，和其分离纯化方法。
背景技术：
月旨肪酶(Lipase, EC 3.1.1.3)是一类在油-水界面上催化天然油脂(甘油三 脂)降解为甘油和游离脂肪酸的酶。低温脂肪酶普遍由低温微生物分泌产生，酶的 最适反应温度一般均低于4(TC，而在(TC仍具较高酶活。相对于高温和中温脂肪酶 而言，低温脂肪酶有更宽的pH适应范围，腿一步拓宽了其工业应用范围。
低温脂肪酶由于在低温下具有良好的催化活性和低温适应性，弓胞了各国科学 家们的广泛关注。目前所用的洗涤剂大都需在中温甚至高温下才能有效去除油污， 皿织物有一定的破坏作用，若采用含低纟显脂肪酶的洗涤剂，不但能在低温下有效 去除油污，节约能源，而且不会破坏织物。利用低纟显脂肪酶进行皮革低温催化脱脂 时，不需加热和添加其它脱脂剂，不会造成环境污染，也能最大限度地保持皮革的
天然外观，既节约了會^源，又保证了皮革的质量。在欧洲、日本与美国，低温脂肪 酶己开始用于洗涤剂工业。
低温脂肪酶由于具剤氐温高催化活性，耐有机溶剂以舰热敏感等特点，成为 了近年来酶学研究的一个热点，在食品、洗涤、制药、脂类加工、低温环境修复等 工业上有着巨大的应用潜力。对低温脂肪酶纯化研究，将为我国低温脂肪酶的基础 及应用性研究提供一定的参考。
现有技术中未有低温细菌菌株耶尔森氏菌属(rei^'7W'a sp. ) KM1，以及由该 菌株作原料纯化而得的耐有机溶剂的低温碱性脂肪酶，和其分离纯化方法的报道。
发明内容
本发明旨在提供一株高产碱性脂肪酶的低温细菌菌株。
本发明的另一 目的在于提供由上述菌株产生的耐有机溶剂的低温碱性脂肪酶
4及其分离纯化方法。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下技术方案
低温细菌耶尔森氏菌属(rei^/m'asp. ) KM1，其保藏号为CGMCC No. 2637。 由低温细菌耶尔森氏菌属(&7^'/^ sp. ) KM1菌株产生的耐有机溶齐啲低温 减性脂肪酶。
该低温碱性脂肪酶具有以下酶学性质
(1) 纯化的耶尔森氏菌属(Iferw'/7ia印.)KM1菌株所产低温脂肪酶最适酶活 温度为37。C;
(2) 最适pH为9. 0，在pH7. 2-10. 0保持稳定；
(3) 低温脂肪酶的分子量为34. 3 Kda;
(4) 低温脂肪酶能耐受50%-80%的部分有机溶齐1丄如甲醇、乙醇及DMSO。 低温碱性脂肪酶，以耶尔森氏菌属(ife^'m'a印.)KM1菌株为原料，由下述
纯化方纟去获得
(1) 制备粗酶液耶尔森氏菌属Ofe2^V7&印.)KM1菌株的发酵培养条件为温 度13"C， pH7.2，培养时间52小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；
(2) 硫酸铵沉淀粗酶液加硫酸铵至30-40%饱和度，离心取上清，继续加硫酸 铵至70_80%饱和度，离心弃上清，沉淀在磷酸盐缓冲液中透析过夜；
(3) S印hacry"HRS-100层析将透析的酶液离心，上清进行浓縮，上样于磷酸 盐缓冲液预平衡过的S印hacry11 HRS-100层析柱，洗脱，收集酶活性部分，浓縮冷 冻保存；
(4) Superdex G-75层析将浓縮的目的蛋白经离心处理后，上样于磷酸盐缓冲 液预平衡过的Superdex G-75层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯 酶。
低温碱性脂肪酶的纯化方法，以耶尔森氏菌属(yerw'm'a sp. ) KM1菌株为原 料，包括
(1)制备粗酶液耶尔森氏菌属(re2^'7^sp. ) KM1菌株的发酵培养条件为温 度13'C， pH7.2，培养时间52小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；(2) 硫酸铵沉淀粗酶液加硫酸铵至30-40%饱和度，离心取上清，继续加硫酸 铵至70-80%饱和度，离心弃上清，沉淀在磷酸盐缓冲液中透析过夜；
(3) S印hacry"HRS-IOO层析将透析的酶液离心，上清进行浓縮，上样于磷酸 盐缓冲液预平衡过的S印hacryM HRS-100层析柱，洗脱，收集酶活性部分，浓縮冷 冻保存；
(4) Superdex G-75层析将浓縮的目的蛋白经离心处理后，上样于磷酸盐缓冲 液预平衡过的Superdex G-75层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯
