编码青霉素结合蛋白的基因和生产l－谷氨酸的方法

专利名称：编码青霉素结合蛋白的基因和生产l－谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及通过发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛用作调味品等的原料。
背景技术：
如果在含有有限量生物素的培养基中培养棒状杆菌(coryneformbacteria)，那么该细菌生产显著量的L-谷氨酸。另一方面，如果在含有过量生物素的培养基中培养棒状杆菌，那么该细菌不产生L-谷氨酸。然而，已知即使在这种条件下，如果向所述培养基中加入表面活性剂或诸如青霉素的生物素活性抑制剂，所述细菌的生长受到抑制，它们也开始生产显著量的L-谷氨酸。
对于通过向培养基中加入青霉素来诱导谷氨酸产生，已经研究了很多年(T.D.Nunheimer,J.Birnbaum,E.D.Ihnen和A.L.Demasin,Appl.Microbiol.,20,215-217(1970))。人们认为青霉素的作用是引起细胞表层的结构变化，从而提高细胞质膜对谷氨酸的通透性。
另外，也已经研究了有限的生物素量或加入表面活性剂或青霉素通过何种机制影响棒状杆菌的L-谷氨酸生产能力，已经阐明存在被认为参与了L-谷氨酸生产的基因(dtsR基因)。而且，已经证实，其中dtsR基因被破坏的菌株即使在下述条件下也产生显著量的L-谷氨酸，在所述条件中生物素的存在量使得野生菌株几乎不生产L-谷氨酸(国际专利公布WO95/23224)。
而且，已经获得了许多同细胞质膜通透性提高诱导谷氨酸生产的解释相矛盾的发现，但仍不了解青霉素诱导谷氨酸产生的机制(E.Kimura,Y.Kawahara和W.Nakamatsu,Tanpakusshitu Kakusan Koso(Protein,Nucleic acid and Enzyme)，第42卷，2633-2640页(1997))。
另外，众所周知青霉素结合蛋白(PBP)在细菌细胞分裂中起重要作用。认为所述青霉素结合蛋白是存在于细菌细胞表层的酶，并且它们特异性结合诸如青霉素的β-内酰胺类抗生素。尽管它可以根据物种有所不同，但认为它是通常在大肠杆菌(E.coli)中发现的3-8种蛋白，它们的分子量分布在大约40,000-120,000的范围内。青霉素通过结合所述青霉素结合蛋白活性位点的丝氨酸残基抑制酶促反应。
已经阐明了7种存在于大肠杆菌中的青霉素结合蛋白，大肠杆菌尤其是研究的主要目标(B.G.Spratt,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72,2999(1975))。其中，已经证实称为PBP2和PBP3的那些蛋白在细胞分裂中起重要作用(B.G.Spratt,J.Bacteriol.,131,293(1977))。然而，还不知道在棒状杆菌中是否存在青霉素结合蛋白。
本发明的公开本发明的发明人研究了在棒状杆菌中是否也应当存在青霉素结合蛋白(下文简写为“PBP”)，并分析其功能。结果，本发明人获得到了一个被认为用于阐述青霉素在棒状杆菌中诱导谷氨酸产生的机制的新发现，同时，他们发现该发现可以从仍未知的着眼点用于涉及棒状杆菌的谷氨酸生产能力提高的研制。
以前述发现为基础实现本发明，它涉及生产L-谷氨酸的方法，包括以下步骤在液体培养基中培养棒状杆菌，以在该培养基中生产和累积L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，其中PBP在所述细菌中通常不起作用，且所述细菌具有产生L-谷氨酸的能力。
在本发明的一个优选的实施方案中，在前述方法中使用的棒状杆菌是其中在第一温度PBP通常起作用，而在第二温度PBP通常不起作用的细菌，所述方法包括在所述细菌增殖的第一温度培养所述细菌的步骤和在L-谷氨酸产生的第二温度培养所述细菌的步骤。
在本发明的另一个实施方案中，在前述方法中使用的棒状杆菌含有包含编码PBP的基因(PBP基因)和温度敏感复制控制区的质粒，其中在染色体上的PBP基因不起作用，而所述质粒在所述第一温度可以复制，而在所述第二温度不能复制。
在本发明的另一个实施方案中，由在所述方法中使用的棒状杆菌产生的PBP具有温度敏感型突变。
