专利名称：用重组耶尔森氏菌将蛋白质送递到真核生物细胞中的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组耶尔森氏菌及其将蛋白质送递到真核生物细胞中的用途。
耶尔森氏菌引发人和啮齿类动物疾病，从肠炎和淋巴结炎到鼠疫。耶尔森氏菌属包括3个种小肠结肠炎耶尔森氏菌，其是人类最盛行的耶尔森氏菌属的种，并且其引起宽范围肠胃综合症；假结核耶尔森氏菌，其引起腺炎和败血症；和鼠疫耶尔森氏菌，其是鼠疫的致病原。
除了感染途径不同外，这三种耶尔森氏菌属的种都具有人或啮齿类动物宿主非特异性免疫应答和在宿主淋巴组织中增生的抗性能力。病理解剖学检查表明在感染动物的炎症或实质细胞内没有检查到耶尔森氏菌(Simonet等，(1990)，感染、免疫(Infect.Immun.)58:841-845)。与体内这些观察相吻合，耶尔森氏菌是巨噬细胞和多形核白细胞体外吞噬作用抗性的。参见Cornelis等的综述，(1997)，微生物分子学(Mol.Mierobiol).23(5):861-867。小肠结肠炎耶尔森氏菌还具有进入某些培养的上皮细胞的能力，这一过程通常称之为侵入(Miller等(1988)，感染、免疫(Infect.Immun.)56:1242-1248)。
遗传学研究表明一种70kb质粒(pYV)决定耶尔森氏菌的致病力，所述质粒编码和调控称之为Yops(对应)Yersinia outer proteins)的一组蛋白质的产生。这些Yops形成整合的抗宿主系统，该系统使得耶尔森氏菌与宿主细胞表面胞外粘着并且接着将一组毒性效应子蛋白注入宿主细胞的细胞溶胶。近期的研究进一步表明，这样一种抗宿主系统，也称之为“耶尔森氏菌致病子(virulon)”，由下面4个元件组成(ⅰ)专用于从细菌细胞分泌Yop蛋白质的称之为Ysc的接触或Ⅲ型分泌系统；(ⅱ)由YopB,YopD和可能的其它蛋白质例如LcrV组成的用于将效应子蛋白转运到真核宿主细胞中的一组转运体；(ⅲ)控制元件和识别系统(YopN和YopG)；和(ⅳ)注入(或转运)到真核宿主细胞并且破坏这样的宿主细胞的功能的一组“效应子蛋白”，包括YopE,YopH,YopO/YpkA,YopM和YopP/YopJ。这些基因的转录受温度和与真核细胞接触两者的控制。参见Cornelis等(1997)的综述。
效应子蛋白以多种方式破坏宿主细胞的功能。23kd的YopE是破坏培养的海拉细胞的肌动蛋白-微丝结构的细胞毒素(Rosquvist等，微生物分子学4(Mol.Microbiol.4),657-667)。Rosquvist等(1991)，感染、免疫59(Infect.Immun.59):4562-4569)。51kdYopH是对感染的巨噬细胞的酪氨酸-磷酸化蛋白起作用的与真核生物的PTP酶相关的蛋白质酪氨酸磷酸化酶(PTP酶)(Hartland等(1994)感染、免疫62(Infect.Immun.62):4445-4453)。可能是这种作用的后果，YopH通过抑制培养的巨噬细胞细菌摄入和氧化裂解(Rosquvist等(1988)，感染、免疫56(Infect.Immun.56):2139-2143；Bliska等(1995)，感染.免疫63(Infect.Immun.63):681-685)。YopO(或YpkA)是定向真核生物细胞的质膜内表面的并且可能与真核生物细胞的信号转导途径相互作用的81kd丝氨酸/苏氨酸激酶(Hakansson等(1996)，微生物分子学20(Mol.Microbiol.20)，593-603)。YopM是具有12个富亮氨酸重复基序的酸性41kd蛋白质，提示YopM可能结合凝血酶并且与干扰感染反应的血小板介导作用(Leung等(1989)，细菌学杂志(J.Bacterial.)171:4623-4632).YopP涉及巨噬细胞程序死亡的诱导(Mills等(1997)，美国国家科学院院刊(Proc.Acad.Natl.Sci.USA)94:12638-12643)。
研究了这些效应子蛋白的分子结构来确定其分泌和转运所需要的每一个效应子蛋白中的元件。为了该目的，通过融合用某些报道分子酶例如百日咳博德特氏杆菌(Borderella pertussis)环细胞溶素的钙调蛋白-激活的腺苷酸环化酶区(或Cya)截短的不同长度的Yop效应子蛋白基因工程方法制备了杂合蛋白，通过以报道分子蛋白的酶活性为基础的测试可以检测成功的分泌和/或转导作用。通过应用这一研究，Sory等公开了小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE和YopH是由三个区组成的模块分子，即分泌所需要的N-末端区，转运到细胞中所需要的转运区，和是毒性效应子活性原因的C-末端催化区(Sory等，(1995)，美国国家科学院院刊(Proc.Acad.Natl.Sci.USA)92:11998-12002)。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopM证实了相同的区组构(Boland等，(1996),EMBOJ.15:5191-5201)。
本发明提供用于将蛋白质安全地运送到真核生物细胞中的重组耶尔森氏菌。这样的耶尔森氏菌在功能效应子蛋白的产生力方面不强，但是被赋与了功能分泌和转运系统。本发明进一步提供与这样的用于将期望的蛋白质安全而有效地运送到真核生物细胞中的突变体耶尔森氏菌相关使用的表达载体。该项研究不仅用于研究给定蛋白质的功能，而且还用于设计治疗方案。例如，可以使用本发明的重组耶尔森氏菌将病原体蛋白质例如肿瘤相关蛋白，寄生虫抗原或者病毒抗原送递到呈递抗原细胞以诱导对于这样一种蛋白质特异性的免疫应答。
大多数进行性生长的肿瘤细胞可能表达免疫原性肿瘤相关抗原(TAAs)，也称之为排斥抗原(TRAs)。TRAs和其它抗原表位一样通过MHC分子存在于肿瘤细胞的表面，并且在体内和体外表现出诱导CTL应答。参见，例如，Bruggen等，(1991)Science254:1643-1647。但是，这种表达TRA的肿瘤细胞不激发体内可靠的能控制恶性细胞生长的抗肿瘤免疫应答。Boon等(1992)癌症研究(Cancer Surveys)13:23-37；T.Boon(1993)Int.J.Cancer54:177-180；T.Boon(1992)癌症研究进展(Advances Cancer Res.58:177-209)。
鉴定了多种编码肿瘤排斥抗原前体(或TRAPs)基因，它们在肿瘤细胞中被加工为TRAs。这样的编码TRAP的基因包括下面成员MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125，突变的原癌基因例如p21ras，突变的肿瘤抑制蛋白基因例如p53，肿瘤相关病毒抗原例如HPV16 E7。参见，例如Eynde和Bruggen(1997)的综述，Curr.Opin.Immunol.9:684-693,Sahin等(1997)Curr.Opin.Immunol.9:709-716，和Shawler等(1997)药物学进展(Advances in Pharmacology)40:309-337,Academic Press,Inc.:San Diego.California。这些基因的鉴定使重组产生TRAs或TRAPs，它们可以接下来用作治疗各种各样的癌症的疫苗。
本发明涉及重组耶尔森氏菌将期望的蛋白质送递到真核生物细胞中的用途。特别地，本发明的重组耶尔森氏菌用于将蛋白质或者其衍生物送递给呈递抗原细胞。根据本发明，呈递抗原细胞在接受送递后存在能被T细胞识别的抗原表位。因此，本发明的重组耶尔森氏菌可以应用在各种各样的免疫诊断或治疗方法中。
本发明通过下面的公开进一步详细阐述。
本发明涉及重组耶尔森氏菌及其将蛋白质送递到真核生物细胞中的用途。
本发明的一个实施方案提供功能效应子蛋白产生力不强的突变耶尔森氏菌菌株。本发明优选的突变耶尔森氏菌菌株是指定为yopEHMOP的五重突变体菌株。
本发明的另一个实施方案提供用于将异源蛋白质送递给真核生物细胞的表达载体。根据本发明，这样一种表达载体特征在于(自5’至3’方向)一个启动子，编码送递信号的第一核酸序列，融合在第一核酸序列上的编码要送递的异源蛋白质的第二核酸序列。
根据本发明的该实施方案，所述启动子优选是选自耶尔森氏菌致病子基因；更优选地，是编码效应子的基因；更优选地，是YopE基因。送递信号是选自耶尔森氏菌效应子的多肽序列，包括YopE,YopH,YopO/YpkA,YopM和YopP/YopJ。这样的送递信号可以由耶尔森氏菌的分泌和转运系统识别。本发明的异源蛋白质包括天然存在的蛋白质或者其部分，例如肿瘤相关蛋白或者病原体的已知抗原。本发明的异源蛋白质还包括人工设计的蛋白质，例如蛋白质的符合读框地的融合或者蛋白质的部分。