上述的纯化方法，步骤(1)中发酵^[牛优化；步骤(2)中分离纯化所用的缓冲液为 25mM磷酸盐缓冲液，pH7.0-8.0;步骤(4)中所得纯酶进一步电泳纯化，分离胶浓度 为12.5%，浓縮胶浓度为5°丄
本发明提供的低温细菌分离自一家屠宰场的冷库中。根据形态学特征、生理生 化特征及16S rRNA基因序列结果，将其鉴定为的耶尔森氏菌属(re/^'m'a sp.) 的一个菌株，命名为耶尔森氏菌属(ye7^VLZ'a sp. ) KM1。该菌产酶的pH范围是 4.0-9.5，最适pH为7.2;产酶的温度范围是4-37°C，最适产酶温度为13°C;产酶 时间范围为18-66小时，最佳产酶时间为54小时。
本发明的新菌株耶尔森氏菌属(rersj'm'a sp. ) KM1已经于2008年8月26日 在"中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"(中国北京)保藏， 保藏号为CGMCC No. 2637。
图1为KM1菌株产生的低MI旨肪酶的反应温度和相对酶活关系曲线； 图2为KM1菌株产生的低温脂肪酶的热稳定性曲线；
图3为KM1菌株产生的低MI旨肪酶的反应pH和相对酶活关系及pH稳定性曲线; 具体实駄式 实施例1:
小肠结肠炎耶尔森氏菌(化2^'/7& e/^eroco^'"ca) KM1菌株的分离筛选
及鉴定小肠结肠炎耶尔森氏菌(i^57Vw'se/7^r^70力'"ca) KM1菌株，分离自昆明东 站屠宰场的冷库。菌株筛选培养基为(g/L):胰蛋白胨，10;酵母提取物，5; NaCl， 10;橄榄油乳化液，2%;琼脂，20; pH7. 0-7. 2。
采用细菌系统鉴定方法对耶尔森氏菌属(rer幻'/L 'a sp. ) KM1菌株进行鉴定。 该菌的形态学特征如下菌落为圆形，边缘整齐，湿润，乳白色，粘稠，易挑取； 细胞为短杆状，革兰氏阴性菌。产酶的pH范围是4.0-9.5，最适pH为7.2;产酶 的温度范围是4-37"C，最适产酶温度为13'C;产酶时间范围为18-66小时，最佳 产酶时间为54小时。该菌生理生化特征如下能以葡萄糖、山梨醇、侧金盏花醇、 丙二酸盐和西蒙氏枸橼酸盐作为唯一碳源生长，不能以乳糖和卫矛醇作为唯一碳源 生长，不能利用尿素，不能产生H2S，赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和苯丙氨酸脱 羧酶反应为阴性。
根据形态学特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列结果，将其鉴定为的耶 尔森氏菌属(rerw'm'a sp.)的一个菌株，命名为耶尔森氏菌属(lfer幻'm'a sp.) 腿。
该新菌株耶尔森氏菌属(fe^'"ia印.)KM1已经于2008年8月26日在"中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心"(中国北京)保藏，保藏 号为CGMCC No. 2637。
实施例2:
低温脂肪酶的纯化
(1) 制备粗酶液耶尔森氏菌属Ofez^Vw'a印.)KM1菌株的发酵培养条f牛为温 度13t:， pH7.2， ±咅养时间52小时。将发酵液离心，取上清即为粗酶液。
(2) 硫酸铵沉淀粗酶液加硫酸铵至30-40%饱和度，离心取上清，继续加硫酸 按至70-80%饱和度，离心弃上清，沉淀在25mM， pH7. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液中透 析过夜。
(3) S印hacry11 HRS-100层析将透析的酶液离心，上清进行浓縮，上样于25mM， pH7. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液预平衡过的S印hacry11 HRS-100层析柱，流速为
0. 4ml/min，洗脱，收集酶活性部分，用10KDa的浓縮管于4*€离心收^||液，冷冻保存。检测蛋白浓度及酶活性，酶的纯化倍数为23. 2倍，回收率为30.2%。 (4) Superdex G-75层析将浓缩的目的蛋白经离心处理后，上样于25mM， pH7. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液预平衡过的Superdex G-75层析柱，流速为0. 4ml/min， 用25 mM， pH7. 0-8. 0的磷酸盐缓冲液洗脱，检测蛋白浓度及酶活性，收集酶活性 部分，用10KDa的浓縮管于4t:离心收集浓縮液。将浓縮的样品进行SDS-PAGE电泳 分析，分离胶浓度为12.5%，浓縮胶浓度为5%，得到单一条带，表明纯化的低温 脂肪酶已经达到电泳纯，分子量为34.3 1(0&。