在本发明的再一个实施方案中，当PBP结合青霉素G时，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示的PBP分子量约为60,000。
本发明的第二方面是编码在下述(A)或(B)中定义的蛋白的DNA(A)具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有序列表中SEQ ID NO:2的氨基酸序列并具有结合青霉素的活性的蛋白，所述氨基酸序列包括一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入、添加或翻转。
在本发明的一个优选的实施方案中，前述DNA是在下述(a)或(b)中定义的DNA(a)至少包括序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸数881至2623的核苷酸序列的DNA；(b)在严格条件下可与至少包含序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸数881至2623的序列的核苷酸序列杂交，并编码具有结合青霉素的活性的蛋白的DNA。
以下将详细说明本发明。<1>棒状杆菌的PBP在本发明中，棒状杆菌包括那些到目前为止分类为短杆菌属(genus Brevibacterium)但现在统一为棒状杆菌属(genusCorynebacrerium)的细菌(Int.J.Syst.Bacteriol.,4l,255(1981))，并包括属于与棒状杆菌属密切相关的短杆菌属的细菌。以下列出了这些棒状杆菌的实例。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒状杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)美棒状杆菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium lilium(Corynebacteriumglutamicum))melassecola棒状杆菌(Corynebacterium melassecola)谷氨酸棒状杆菌(Brevibacterium divaricatum(Corynebacteriumglutamicum))黄色短杆菌(Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum))immariophilum短杆菌(Brevibacterium immariophilum)乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum(Corynebacteriumglutamicum))玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyicum)生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)thermoaminogenes棒状杆菌(Corynebacterium thermoaminogenes)具体地说，以下菌株可以作为实例。
嗜乙酰乙酸棒状杆菌ATCC 13870醋谷棒状杆菌ATCC 15806美棒状杆菌ATCC 15991谷氨酸棒状杆菌ATCC 13020谷氨酸棒状杆菌(corynebacterium lilium)ATCC 15990melassecola棒状杆菌ATCC 17965谷氨酸棒状杆菌(Brevibacterium divaricatum)ATCC 14020黄色短杆菌ATCC 14067immariophilum短杆菌ATCC 14068乳发酵短杆菌ATCC 13869
玫瑰色短杆菌ATCC 13825解糖短杆菌ATCC 14066生硫短杆菌ATCC 19240thermoaminogenes棒状杆菌AJ12340(FERM BP-1539)在本发明中涉及的PBP是一种存在于上述棒状杆菌的细胞表层的膜蛋白，如果它与青霉素接触，那么它以共价键与青霉素结合。可以通过例如向棒状杆菌的膜部分加入标记的青霉素以开始反应，使可溶性的表面活性剂组分在聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并目测标记，从而检测PBP(青霉素结合实验)。如在下文提及的实施例中所示，在乳发酵短杆菌的PBP结合青霉素G的状态下，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上检测到它们于分子量约110kDa、100kDa和60kDa处有三条带，将它们命名为PBP1、PBP2和PBP3。