本发明的另一个实施方案提供重组耶尔森氏菌，即用本发明的表达载体进一步转化的上述突变体菌株耶尔森氏菌。这样的重组耶尔森氏菌优选用于将异源蛋白质送递到真核生物细胞中。优选的真核生物细胞是能呈递免疫原性表位的呈递抗原细胞，所述免疫原性表位自送递的异源蛋白质衍生。
本发明的另一方面，用于诱导免疫应答(细胞免疫应答，或者体液免疫应答，或者两者的组合)的免疫原性组合物和方法中涉及这样的重组耶尔森氏菌。
本发明的另一方面，在用于评价接种方案的有效性的体外方案中可以使用本发明的重组耶尔森氏菌。本发明的重组耶尔森氏菌还可以在来自体内的方案中使用以产生特异性CTLs和以使用这样的CTLs用于治疗各种病症，例如肿瘤或者病原体感染。本发明的重组耶尔森氏菌还可以在体内方案中使用，即作为重组疫苗，来治疗患病(例如肿瘤或病原体感染)的患者。
图1图示了表达载体pMS111-MAGE-1(YopE130-MAGE1)的质粒图。
图2(A)图示用与重组耶尔森氏菌混合的EBV-转化的人B细胞(HLA-A1)刺激CTL82/30的过程；(B)图示激活的CTLs释放的IFN-γ的量。
图3图示小肠结肠炎耶尔森氏菌YopM基因的序列。
图4图示小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE基因的序列。
图5图示小肠结肠炎耶尔森氏菌YopH基因的序列。
图6图示小肠结肠炎耶尔森氏菌YopP基因的序列。
图7图示小肠结肠炎耶尔森氏菌YopP基因的序列。
本发明涉及重组耶尔森氏菌及其将蛋白质送递到真核生物细胞中的用途。
特别地，本发明提供功能效应子蛋白产生力不强的突变耶尔森氏菌菌株。本发明进一步提供表达载体，当转化到上述突变体菌株耶尔森氏菌中时，其允许将期望的蛋白质，例如MAGE-1蛋白质，送递到真核生物细胞例如EBV-转化的人B细胞中。本发明公开了当接受送递的蛋白质后，呈递抗原细胞处理送递的蛋白质，并且在MHC分子引发对于送递的蛋白质特异性的免疫应答的情况下，递呈抗原性表位。例如，从本发明重组耶尔森氏菌摄取MAGE-1蛋白质后，人B细胞被对于MAGE-1表位特异性的CTL克隆所识别。因此，本发明提供对于将期望的蛋白质送递到真核生物细胞中具有减小的毒性的有效重组耶尔森氏菌系统。
这里所使用的术语“耶尔森氏菌”指耶尔森氏菌属的所有的种，包括小肠结肠炎耶尔森氏菌，假结核耶尔森氏菌和鼠疫耶尔森氏菌。
为了本发明的目的，这里所使用的术语“重组耶尔森氏菌”指用本发明表达载体基因工程转化的耶尔森氏菌。
这里所使用的术语“送递”指将来自耶尔森氏菌的蛋白质运送给真核生物细胞，包括在耶尔森氏菌中表达蛋白质，从这样的耶尔森氏菌分泌表达的蛋白质和通过这样的耶尔森氏菌将分泌的蛋白质转运到真核生物细胞的细胞溶胶中。因此，“送递信号”指耶尔森氏菌的分泌和转运系统可以识别的多肽序列并且指将蛋白质从耶尔森氏菌送递给真核生物细胞。
如这里所使用的，蛋白质的“分泌”指这样的蛋白质向外通过耶尔森氏菌的细胞膜的转运。蛋白质的“转运”指这样的蛋白质跨跃真核生物细胞的质膜送递到这样的真核生物细胞的细胞溶胶中。
这里所使用的“真核生物细胞”，耶尔森氏菌所粘附的表面，也称之为“靶细胞”或“靶真核生物细胞”。
本发明的一个实施方案提供了功能效应子蛋白产生力不强的突变体耶尔森氏菌菌株。
耶尔森氏菌的效应子蛋白，即通常转运到靶真核生物细胞的细胞溶胶中的耶尔森氏菌致病子蛋白对于靶细胞是有毒性的。因此，“功能效应子蛋白”指具有确定的催化活性并且能激发对于靶细胞的特异性毒性的效应子蛋白。
因此，本发明的突变体耶尔森氏菌用于以减小的毒性，即不完全废除或杀死靶细胞的毒性，将蛋白质送递给真核生物细胞。为了送递蛋白质的目的，本发明的突变体耶尔森氏菌的分泌和转运系统需要是完整的。
从小肠结肠炎耶尔森氏菌克隆了5个效应子基因，它们是YopE,YopH,YopO,YopM和YopP(图3-7)。从假结核耶尔森氏菌克隆了等价效应子基因，分别命名为YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。从鼠疫耶尔森氏菌克隆了一些效应子基因。这些Yop基因的核酸序列对于本领域技术人员来说是可以得到的，例如从Genebank数据库得到。
为了本发明的目的，用斜体字字母表示编码效应子的基因以区别于效应子蛋白。用小写字母表示突变体效应子基因。例如YopE指YopE基因编码的效应子蛋白。YopE代表野生型基因，而YopE代表具有突变的基因。
根据本发明，突变体耶尔森氏菌菌株可以通过在至少一个效应子编码基因中诱导至少一个突变而产生。优选地，这样的效应子编码基因包括YopE,YopH,YopH/YpkA,YopM和YopP/YopJ。专业技术人员可以使用任何标准技术在这些Yop基因中产生突变。Sambrook等，描述了一般的这样的技术。参见Sambrook等，(1989)分子克隆实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，冷泉港实验室出版冷泉港，纽约。
术语“突变”在这里用作一般术语并且包括单一碱基对和多个碱基对的变化。这样的突变可以包括取代，移码突变，缺失和截短。
根据本发明，在效应子编码基因的启动子区中可以产生突变，这样消除所述效应子基因的表达。
在效应子编码基因的编码区中也可以产生突变，这样消除编码的效应子蛋白的催化活性。效应子蛋白的“催化活性”指效应子蛋白的抗靶细胞功能，即毒性。这样的活性由效应子蛋白的催化结构区中的催化基序控制。效应子蛋白的催化结构区和/或催化基序的鉴定方法在本领域技术人员知识范围之内。参见，例如，Sory等(1995),Boland等(1996)和Cornels等(1997)。
因此，本发明的一个优选实施方案是缺失整个催化结构区。另一种优选的突变是效应子编码基因中的移码突变，使得从这样的“移码”基因表达的蛋白质产物中不存在催化结构区。最优选的突变是整个编码区缺失的突变。
本发明还包括其它突变，例如小的缺失或碱基对的取代，这在效应子蛋白的催化基序中产生，导致给定的效应子蛋白的催化活性的破坏。
可用许多的方法将Yop基团中产生的突变导入耶尔森氏菌。一种这样的方法涉及将突变的Yop基因(即yop基因)克隆到“自发失活”载体中，其能通过等位变化将突变的yop基因导入耶尔森氏菌。这样的“自发失活”载体描述于Kaniga等(1991)基因(Gene)109:137-141和Sarker等(1997)微生物分子学(Mol.Microbiol)23:409-411。在该方法中，多个yop基因产生的突变可以依次导入耶尔森氏菌，得到多突变重组耶尔森氏菌。这些突变的yop序列导入的顺序不是重要的。
本发明优选的突变体耶尔森氏菌菌株是五重突变型耶尔森氏菌菌株，其中所有的效应子编码基因是突变的，使得得到的耶尔森氏菌不再产生任何功能效应子蛋白。对于小肠结肠炎耶尔森氏菌，这样的五重突变型耶尔森氏菌菌株标记为yopEHOMP或者对于假结核耶尔森氏菌标记为yopEHAM。这样的yopEHOMP菌株的一个例子是小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40(pABL403)。
在一些条件下，可能期望只是一些而不是全部的效应子yop基因突变。例如，当送递要指向巨噬细胞时，YopH优选不突变，因为YopH被认为是通过抑制巨噬细胞吞噬细胞裂解作用。Rosqvist等(1988)和Rosqvist等(1989)。因此，本发明进一步涉及五重突变型耶尔森氏菌之外的多突变耶尔森氏菌，例如双重突变型，三重突变型和四重突变型耶尔森氏菌。
或者，其中在野生型YopH基因可以通过各种已知转化方法(下文进一步描述)导入五重突变型Y.yopEHOMP菌株情况下，五重突变型耶尔森氏菌菌株yopEHOMP仍然可以用于对巨噬细胞的送递。在该方法中，可以产生多突变耶尔森氏菌菌株，其中期望的一组Yop基因发生突变，使得只有感兴趣的蛋白质送递到靶细胞中。
本发明的另一方面涉及与本发明突变体耶尔森氏菌菌株组合使用用于将期望的蛋白质送递到真核生物细胞中的表达载体。根据本发明，这样一种载体特征在于(自5’至3’方向)一个启动子，编码送递信号的第一核酸序列，融合到第一核酸序列上的编码要送递的异源蛋白质的第二核酸序列。
根据本发明，表达载体的启动子优选选自耶尔森氏菌致病子基因。“耶尔森氏菌致病子基因”指耶尔森氏菌pYV质粒上的基因，其表达受温度和与靶细胞接触两者的控制。参见Cornelis等(1997)综述。这样的基因包括分泌机制元件的编码基因(Ysc基因)，转运体编码基因(YopB,YopD和LcrV)，调控元件的编码基因(YopN和LcrG)和效应子编码基因(YopE,YopH,YopO/YpKA,YopM和YopP/YopJ)。