后酶的纯化倍数为26倍，回收 率为10. 3%。
低温碱性脂肪酶活性的测定采用中华人民共和国行业标准(中华人民共和国 轻工业部，1993)。低温碱性脂肪酶的水解活力单位定义为以低温碱性脂肪酶水 解油脂，每分钟产生lmol低温碱性脂肪酸的酶量，定义为一个脂肪酶活力单位。 蛋白质浓度的测定采用LOWRY法进行测定(LOWRY. OH, 1951)。 SDS-PAGE垂直凝胶电泳按Laeramli法进行(Lae咖li U K， 1970)。
实施例3:
低温脂肪酶的怜性 ①最适酶活鹏
将酶液加到磷酸盐缓冲液(25 mM磷酸盐缓冲液，pH7.2)中，以,B为底物， 在0-7(TC范围内不同温度下测定KMl菌株所产脂肪酶的酶活。结果如图l所示，表 明该低温脂肪酶的最适酶活温度为37。C， (TC仍有近20%的活性，当温度超过4(TC 时，酶活性急剧下降，达到7(TC时残余酶活性不到鄉。，这一结果表明该脂肪酶具 剤氐温酶的典型特征，即酶的反应温度低。
②热稳定性
将酶液加到磷酸盐缓冲液(25 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.2)中，并在不同纟鹏的 恒温水浴中保温，在不同的时间(0-90min,取样间隔为15min)取样，然后按照 标准的酶活性测定方法测定酶活。鹏对酶稳定性的影响表示为在一定时间后残存 酶活性所占原来酶活性的百分比，KM1菌株所产低温脂肪酶的热稳定曲线如图2所 示，表明该低温脂肪酶在低温下a3。C和25t:)保持稳定的酶活性，而在37。C下保温60 min，残留酶活性为最大酶活性的50%，这说明该酶的热稳定很差，符号 低温酶的特征。 ③最适pH
用pH5. 0至pHll. 0的不同的缓冲液稀释酶液，分别加入相应pH的,B底物， 在37。C下测定酶活力，结果如图3所示，表明KM1菌株所产的低温脂肪酶在pH9. 0 时的酶活性最高。
pH稳定性
将酶液加到不同pH的缓冲液中，并在4r保温10小时，在不同的时间取样， 然后按照标准的酶活性测定方法测定酶活。pH对酶稳定性的影响表示为在一定时间 后残存酶活性所占原来酶活性的百分比，KM1菌株所产低温脂肪酶的pH稳定性如图 3所示，表明KM1菌株所产的低温脂肪酶在pH7. 2-10. 0保持稳定。
⑤ 有机溶剂对酶活性的影响
将酶液加到不同浓度(0-80%)的有机溶剂中，并在4"C保温10小时，有机溶 剂分别为甲醇、乙醇、乙腈和二甲基亚砜(DMSO)。以,B为底物，有机溶剂对酶 活性的影响表示为在一定时间后残存酶活性所占原来酶活性的百分比，有机溶剂对 KM1菌株所产低温脂肪酶的影响如表1所示，低浓度的有机溶剂(10%)对该低温月旨 肪酶有激活作用，而且当甲醇的浓度达到50%时，KM1菌株所产低纟显脂肪酶仍然保 留62.4%的活性，因此该酶是制备生物柴油的良好材料。KM1菌株所产低温脂肪酶 对有机溶剂的耐受性使得其在有机化工合成工业具有一定的应用潜力。
⑥ 酶促反应动力学
将酶液加到磷酸盐缓冲液中，在不同的底物浓度(,B为0. 4-4. OmM，间隔为 O.顿)和》鹏梯度下(4-6(TC)保温IO min，测定相应酶活。将不同温度下，利 用底物浓度的倒数和反应速率的倒数做曲线，计算相应的他和Jcat，并计算出活 化能(泡)。如表2所示，表明KM1菌株所产的低温脂肪酶的Jn在37。C时最小，说 明在37'C时酶与底物的结合能力最强，而且在4-37r，随着温度升高，Jn逐渐降 低，这是低温酶具有的典型特征。KM1菌株所产的低温脂肪酶的压值为31.0 KJ， mo1—1，高于目前报道的很多低温酶的值，这进一步表明纯化的脂肪酶为典型的低温酶。
表l有机^IJ对KM1菌株所产低MI旨肪酶的影响
_相对活力(％)_
有机總u浓度(％) _^_^_^_
乙腈 101.4 13.2 0 0
甲醇 144.5 106.9 62.4 16.8
乙醇 114.5 65.5 44.5 19.1
二甲基亚砜 105 96 53.3 39.8
表2在不同的底物浓度和M梯度下的酶活和活化能
ATm(mmol' L-1)H(腿ol化'S-1)五a(KJ-mor1)