在研究这些PBP和衍生自青霉素G的氮脒青霉素之间的亲和力时，发现氮脒青霉素选择性地结合PBP3。而且，发现当在存在显著量生物素的条件下培养乳发酵短杆菌时，在一定浓度的氮脒青霉素存在下产生L-谷氨酸。这些事实提示，在存在显著量的生物素时通过抑制PBP的作用，至少是抑制PBP3的作用，可以诱导L-谷氨酸产生。因此，即使存在显著量的生物素，其中PBP通常不起作用的棒状杆菌也应该能够在不加入生物素活性抑制剂的情况下诱导L-谷氨酸产生。而且，这种其中PBP通常不起作用的棒状杆菌应当具有提高L-谷氨酸生产能力的可能性。此外，通过操作PBP基因，应该获得有关棒状杆菌产生L-谷氨酸的新发现，可以利用它来从至今还未知的方面进行开发。
在本发明中，表述“PBP通常不起作用”意指在显著量的生物素存在下诱导L-谷氨酸产生的状态。它可以是一种因为抑制PBP基因的转录或翻译而不产生PBP的状态，或者是一种因为在产生的PBP时发生了突变而降低或消除了PBP作用的状态。<2>其中PBP通常不起作用的棒状杆菌用于按照本发明生产L-谷氨酸的方法的棒状杆菌是其中PBP通常不起作用的棒状杆菌。在一个优选的实施方案中，在前述方法中使用的棒状杆菌是其中在第一培养条件下PBP通常起作用，而在第二培养条件下PBP通常不起作用的细菌。这种棒状杆菌可以在所述第一培养条件下增殖，而在所述第二培养条件下在显著量的生物素存在时可以产生L-谷氨酸。至于PBP，优选PBP3。
关于上述的培养条件，可提及培养温度、培养基的渗透压、pH、培养基的组分等等。培养基组分的实例包括诸如IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和乙酸的诱导剂，以及诸如葡萄糖的抑制剂。所述培养温度将在下文描述中作为培养条件的实例进行说明。然而，关于其它培养条件，在以下描述中的术语“温度”可以由表示另一条件的术语代替。
作为其中PBP通常不起作用的棒状杆菌的实例，可以提及一种突变株，在该菌株中将突变引入到编码PBP的基因(PBP基因)中，以使通常起作用的PBP不被表达。上述突变可以是抑制PBP基因转录或翻译的突变，或者是产生通常不起作用的PBP的突变。
因为引起PBP完全缺乏的突变对所述细菌应当是致死性的，所以上述突变株可以作为诸如温度敏感突变株的条件突变株获得。通过例如利用紫外线照射或用化学试剂处理棒状杆菌，获得可以在第一温度(例如低温)增殖，但在第二温度(例如高温)不能增殖的突变株，并从获得的突变株中选择可以在第一温度增殖，并当在第二温度培养它时，在显著量的生物素存在下可以产生L-谷氨酸的突变株，从而可以得到所述突变株。作为具有这种特性的突变株，可以选择DTSR蛋白缺陷菌株(国际专利公布WO95/23224)或α-KGDH缺陷菌株(国际专利公开WO95/34672)。然而，如果侯选菌株是具有涉及PBP的突变的突变株，那么可以通过对在所述第二温度培养的细胞进行上述的青霉素结合实验进行证实。
如果一旦获得这种突变株，可以将该突变株用作宿主克隆棒状杆菌的PBP基因。即可以通过用包含得自棒状杆菌的染色体DNA的质粒转化其中PBP通常不起作用的突变株，选择其中PBP通常起作用的转化株并收集所述质粒，从而获得包含PBP基因的DNA片段。
在本领域那些技术人员熟知的参考文献(例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)等)中描述了用于通常的基因重组的技术，诸如那些用于DNA的消化和连接、转化、由转化体中提取重组DNA、集落杂交等技术。
例如可以如下生产染色体DNA文库。首先，用Miura等人的方法(H.Saito和K.Miura,Biochem.Biophys.Acta,72,619(1963))或类似的方法制备染色体DNA。然后，用合适的限制酶部分消化所述染色体DNA，以获得各种片段的混合物。如果所述消化的程度通过调节消化反应时间等控制，那么可以使用的限制酶范围很广。例如，于30℃或更高的温度(优选37℃或更高的温度)，通过让Sau3AⅠ以1-10单位/ml的酶浓度作用于染色体DNA不同的时间长度(1分钟至2小时)，来消化所述染色体DNA。