在本发明的优选实施方案中，所述启动子来自效应子编码基因，选自YopE,YopH,YopO/YpKA,YopM和YopP/YopJ之一。更优选地，启动子来自YopE。
进一步根据本发明，编码送递信号的第一DNA序列与所述启动子操作连接。
上文描述的“送递信号”指可以被耶尔森氏菌的分泌和转运系统识别从而指导蛋白质分泌和转运到真核生物细胞中的多肽。
根据本发明，这样一种多肽选自效应子蛋白。所述效应子蛋白包括YopE,YopH,YopO/YpkA,YopM和YopP/YopJ。优选地，效应子蛋白是YopE。更优选地，效应子蛋白是小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE。
本领域技术人员熟悉能送递一种蛋白质的效应子蛋白的多肽序列的鉴定方法。例如，Sory等(1994)描述了这样一种方法。简要地说，来自Yop蛋白的不同部分的多肽序列可以符合读框地融合到报道分子酶上，例如百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)环细胞溶素的钙调蛋白-激活的腺苷酸环化酶区(或Cya)。通过在感染的真核生物细胞中出现导致cAMP蓄积的环化酶活性指示将Yop-Cya杂合蛋白送递到真核生物细胞的细胞溶胶中。这样的送递信号多肽的例子包括来自小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE130(YopE的N-末端130个氨基酸)，YopE50,YopM100和YopH71。
通过应用这项研究，如果期望，本领域技术人员可以确定要求的最小序列，即长度最短的能送递一种蛋白质的连续氨基酸序列。参见，例如，Sory等(1994)。因此，本发明优选的送递信号由至少能送递一种蛋白质的Yop效应子蛋白的氨基酸最小序列组成。
进一步根据本发明，编码异源蛋白质的第二DNA序列与本发明载体中的第一DNA序列符合读框地融合，以送递到真核生物细胞中。
这里所使用的术语“异源蛋白质”指一种不是耶尔森氏菌Yop蛋白的蛋白质。“Yop蛋白”指分泌的耶尔森氏菌致病子蛋白质，包括转运体和效应子。
根据本发明，“一种异源蛋白质”包括天然存在的蛋白质或者其部分。术语“一种蛋白质的部分”包括长度足以是抗原性的一种蛋白质的肽或多肽片段。优选地，这样一个片段由一种蛋白质的至少8个或9个氨基酸组成。本发明中使用的“一种异源蛋白质”也包括基因工程制备的蛋白质或者其片段，例如两种或多种天然存在的蛋白质或者其部分，多表位(两种或多种肽表位的符合读框地的融合体)的融合体，如Thompson等(1995)在美国国家科学院院刊92:5845-5849所例示的。
融合的第一和第二DNA序列表达的蛋白质也称之为“融合蛋白”或者“杂合蛋白”，即耶尔森氏菌送递信号和一种异源蛋白的杂合体。
对于可以送递的异源蛋白没有特殊限定。本发明特别涉及蛋白质，例如已知的肿瘤相关蛋白，已知的病原体抗原和细胞因子。
“肿瘤相关蛋白”指在肿瘤中特异性表达的一种蛋白质或者相对于正常组织在肿瘤中异常水平表达的一种蛋白质。这样的肿瘤相关蛋白包括但不限于下面的成员MAGE家族，BAGE家族(例如BAGE-1),DAGE/Prame家族(例如DAGE-1),GAGE家族，RAGE家族(例如RAGE-1),SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125，突变的原癌基因例如p21ras，突变的肿瘤抑制蛋白基因例如p53，肿瘤相关病毒抗原(例如HPV16 E7),HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4,和HOM-TES-11。MAGE家族的成员包括但不限于MAGE-1,MAGE-2,MAGE-11。GAGE家族的成员包括但不限于GAGE-1,GAGE-6。参见，例如Van den Eynde和Van denBruggen(1997)的综述，Curr.Opin.Immunol.9:684-693,Sahin等(1997)Curr.Opin.Immunol.9:709-716，和Shawler等(1997)。这些蛋白质表现出与某些肿瘤相关，例如黑素瘤，肺癌，前列腺癌，乳腺癌，结肠癌和其它癌症。
根据本发明也可以使用自病原体衍生的多种已知抗原。本发明涉及的病原体包括病毒，细菌，寄生虫和真菌。致病原的特征抗原的具体例子包括流感病毒核蛋白(残基218-226，根据F.等(1997)J.Virol.71:2715-2721)，来自副流感病毒和淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒的抗原(参见An等(1997)J.Virol.71:2292-2302)，丙肝病毒的B1蛋白(Bruna-Romero等(1997)Hepatology25:470-477),HIV的包膜糖蛋白gp160(Achour等(1996)J.Virol.70:6741-6750),Plasmodium berghei的第252-260位氨基酸或者环子孢子蛋白(Allsopp等(1996)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)26:1951-1958),A型流感病毒核蛋白(残基366-374,Nomura等(1996)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)193:4149)，单核细胞增生利斯特氏菌的李斯特菌溶胞素O蛋白(残基91-99,An等(1996)感染.免疫(Infect.Immun.)64:1685-1693)，人16型乳头瘤病毒E6蛋白(残基131-140,Gao等(1995)免疫学杂志(J.Immunol.)155:5519-5526)和人16型乳头瘤病毒E7蛋白(残基21-28和48-55,Bauer等(1995)Scand.J.Immunol.42:317-323)，呼吸道合胞病毒(残基82-90和81-95,Hsu等(1995)免疫学(Immunology)85:347-350)，单纯疱疹病毒1型核糖核苷酸还原酶(参见Salvucci等(1995)J.Gen.Virol.69:1122-1131)和轮状病毒VP7蛋白(参见Franco等(1993)J.Gen.Virol.74:2579-2586),P.falciparum抗原(引起疟疾)和乙肝表面抗原(Gilbert等(1997)自然生物技术(Nature Biotech)15:1280-1283)。
因此可以将上述蛋白质的编码序列克隆到本发明表达载体中用于送递。
本发明中也可以使用多种小的抗原性肽的编码序列。本领域技术人员可以容易地确定产生免疫原性肽所要求的片段的长度。或者，技术人员也可以使用已知激发特异性T细胞应答的肽的编码序列，例如根据美国专利5462871，美国专利5558995，美国专利5554724，美国专利5585461，美国专利5591430，美国专利5554506，美国专利5487974，美国专利5530096，美国专利5519117公开的肿瘤相关抗原性肽(TRAs)。表1中提供了TRAs的例子。也参见Eynde和Bruggen(1997)和Shawler等(1997)的综述。也可以使用致病原的抗原性肽，例如Gilbert等(1997)公开的那些。
根据上文所述，全长天然存在的蛋白质的编码序列，天然存在的蛋白质的一部分，或者天然存在的蛋白质的部分的组合，或者不同的天然存在的蛋白质或者来自不同蛋白质的部分的组合的编码序列都可以在本发明中使用。例如，可以使用多表位的编码序列，例如Thomson等(1995)描述的那些。优选地，本发明表达载体的第二DNA序列编码一种蛋白质的至少一个表位。“表位”指至少8个或9个氨基酸的肽。
本领域技术人员熟悉编码一种蛋白质的一部分的DNA片段的制备技术，或者在读框内将一种蛋白质的一部分的编码DNA序列与另一种蛋白质的一部分的编码DNA序列连接的技术等等。
本发明的载体可以包括其它序列元件，例如3’末端序列(包括终止密码子和聚腺苷酸序列)，或者赋与药物抗性从而选择了本发明载体的耶尔森氏菌转化体的基因。
本发明的表达载体可以用多种已知方法转化到耶尔森氏菌中。为了本发明目的，导入表达载体的转化方法包括但不限于电穿孔，磷酸钙介导的转化，接合，或者它们的组合。例如，可以通过标准电穿孔技术将载体转化到第一细菌菌株中。随后，通过接合(也称之为“转移”的方法)将这样一种载体从第一细菌菌株转移到耶尔森氏菌中。可以例如用抗生素选择耶尔森氏菌转化体(即吸收了所述载体的耶尔森氏菌)。这些技术是本领域公知的。参见，例如，Sory等(1994)。
本发明的一个优选实施方案涉及用用于将上述异源蛋白送递到真核生物细胞中的表达载体转化的上述突变体耶尔森氏菌菌株的耶尔森氏菌。