420.810.25x1041.19x102
1318.890.53x1042.81xl02
2517.250邻x1045.68x102
1.03x10431.0
3716.586.21 x102
5017.960.75x1044.18x102
6018.070.70x1043.88x10权利要求
1、低温细菌菌株耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)KM1，其保藏号为CGMCCNo.2637。
2、 低温碱性脂肪酶，由低温细菌菌株耶尔森氏菌属(rerw'/7J'a印.)KMl产生。
3、 如权利要求2所述的低温碱性脂肪酶，具有以下酶学性质(1) 最适酶活温度为37。C;(2) 最适pH为9. 0，在pH7. 2-10. 0保持稳定;(3) 低温脂肪酶的分子量为34. 3 Kda;(4) 低温脂肪酶能耐受50%-80%的部分有机溶齐1』，如甲醇、乙醇及DMS0。
4、 权利要求2的低i^碱性脂肪酶，以耶尔森氏菌属(re/^'m'a sp. ) KM1菌株 为原料，由下述纯化方法获得(1) 制备粗S每液耶尔森氏菌属(re/^'m'a印.)KM1菌株的发酵培养条件为温 度13'C， pH7.2，培养时间52小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；(2) 硫酸铵沉淀粗酶液加硫酸铵至30-40%饱和度，离心取上清，继续加硫酸 铵至70-80%饱和度，离心弃上清，沉淀在磷酸盐缓冲液中透析过夜；(3) S印hacry"HRS-100层析将透析的酶液离心，上清进行浓縮，上样于磷酸 盐缓冲液预平衡过的S印hacry11 HRS-100层析柱，洗脱，收集酶活性部分，浓縮冷 冻保存；(4) Superdex G-75层析将浓縮的目的蛋白经离心处理后，上样于磷酸盐缓冲 液预平衡过的Superdex G-75层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯
5、 权利要求2低^^碱性脂肪酶的纯化方法，以耶尔森氏菌属(re/^'m'asp.) KM1菌株为原料，其步骤包括(1) 制备粗酶液耶尔森氏菌属(Ferw^'ssp. ) KMl菌株的发酵培养条件为温 度13。C， pH7.2，培养时间52小时，将发酵液离心，取上清即为粗酶液；(2) 硫酸铵沉淀粗酶液加硫酸铵至30-40%饱和度，离心取上清，继续加硫酸 铵至70-80%饱和度，离心弃上清，沉淀在磷酸盐缓冲液中透析过夜；(3) S印hacrymHRS-100层析将透析的酶液离心，上清进行、MI，上样于磷酸盐缓冲液预平衡过的S印hacry11服S-IOO层析柱，洗脱，收集酶活性部分，浓縮冷 冻保存；(4) Superdex G-75层析将浓縮的目的蛋白经离心处理后，上样于磷酸盐缓冲 液预平衡过的Superdex G_75层析柱，洗脱，收集酶活性部分，透析过夜，即为纯 酶。
6、 根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于在步骤l冲发酵条件的优化。
7、 根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于在在步骤(2)中分离纯化所用 的缓冲液为25 mM磷酸盐缓冲液，pH7. 0-8. 0。
8、 根据权利要求4所述的纯化方法，其特征在于在进一步将步骤(3)《导到的纯 酶样品进行SDS-PAGE电泳分析，分离胶浓度为12.5%，浓縮胶浓度为5%。
全文摘要
本发明公开了低温细菌菌株耶尔森氏菌属(Yersinia sp.)KM1，以及由其产生的耐有机溶剂的低温碱性脂肪酶，和其分离纯化方法。纯化方法包括发酵上清液的硫酸铵沉淀、用10KDa的超滤管进行离心浓缩及进行Sephacry<sup>TM</sup> HRS-100层析，最后进行Superdex G-75层析，最终得到电泳纯的低温碱性脂肪酶。本发明纯化的低温碱性酶作用温度低、具有较宽的pH适应范围、对有机溶剂高耐受性，因此在洗涤剂、食品加工、制药、生物柴油制造等领域具有巨大的应用潜力。
文档编号C12N1/20GK101486979SQ20081023362
公开日2009年7月22日 申请日期2008年11月24日 优先权日2008年11月24日
发明者井申荣, 季秀玲, 林连兵, 陈贵元, 魏云林 申请人:昆明理工大学