因此，本发明涉及将上述异源蛋白送递到真核生物细胞中的方法。
本发明涉及可以被本发明重组耶尔森氏菌定向的宽范围的真核生物细胞。
“定向”指耶尔森氏菌与真核生物细胞的胞外粘着。
特别地，本发明涉及呈递抗原细胞。“呈递抗原细胞”在这里表示至少一个Ⅰ类或Ⅱ类MHC决定簇，并且可以包括已知为专职性(professianal)呈递抗原细胞的那些细胞，例如巨噬细胞，树突细胞和B细胞。其它专职性呈递抗原细胞包括单核细胞，边缘区Kupffer细胞，小胶质细胞，朗氏细胞，交错树突细胞，小结树突细胞和T细胞。根据本发明也可以使用兼性呈递抗原细胞。兼性呈递抗原细胞的例子包括星形胶质细胞，滤泡细胞，内皮细胞和成纤维细胞滤如这里所使用的，“呈递抗原细胞”包括专职性型和兼性型呈递抗原细胞两者。
也可以从自哺乳动物例如人或啮齿类获得的组织或者血液(含有外周血单核细胞)样品分离呈递抗原细胞。也可以使用从这样的样品建立的细胞系。建立细胞系的方法是本领域公知的。也可以从美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville,Maryland,20852-1776直接获得一些细胞系。可以使用正常和恶性细胞两者。
根据本发明的优选实施方案，呈递抗原细胞表达的MHC决定簇与所涉及的哺乳动物表达的那些相容，并且这些MHC决定簇至少之一能呈递一个或多个自送递的蛋白质衍生的抗原表位。
本领域技术人员还熟悉确定呈递抗原细胞表达的MHC分子是否与所涉及的哺乳动物受试者相容的方法，例如公知的HLA-型方法。参见Coligan等人的教导(1994),Current Protocols in Immunology JohnWiley & Sons Inc纽约市，纽约州。
技术人员通过本领域大量的教导能确定呈递特殊抗原的MHC分子，例如美国专利5405940教导确定HLA-A1作为MAGE-1肽，EADPTGHSY的呈递分子；美国专利5558995教导确定HLA-Cw1601用于呈递另一种MAGE-1肽，SAYGEPRKL；美国专利5530096教导确定HLA-A2作为酪氨酸酶肽，MLLAVLYCL的呈递分子。在定向的真核生物细胞没有表达期望的HLA或MHC分子的情况下，编码该分子的基因可以通过公知的转化方法或转染方法导入真核生物细胞。
进一步根据本发明，可以通过使真核生物细胞在合适的条件下接触重组耶尔森氏菌来实现蛋白质的送递。考虑到致病子基因的诱导表达和转运的条件，各种各样的参考和技术对于本领域技术人员来说是常规上可得到的，所述条件包括期望的温度，Ca++浓度，耶尔森氏菌和靶细胞混合的方式等等。参见，例如，Cornelis,Cross talk betweenYersinia and eukaryotic cells,Society for GeneralMicrobiology Symposium,55；MoCRAE,SAUNDERS,SMYTH,STOW(编),宿主病原体相互作用的分子学方面(Molecular aspects of host-pathoge interactions)剑桥大学出版社，1997。条件可以根据要定向的真核生物细胞的类型而变化，例如用于定向人上皮癌海拉细胞的条件(Sory等(1994))；用于定向小鼠胸腺瘤或黑素瘤细胞的条件(Starnbach等(1994)免疫学杂志(J,Immunol.)153:1603)；用于定向小鼠巨噬细胞的条件(Boland等(1996))。本领域技术人员通过常规技术可以确定这样的变化。
本领域技术人员还可以使用确定融合蛋白的送递是否成功的多种测试。例如，可以用同位素或者免疫荧光素标记融合蛋白，或者通过免疫荧光素接合的抗体检测，如Rosqvist等(1994)EMBO J.13:964公开的。测定也可以以送递的蛋白质的酶活性为基础，例如，Sory等(1994)描述的测试。测定也可以以送递的蛋白质的抗原性为基础。例如，通过对MAGE-1表位特异性的CTL细胞对这样的定向B细胞的识别可以测定MAGE-1蛋白送递到EBV-转化的人B细胞中。接着通过多种测试，包括测试IFN-γ自激活的CTLs分泌或者自溶解的靶细胞释放Cr51，可以测定这样的CTL识别。对于这样的测定也可以使用象使用抗送递蛋白质的特异性抗体的蛋白质印迹分析，PCR原位杂交，或者ELISPOT(MabtechAB,Sweden)这样的方法。参见，例如，W.Herr等(1997)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)203:141-152和W.Herr等(1996)免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)191:131-142。
在本发明的进一步方面，对于诱导免疫应答使用能将蛋白质送递给呈递抗原细胞的重组耶尔森氏菌。因此，本发明涉及使用上述本发明重组耶尔森氏菌诱导特异性免疫应答的免疫原性组合物和方法。
本发明涉及的免疫应答包括细胞免疫应答(主要由T细胞介导)和体液免疫应答(主要由抗体介导)。Janeway和Travers一般性教导这些免疫应答(Janeway和Travers(1996)免疫学(Immunology)，健康和疾病中的免疫系统(Immune System in Health and Disease)，第二版，Garland出版有限公司纽约州纽约市和英国伦敦)(也参见Tureci等(1997)Molecular Medicine Today3(8):342-349)。
根据本发明的该方面，可以在多种治疗方案或者治疗用途中使用重组耶尔森氏菌诱导的免疫应答。例如，可以在用于监测哺乳动物例如人或啮齿类接种治疗的有效性的体外方法中使用重组耶尔森氏菌。在该方案中，从接种免疫原性组合物例如特定抗原的受者得到某些呈递抗原细胞(例如树突细胞)。然后将该呈递抗原细胞与能送递用于接种的抗原的重组耶尔森氏菌接触。接着，向呈递抗原细胞和耶尔森氏菌的混合物加入从相同的受者得到外周血淋巴细胞(即自体PBLs)，所述从相同的受者得到外周血淋巴细胞优选与细胞因子例如IL-2组合。接触抗原和接着依次加强免疫后通过CTLs或者对于相关抗原特异性的抗体的存在来评价接种的有效性。使用标准测试，例如Cr51释放测试或者γ-IFN分泌测试，抗原测定特异性CTLs的存在。通过象使用固定在培养板上的抗原的ELISA这样的测试或者用于T-辅助细胞的标准增生测试，可以测定特异性抗体的存在。
在用于诱导对于一种蛋白质是特异性的CTLs的来自体内的方案中也可以使用重组耶尔森氏菌。体外产生这样的特异性CTLs的方法是本领域公知的，例如如美国专利5342774所公开的。简要地说，从哺乳动物取得含有T细胞前体的血样。从该血样纯化PBLs并且与表达MHC中的抗原性表位的刺激物细胞一起温育。通过例如Cr51释放测试或者γ-IFN分泌测试，可以检测产生的该表位特异性CTLs。
根据本发明，重组耶尔森氏菌和呈递抗原细胞的混合物可以在用于产生待送递的蛋白质特异性CTLs的体外方法中用作“刺激物细胞”。所使用的呈递抗原细胞表达的MHC决定簇与从中分离PBLs的哺乳动物所表达的MHC决定簇相容，并且这些MHC分子的至少一个能呈递给T细胞，一个或多个自蛋白质衍生的表位被送递。这样产生的CTL细胞可以以过继转移的治疗方案施加给患有特征在于送递系统中使用的蛋白质异常表达的症状的哺乳动物。对于过继转移，参见下面的教导Greenberg(1986)免疫学杂志(J.Immunol.)136(5):1917；Riddel等，(1992)Science257:238；Lynch等(1991)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)21:1403；和Kast等(1989)细胞(Cell)59:603。CTLs通过溶解异常表达该抗原的细胞，可以减轻或治疗病症，例如肿瘤，寄生虫感染或病毒感染。
因此，本发明涉及治疗病症的方法和组合物。本发明涉及的病症包括肿瘤和病原体例如细菌、寄生虫、真菌或病毒感染。
“治疗”指减轻或抑制病症，例如抑制肿瘤生长或转移，减小肿瘤大小，或者减轻病原体感染症状。
本发明的重组耶尔森氏菌也可以在体内使用，即将重组耶尔森氏菌引入哺乳动物例如人或啮齿类受者体内。
对于体内使用重组耶尔森氏菌，可以在使用前在动物中测试安全性。在这种情况下，可以口服或者直接服入胃中对动物施用重组耶尔森氏菌。施用重组耶尔森氏菌后几天(1-3天)可以杀死动物。洗肠并且对淋巴集结或排泄物检查存活的耶尔森氏菌属。参见，例如Sory等(1992)感染。免疫.(Infect.Immun.)60:3830-3836。还可以通过腹膜内注射对动物施用重组耶尔森氏菌。可以对杀死的动物的组织例如肾和肝检查细胞内耶尔森氏菌的存在，这是不足够安全性的指征。可以通过例如在固体培养基上培养细胞抽提物来检测细胞内耶尔森氏菌。参见Sory等(1988)Microb.Pathogen4:431-442.
可以在免疫原性组合物中使用安全的重组耶尔森氏菌来诱导治疗哺乳动物各种病症的免疫应答。本发明涉及的病症包括肿瘤和病原体感染，如这里所公开的。
所述免疫原性组合物除了重组耶尔森氏菌外可以包括其它物质，例如细胞因子，佐剂和药学可接受载体。例如这样的免疫原性组合物中也可以包括细胞因子，使用能送递细胞因子的本发明另外的重组耶尔森氏菌。
这些免疫原性组合物可以以任何常规方式施用给受者，例如口服，腹膜内，静脉内或者皮下。这样的组合物诱导的特异性免疫应答可以导致CTL-介导的或抗体-介导的杀伤病原体或者相关抗原异常表达的细胞，这样减轻相关的病症。
本发明通过下面的实施例进一步详细描述。
本说明书中提到的所有公开物在这里引作参考。本说明书中使用的术语和表达用作描述的术语而不是限制，不意味着使用这样的术语和表达排除所示或所描述的性质的等价物或者其部分，要理解在本发明范围内各种各样的改变是可能的。
实施例1细菌菌株，质粒和生长条件使用小肠结肠炎耶尔森氏菌属E40(pYV40)(参见，M.P.Sory等(1995)“使用cyaA基因融合方法，鉴定分泌和内在化到巨噬细胞溶胶中所要求的YopE和YopH区”美国国家科学院院刊92:11998-12002)，其同基因敏感衍生物MRS40(pYV40)(参见M.R.Sarker等)，和它们的各种非极性突变体。表1中列出了质粒。细胞在脑心浸液(BHI)(Difco,Destroit,Michigan)中培养。过夜预培养后，用新鲜的BHI稀释1/20细菌，使在室温下生长30分钟，并且在感染前在37℃下孵育150分钟诱导Yop致病子的合成。
表1举例的抗原
实施例2多突变菌株的构建为了构建yopHOPEM多突变菌株，通过使用自发失活载体pMRS101和pKNG101在MRS40菌株中的等位基因交换依次剔除YopE,YopH,YopO,YopM和YopP基因(参见K.Kaniga等(1991)“用于提高革兰氏阴性细菌中反向遗传的宽宿主范围的自发失活载体小肠结肠炎耶尔森氏菌属的blaA基因的灭活”Gene109:137-141和M.R.Sarker等(1997)“用于革兰氏阴性细菌中基因置换的自发失活载体pKNG101的改进文本”微生物分子学(Mol.Microbiol.)23:409-411)。在“自发失活载体和增变基因”部分中的表2中描述了各种缺失。使用增变基因pPW52(参见P.Wattiau等(1993)“SycE,YopE的分泌中涉及的小肠结肠炎耶尔森氏菌属的类陪伴分子蛋白””微生物分子学(Mol.Microbiol.)8:123-131)首先突变YopE基因，得到菌株MRS40(pAB4052)。用增变基因pAB31(参见，S.D.Mills等(1997)“通过功能Ⅲ型分泌和转运机理所要求的并且涉及YopP的方法，小肠结肠炎耶尔森氏菌属诱导巨噬细胞中的编程性细胞死亡，假设作为效应子蛋白起作用”美国国家科学院院刊94:12638-12643)突变该菌株中的YopH基因，得到双重yopEH突变体MRS40(pAB404)。然后用增变基因pAB34(参见，S.D.Mills等(1997))通过等位变化获得三重yopEHO突变体MRS40(pAB405)。然后用增变基因pMSK7(参见，S.D.Mills等(1997))突变YopP基因，获得yopEHOP突变体MRS40(pMSK46)。最后用YopM增变基因pAB38(参见，S.D.Mills等(l997))通过等位变化获得yopHOPEM菌株MRS40(pABL403)。
表2质粒
实施例3构建编码YopE130-MAGE-1的质粒和将该质粒导入耶尔森氏菌对编码蛋白质MAGE-1的序列符合读框地插入编码截短的含有YopE的头130个氨基酸的YopE,YopE130的序列。这样的质粒在图1中图示给出。
使用pcDNAI/Amp(Invitrogen,Carlsbad,California)中克隆的MAGE-1cDNA作为模板通过PCR扩增MAGE-1的可读框。上游引物，AAACTGCAGATGTCTCTTGAGCAGAGGAGTC，由位于PstⅠ位点之前的MAGE-1的可读框的前核苷酸组成。下游引物，AAACTGCAGTCAGACTCCCTCTTCCTCCTC，由接着PstⅠ位点的MAGE-1的可读框的后核苷酸互补的核苷酸组成。用PstⅠ消化PCR产物并且在载体pMS111的PstⅠ位点符合读框地插入截短的YopE(参见，Sory等(1994)微生物分子学(Molecular Microbiology)14:583-594)。对细菌菌株DH5αF’IQ电穿孔导入pMS111-MAGE-1。从一些克隆抽提DNA并且对细菌菌株SM10电穿孔导入阳性重组克隆的DNA。从耶尔森氏菌属MRS40的SM10(pABL403)转移pMS111后，在补充有萘啶酮酸，亚砷酸钠和氯霉素的含有琼脂的培养基中选择重组克隆。MRS40是对氨苄青霉素敏感的E40的等基因衍生物(参见Sory等(1995)美国国家科学院院刊92:11998-12002)。
实施例4定向EBV-转化的B细胞然后在28℃下在补充有萘啶酮酸，m-亚砷酸钠和氯霉素的LB培养基中将含有pMS111-MAGE-1的耶尔森氏菌MSR40(pABL403)的一个克隆培养过夜。为了获得0.2的OD(光密度)，在新鲜培养基中稀释过夜培养物。新鲜培养物在28℃下扩增大约2小时。细菌用0.9％NaCl冲洗并且再悬浮于0.9％NaCl中，使每毫升有108个细菌。50000EBV-转化的HLA-Al+B细胞放置在微孔中(96圆底孔)并且离心成丸状。弃除上清液，并且在100微升完全RPMI1640中加入细菌的各种稀释物(培养基补充有10％FCS和补充有L-精氨酸(116毫克/毫升)，L-天冬酰胺(36毫克/毫升)，L-谷氨酰胺(216毫克/毫升))。感染2小时后，加入庆大霉素(30微克/毫升)保温2小时，最后清洗细胞三次。
作为阴性对照，也用含有pMS621的耶尔森氏菌MRS40(pABL403)感染相同的细胞，pMS621是只编码截短的YopE即YopE130的质粒。
实施例5MZ2-CTL82/30对定向的B细胞的识别MZ2-CTL82/30对于HLA-A1呈递的MAGE-1肽EADPTGHSY是特异性的(美国专利5342774)。在终体积100微升IScove’s完全培养基(补充有10％人血清，L-精氨酸(116毫克/毫升)，L-天冬酰胺(36毫克/毫升)，L-谷氨酰胺(216毫克/毫升)，链霉素(0.1毫克/毫升)，青霉素(200U/毫升)，IL-2(25U/毫升)和庆大霉素(15微克/毫升))中含有耶尔森氏菌的每一个微孔中加入5000个MZ2-CTL82/30细胞。保温过夜后，用标准ELISA测试(Biosource,Fleurus,Belgium)分析共培养物上清液中的γ-IFN的存在(激活时由CTL产生)。图2A图示这样一种方法。
如图2B所示，CTL82/30识别编码YopE130-MAGE-1耶尔森氏菌感染的HLA-A1+B细胞，而用对照质粒YopE130感染的相同的细胞则不然。细菌的最佳浓度是每微孔1000000个左右。
序列表<110>van der Bruggen,PierreCornelis,Guy R.<120>用重组耶尔森氏菌将蛋白质送递到真核生物细胞中<130>11154<140>US 09/036,582<141>1998-03-06<160>39<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>9<212>PRT<213>人MAGE-1肽<400>1Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr5<210>2<211>9<212>PRT<213>人MAGE-1肽<400>2Ser Ala Tyr Gly Glu pro Arg Lys Leu5<210>3<211>9<212>PRT<213>人MAGE-3肽<400>3Glu Val Asp pro Ile Gly His Leu Tyr5<210>4<211>9<212>PRT<213>人MAGE-3肽<400>4Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val5<210>5<211>10<212>PRT<213>人MAGE-3肽<400>5Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr5 10<210>6<211>9<212>PRT<213>人BAGE肽<400>6Ala Ala Arg Ala Val Phe Leu Ala Leu5<210>7<211>8<212>PRT<213>人GAGE-1,2肽<400>7Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr5<210>8<211>10<212>PRT<213>人RAGE肽<400>8Ser Pro Ser Ser Asn Arg Ile Arg Asn Thr5 10<210>9<211>10<212>PRT<213>人GnT-V肽<400>9Val Leu Pro Asp Val Phe Ile Arg Cys Val5 10<210>10<211>9<212>PRT<213>人MUM-1肽<400>10Glu Glu Lys Leu Ile Val Val Leu Phe5<210>11<211>9<212>PRT<213>人MuM-1肽<400>11Glu Glu Lys Leu Ser Val Val Leu 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15<210>24<211>10<212>PRT<213>人Melan-AMART-1肽<400>24Glu Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val5 10<210>25<211>9<212>PRT<213>人Melan-AMART-1肽<400>25Ile Leu Thr Val Ile Leu Gly Val Leu5<210>26<211>9<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>26Lys Thr Trp Gly Gln Tyr Trp Gln Val5<210>27<211>9<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>27Ile Thr Asp Gln Val Pro Phe Ser Val5<210>28<211>9<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>28Tyr Leu Glu Pro Gly Pro Val Thr Ala5<210>29<211>10<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>29Leu Leu Asp Gly Thr Ala Thr Leu Arg Leu5 10<210>30<211>10<212>PRT<213>人gp100Pmell17肽<400>30Val Leu Tyr Arg Tyr Gly Ser Phe Ser Val5 10<210>31<211>9<212>PRT<213>人DAGE肽<400>31Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu5<210>32<211>12<212>PRT<213>人MAGE-6肽<400>32Lys Ile Ser Gly Gly Pro Arg Ile Ser Tyr Pro Leu5 10<210>33<211>1330<212>DNA<213>小肠结肠炎耶尔森氏菌<400>33AAAAATGGCC AAAAACTTTC AATGGTAGAA GAGCTAAATT TGGATAAGTA ACGCATAAAA 60ATTTTCGACG AAAAACTATA TATATATATA TATTTAATAT GTATGGTTTC ATTTGCAATG 120AAAAAACCGA TAATAAAGAT ATTTTCAGAA 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AGTACGCGCC GATCTTAATG CCAATTACAT CCAGGTCGGT 1080AACACTCGTA CCATAGCGTG CCAGTATCCG CTACAATCTC AACTTGAAAG CCATTTCCGT 1140ATGCTGGCAG AAAACCGAAC GCCAGTGTTG GCTGTTTTAG CGTCCAGTTC TGAGATAGCC 1200AATCAAAGAT TCGGTATGCC AGATTATTTC CGCCAGAGTC GTACCTATGG CAGTATCACT 1260GTAGAGTCTA AAATGACTCA GCAAGTTGGT CTCGGTGACG GGATTATGGC AGATATGTAT 1320ACTTTAACGA TTCGTGAAGC GGGTCAAAAA ACAATTTCTG TTCCTGTGGT TCATGTTGGC 1380AATTGGCCCG ATCAGACCGC AGTCAGCTCT GAAGTTACCA AGGCACTCGC TTCACTGGTA 1440GATCAAACAG CAGAAACAAA ACGCAATATG TATGAAAGCA AAGGAAGTTC AGCGGTAGCA 1500GATGACTCCA AATTACGGCC GGTAATACAT TGCCGTGCGG GTGTTGGCCG TACTGCGCAA 1560CTGATTGGCG CAATGTGCAT GAATGATAGT CGTAATAGTC AGTTAAGCGT AGAAGATATG 1620GTCAGCCAAA TGCGAGTACA AAGAAATGGT ATTATGGTAC AAAAAGATGA GCAACTTGAT 1680GTTCTGATTA AGTTGGCTGA AGGACAAGGG CGACCATTAT TAAATAGCTA ATGTAAATAT 1740TTATTCCTAT GAGTAAATAA AATTACTAAG AGATATACAC CACTTTGCCA ATCAAAGAAA 1800CTTTAAACCT CAACTAAAGT AAGCAATTAG TTGAGGTTTA TCTGCTATAG AATAATTATT 1860AACAAAAATA TAAACAACAA AATTAAAAGT TATGTGTCTA CTTTTACTTT ATGTAACCAA 1920ACCCATTAAT GGATACCGTA CGTTTTTCTT TTATAGAATT AAACCAGTAA ATGAGATGAT 1980GAAGGACGAT GATCATCGTC 1990<210>36<211>867<212>DNA<213>小肠结肠炎耶尔森氏菌<400>36ATGATTGGGC CAATATCACA AATAAACAGC TTCGGTGGCT TATCAGAAAA AGAGACCCGT60TCTTTAATCA GTAATGAAGA GCTTAAAAAT ATCATAATAC AGTTGGAAAC TGATATAGCG 120GATGGATCCT GGTTCCATAA AAATTATTCA CGCCTGGATA TAGAAGTCAT GCCCGCATTA 180GTAATTCAGG CGAACAATAA ATATCCGGAA ATGAATCTTA ATTTTGTTAC ATCTCCCCAG 240GACCTTTCGA TAGAAATAAA AAATGTCATA GAAAATGGAG TTGGATCTTC CCGCTTCATA 300ATTAACATGG GGGAGGGTGG AATACATTTC AGTGTAATTG ATTACAAACA TATAAATGGG 360AAAACATCTC TGATATTATT TGAACCAGTA AACTTTAATA GTATGGGGCC AGCGATACTG 420GCAATAAGTA CAAAAACGGC CATTGAACGT TATCAATTAC CTGATTGCCA TTTTTCCATG 480GTGGAAATGG ATATTCAGCG AAGCTCATCT GAATGTGGTA TTTTTAGTTT GGCACTGGCA 540AAAAAACTTT ACACCGAGAG AGATAGCCTG TTGAAAATAC ATGAAGATAA TATAAAAGGT 600ATATTAAGTG ATAGTGAAAA TCCTTTACCC CACAATAAGT TGGATCCGTA TCTCCCGGTA 660ACTTTTTACA AACATACTCA AGGTAAAAAA CGTCTTAATG AATATTTAAA TACTAACCCG 720CAGGGAGTTG GTACTGTTGT TAACAAAAAA AATGAAACCA TCTTTAATAG GTTTGATAAC 780AATAAATCCA TTATAGATGG AAAGGAATTA TCAGTTTCGG TACATAAAAA GAGAATAGCT 840GAATATAAAA CACTTCTCAA AGTATAA 867<210>37<211>2190<212>DNA<213>小肠结肠炎耶尔森氏菌<400>37ATGAAAATCA TGGGAACTAT GCCACCGTCG ATCTCCCTCG CCAAAGCTCA TGAGCGCATC 60AGCCAACATT GGCAAAATCC TGTCGGTGAG CTCAATATCG GAGGAAAACG GTATAGAATT120ATCGATAATC AAGTGCTGCG CTTGAACCCC CACAGTGGTT TTTCTCTCTT TCGAGAAGGG180GTTGGTAAGA TCTTTTCGGG GAAGATGTTT AACTTTTCAA TTGCTCGTAA CCTTACTGAG 240ACACTCCATG CAGCCCAGAA AACGACTTCG CAGGAGCTAA GGTCTGATAT CCCCAATGCT 300CTCAGTAATC TCTTTGGAGC CAAGCCACAG ACCGAACTGC CGCTGGGTTG GAAAGGGAAG 360CCTTTGTCAG GAGCTCCGGA TCTTGAAGGG ATGCGAGTGG CTGAAACCGA TAAGTTTGCC 420CAGCGCGAAA GCCATATTAG TATAATAGAA ACTAAGGATA ATCAGCGGTT CGTGGCTAAG 480ATTGAACGCT CCATTGCCGA GGGGCATTTG TTCCCAGAAC TGGAGGCTTA TAAACACATC 540TATAAAACCG CGGCCAAACA TCCTAATCTT GCCAATGTCC ATGGCATGGC TGTGGTGCCA 600TACGGTAACC GTAAGGAGGA AGCATTGCTG ATGGATGAGG TGGATGGTTC GCGTTCTTCT 660GACACACTAA GAAGCCTCCC CGATAGCTGG AAGCAACGAA ACATCAATAG TGAAGCCTAC 720TGGGGAACGA TCAAGTTTAT TGCCCATCGG CTATTAGATG TAACCAATCA CCTTGCCAAG 780GCAGGGATAG TACATAACGA TATCAAACCC GGTAATGTGG TATTTGACCG CGCTAGCGGA 840GAGCCCGTTG TCATTGATCT AGGATTACAC TCTCGTTCAG GGGAACAACC TAAGGGGTTT 900ACAGAATCCT TCAAAGCGCC GGAGCTTGGA GTAGGAAACC TAGGCGCATC AGAAAAGAGC 960GATGTTTTTC TCGTAGTTTC AACCCTTCTA CATGGTATCG AAGGTTTTGA GAAAGATCCG 1020GAGATAAAGC CTAATCAAGG ACTGAGATTC ATTACCTCAG AACCAGCGCA CGTAATGGAT 1080GAGAATGGTT ACCCAATCCA TCGACCTGGT ATAGCTGGAG TCGAGACAGC CTATACACGC 1140TTCATCACAG ACATCCTTGG CGTTTCCCCT GACTCAAGAC CTGATTCCAA CGAAGCCAGA 1200CTCCACGAGT TCTTGAGCGA CGGAACTATT GACGAGGAGT CGGCCAAGCA GATCCTAAAA 1260GATACTCTAA CCGGAGAAAT GAGCCCATTA TCTACTGATG TAAGGCGGAT AACACCCAAG 1320AAGCTTCGGG AGCTCTCTGA TTTGCTTAGG ACGCATTTGA GTAGTGCAGC AACTAAGCAA 1380TTGGATATGG GGGTGGTTTT GTCGGATCTT GATACCATGT TGGTGACACT CGACAAGGCC 1440GAACGCGAGG GGGGAGTAGA CAAGGATCAG TTGAAGAGTT TTAACAGTTT GATTCTGAAG 1500ACTTACAGCG TGATTGAAGA CTATGTCAAA GGCAGAGAAG GGGATACCAA GAGTTCCAGT 1560GCGGAAGTAT CCCCCTATCA TCGCAGTAAC TTTATGCTAT CGATCGCCGA ACCTTCACTG 1620CAGAGGATCC AAAAGCATCT GGACCAGACA CACTCTTTTT CTGATATCGG TTCACTAGTG 1680CGCGCACATA AGCACCTGGA AACGCTTTTA GAGGTCTTAG TCACCTTGTC ACCGCAAGGG 1740CAGCCCGTGT CCTCTGAAAC CTACAGCTTC CTGAATCGAT TAGCTGAGGC TAAGGTCACC 1800TTGTCGCAGC AATTGGATAC TCTCCAGCAG CAGCAGGAGA GTGCGAAACG GCAACTATCT 1860ATTCTGATTA ATCGTTCAGG TTCTTGGGCC GATGTTGCTC GTCAGTCCCT GCAGCGTTTT 1920GACAGTACCC GGCCTGTAGT GAAATTCGGC ACTGAGCAGT ATACCGCAAT TCACCGTCAG 1980ATGATGGCGG CCCATGCAGC CATTACGCTA CAGGAGGTAT CGGAGTTTAC TGATGATATG 2040CGAAACTTTA CAGCGGACTC TATTCCACTA CTGATTCGAC TTGGACGAAG CAGTTTAATA 2100GATGAGCATT TGGTTGAACA GAGAGAGAAG TTGCGAGACG TGACGACCAT CGCCGAGCGA 2160CTGAACCGGT TGGAGCGGGA ATGGATGTGA 2190<210>38<211>31<212>DNA<213>小肠结肠炎耶尔森氏菌<400)>38AAACTGCAGA TGTCTCTTGA GCAGAGGAGT C 31<210>39<211><212>DNA<213>小肠结肠炎耶尔森氏菌<400>39AAACTGCAGT CAGACTCCCT CTTCCTCCTC 30
权利要求
1．突变体耶尔森氏菌菌株，其在至少一个耶尔森氏菌效应子-编码基因中包括至少一个突变，从而所述突变体耶尔森氏菌菌株至少一个功能效应子蛋白产生力不强。
2．根据权利要求1的突变体耶尔森氏菌菌株，其中所述效应子编码基因选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
3．根据权利要求1的突变体耶尔森氏菌菌株，其中所述突变是所述效应子基因的启动子序列突变。
4．根据权利要求1的突变体耶尔森氏菌菌株，其中所述突变是所述效应子基因的编码序列突变。
5．五重突变体耶尔森氏菌菌株，具有小肠结肠炎耶尔森氏菌yopEHOMP或假结核耶尔森氏菌yopEHAOJ名称。
6．根据权利要求5的五重突变体耶尔森氏菌菌株，具有小肠结肠炎耶尔森氏菌MRS40(pABL403)的名称。
7．将异源蛋白送递到真核生物细胞中的表达载体，其包括5’至3’方向的来自耶尔森氏菌致病子基因的启动子；与所述启动子操作连接的编码来自耶尔森氏菌效应子蛋白的送递信号的第一DNA序列；和符合读框的与所述第一DNA序列的3’末端融合的编码所述异源蛋白的第二DNA序列。
8．权利要求7的表达载体，其中所述耶尔森氏菌致病子基因是耶尔森氏菌效应子编码基因。
9．权利要求8的表达载体，其中所述效应子编码基因选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。
10．权利要求9的表达载体，其中所述效应子编码基因是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE。
11．权利要求7的表达载体，其中所述效应子蛋白选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
12．权利要求11的表达载体，其中所述效应子蛋白是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE或假结核耶尔森氏菌YopE之一。
13．权利要求7的表达载体，其中所述送递信号是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE130。
14．权利要求7的表达载体，其中所述异源蛋白包括天然存在的蛋白质的至少一个表位。
15．权利要求14的表达载体，其中所述天然存在的蛋白质是肿瘤相关蛋白或者病原体抗原。
16．权利要求15的表达载体，其中所述肿瘤相关蛋白选自下面的成员MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
17．权利要求16的表达载体，其中所述肿瘤相关蛋白是MAGE-1。
18．将异源蛋白送递到真核生物细胞中的权利要求1-6任一项的耶尔森氏菌突变体菌株，其中用自5’至3’方向包括如下的表达载体转化所述耶尔森氏菌来自耶尔森氏菌致病子基因的启动子；与所述启动子操作连接的编码来自耶尔森氏菌效应子蛋白的送递信号的第一DNA序列；和符合读框的与所述第一DNA序列的3’末端融合的编码所述异源蛋白的第二DNA序列。
19．根据权利要求18的耶尔森氏菌，其中所述耶尔森氏菌致病子基因是耶尔森氏菌效应子编码基因。
20．根据权利要求19的耶尔森氏菌，其中所述效应子编码基因选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。
21．根据权利要求20的耶尔森氏菌，其中所述效应子编码基因是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE。
22．根据权利要求18的耶尔森氏菌，其中所述效应子蛋白选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
23．根据权利要求22的耶尔森氏菌，其中所述效应子蛋白是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE或假结核耶尔森氏菌YopE之一。
24．根据权利要求18的耶尔森氏菌，其中所述送递信号是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE130。
25．根据权利要求18的耶尔森氏菌，其中所述异源蛋白包括天然存在的蛋白质的至少一个表位。
26．根据权利要求25的耶尔森氏菌，其中所述天然存在的蛋白质是肿瘤相关蛋白或者病原体抗原。
27．根据权利要求26的耶尔森氏菌，其中所述肿瘤相关蛋白选自下面的成员MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
28．根据权利要求27的耶尔森氏菌，其中所述肿瘤相关蛋白是MAGE-1。
29．将异源蛋白送递到真核生物细胞中的方法，包括用特征在于自5’至3’方向如下的表达载体转化的权利要求1的突变体菌株耶尔森氏菌接触所述真核生物细胞来自耶尔森氏菌致病子基因的启动子；与所述启动子操作连接的编码来自耶尔森氏菌效应子蛋白的送递信号的第一DNA序列；和符合读框的与所述第一DNA序列的3’末端融合的编码所述异源蛋白的第二DNA序列。
30．权利要求29的方法，其中所述真核生物细胞是呈递抗原细胞。
31．权利要求30的方法，其中所述呈递抗原细胞选自B细胞，巨噬细胞，树突细胞，单核细胞，滤泡细胞和成纤维细胞。
32．权利要求30的方法，其中所述呈递抗原细胞表达能呈递自所述异源蛋白衍生的一个或多个表位的MHC分子。
33．权利要求29的方法，其中所述效应子蛋白选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpkA,YopM和YopJ。
34．权利要求33的方法，其中所述效应子蛋白是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE或假结核耶尔森氏菌YopE之一。
35．权利要求29的方法，其中所述效应子蛋白是小肠结肠炎耶尔森氏菌YopE130。
36．权利要求29的方法，其中所述异源蛋白包括天然存在的蛋白质的至少一个表位。
37．根据权利要求36的耶尔森氏菌，其中所述天然存在的蛋白质是肿瘤相关蛋白或者病原体抗原。
38．权利要求37的表达载体，其中所述肿瘤相关蛋白选白下面的成员MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
39．权利要求38的方法，其中所述肿瘤相关蛋白是MAGE-1。
40．权利要求29的方法，其中所述耶尔森氏菌致病子基因是耶尔森氏菌效应子编码基因。
41．权利要求40的方法，其中所述效应子编码基因选自小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE,YopH,YopO,YopM和YopP；和假结核耶尔森氏菌的YopE,YopH,YpKA,YopM和YopJ。
42．权利要求41的方法，其中所述效应子编码基因是小肠结肠炎耶尔森氏菌的YopE。
43．诱导异源蛋白特异性免疫应答的方法，包括下面步骤(a)选择表达能呈递所述异源蛋白至少一个表位的MHC分子的呈递抗原细胞；(b)通过用表达载体转化的权利要求1的突变体耶尔森氏菌菌株接触所述呈递抗原细胞形成细胞混合物，从而将所述异源蛋白送递到所述呈递抗原细胞中，其中所述表达载体特征在于自5’至3’方向来自耶尔森氏菌致病子基因的启动子；与所述启动子操作连接的编码来自耶尔森氏菌效应子蛋白的送递信号的第一DNA序列；和符合读框的与所述第一DNA序列融合的3’末端的编码所述异源蛋白的第二DNA序列；和(c)用步骤(b)中形成的细胞混合物接触得自受者的含有外周血淋巴细胞的样品，从而诱导对所述异源蛋白特异性的免疫应答。
44．权利要求43的方法，其中所述表位来自肿瘤相关蛋白。
45．权利要求44的方法，其中所述肿瘤相关蛋白选自下面的成员MAGE家族，BAGE家族，DAGE/Prame家族，GAGE家族，RAGE家族，SMAGE家族，NAG，酪氨酸酶，Melan-A/MART-1,gp100,MUC-1,TAG-72,CA125,p21ras,p53,HPV16 E7,HOM-MEL-40,HOM-MEL-55,NY-COL-2,HOM-HD-397,HOM-RCC-1.14,HOM-HD-21,HOM-NSCLC-11,HOM-MEL-2.4，和HOM-TES-11。
46．权利要求45的方法，其中所述肿瘤相关蛋白是MAGE-1。
47．权利要求46的方法，其中所述表位来自MAGE-1并且所述MHC分子是HLA-A1。
48．一种免疫原性组合物，含有根据权利要求18的重组耶尔森氏菌。
49．在需要所述应答的受者体内诱导异源蛋白特异性CTL应答的方法，包括下面的步骤(a)从所述受者获得表达MHC分子的呈递抗原细胞；(b)通过用表达载体转化的权利要求1的突变体耶尔森氏菌菌株接触所述呈递抗原细胞形成细胞混合物，其中所述表达载体特征在于自5’至3’方向的来自耶尔森氏菌致病子基因的启动子；与所述启动子操作连接的编码来自耶尔森氏菌效应子蛋白的送递信号的第一DNA序列；和符合读框的与所述第一DNA序列融合的3’末端的第二DNA序列，其中所述第二DNA序列编码所述呈递抗原细胞的所述MHC分子呈递的所述异源蛋白的至少一个表位；和(c)用步骤(b)中形成的细胞混合物接触得自受者的含有外周血淋巴细胞的样品，从而产生对所述异源蛋白特异性的CTLs；和(d)对所述受者施用步骤(c)中产生的CTLs，从而诱导所述受者体内对所述异源蛋白的特异性CTL应答。
50．测定受者接种方案有效性的方法，其中用一种抗原对所述受者接种，包括下面的步骤(a)从所述受者获得表达MHC分子的呈递抗原细胞；(b)通过用表达载体转化的权利要求1的突变体耶尔森氏菌菌株接触所述呈递抗原细胞形成细胞混合物，其中所述表达载体特征在于自5’至3’方向的来自耶尔森氏菌致病子基因的启动子；与所述启动子操作连接的编码来自耶尔森氏菌效应子蛋白的送递信号的第一DNA序列；和符合读框的与所述第一DNA序列融合的3’末端的第二DNA序列，其中所述第二DNA序列编码所述呈递抗原细胞的所述MHC分子呈递的所述抗原的至少一个表位；和(c)用步骤(b)中形成的细胞混合物接触得自所述受者的含有外周血淋巴细胞的样品，并且检测所述抗原特异性免疫应答的存在，从而确定所述接种方案的有效性。
51．一种治疗患者病症的方法，包括对所述患者施用权利要求18的耶尔森氏菌，其中异源蛋白激发对所述病症特异性的免疫应答。
全文摘要
本发明涉及重组耶尔森氏菌及其将蛋白质送递到真核生物细胞中的用途,包括相关的组合物和治疗方法和相关的分析。
文档编号C12N15/74GK1304442SQ99805875
公开日2001年7月18日 申请日期1999年3月3日 优先权日1998年3月6日
发明者皮埃尔B·范·德·布鲁根, 盖伊R·科尼利斯, 安妮M·博兰德, 蒂尔利R·布恩－法勒 申请人:皮埃尔B·范·德·布鲁根, 盖伊R·科尼利斯, 安妮M·博兰德, 蒂尔利R·布恩－法勒