接着，将消化的染色体DNA片段连接到在大肠杆菌细胞可自主复制的载体DNA，以产生重组DNA。更具体地说，让与用于消化染色体DNA的限制酶Sau3AⅠ产生相同末端核苷酸序列的限制酶(例如BamHⅠ)，于30℃或更高的温度，以1-100单位/ml的酶浓度，作用于所述载体DNA1小时或更长时间(最好1-3小时)，以完全消化所述载体并切断它。然后，将染色体DNA片段的混合物和如上所述获得的切断的载体DNA混合，并让DNA连接酶(优选T4 DNA连接酶)于4-16℃的温度，以1-100单位/ml的酶浓度，作用于所述混合物1小时或更长时间(最好6-24小时)，以获得重组DNA。
可在大肠杆菌细胞中自主复制的载体最好是在宿主细胞中自主复制的质粒载体，其实例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、pHSG398、RSF1010等。
而且，如果将具有使质粒在棒状杆菌(它可以由例如pAM330(参见日本专利公开(Kokai)第58-67699号)、pHM1519(参见日本专利公开第58-77895号)、pCG1(参见日本专利公开第57-134500号)、pCG2(参见日本专利公开第58-35197号)、pCG4(参见日本专利公开第57-183799号)、pCG11(参见日本专利公开第57-183799号)等制备)中自主复制的能力的DNA片段插入到上述载体中，那么它们可以用作在大肠杆菌和棒状杆菌中都自主复制的所谓的穿梭载体。
这种穿梭载体的实例包括下文提及的那些载体。下文也列出了带有各种载体的微生物，其在国际保藏单位的保藏号分别列于圆括号中。
pAJ655大肠杆菌AJ11882(FERM BP-136)谷氨酸棒状杆菌SR8201(ATCC 39135)pAJ1844大肠杆菌AJ11883(FERM BP-137)谷氨酸棒状杆菌SR8202(ATCC 39136)pAJ611大肠杆菌AJ11884(FERM BP-138)pAJ3148谷氨酸棒状杆菌SR8203(ATCC 39137)pAJ440枯草杆菌AJ11901(FERM BP-140)例如通过使用获得的重组DNA转化大肠杆菌K-12菌株，以制备染色体DNA文库。该转化可以利用D.M.Morrison的方法(Methodsin Enzymology,68,326,1979)进行，该方法包括用氯化钙处理受体细胞，以增加其对DNA(M.Mandel和A Higa,J.Mol.,Biol.,53,159(1970))等的通透性。
然后，用获得的染色体DNA文库转化其中PBP通常不起作用的棒状杆菌的突变株。作为转化棒状杆菌的方法，有上文提及的使用氯化钙处理细胞的方法，或包括让处于它们能够吸收DNA的特殊生长阶段的细胞吸收DNA的方法(由C.H.Duncan等人报导用于枯草杆菌(Bacillus subtilis))。除了这些，还可以使用的方法是使DNA受体细胞成为可以轻易吸收重组DNA的裸细胞或原生质球，接着将所述重组DNA引入到所述细胞中，已知该方法可用于枯草杆菌、放线菌和酵母(S.Chang等，Molec.Gen.Genet.,168,111(1979)；Bibb等，Nature,274,398(1978)；A.Hinnen等，Proc.Natl.Sci.USA,75,1929(1978))。除了这些以外，在日本专利公开第2-207791号中也公开了用于转化棒状杆菌的方法。
通过在未转化的突变株(宿主)不能生长的条件下平板接种转化的突变株，并选择已形成菌落的菌株，可以获得引入PBP基因的转化菌株。例如使用P.Guerry等的方法(J.Bacteriol.,116,1064(1973))、D.B.Clewell的方法(J.Bacteriol.,110,667(1972))或类似的方法由获得的转化体中分离重组DNA，可以得到含有PBP基因的DNA片段。使用编码已知的微生物的PBP(例如大肠杆菌的PBP)的基因，或者使用基于其核苷酸序列产生的寡核苷酸，通过杂交可能也可以获得用包含PBP基因的重组DNA转化的棒状杆菌。
除了诱变处理外，使用如上所述获得的PBP基因可以产生其中PBP通常不起作用的棒状杆菌。通过用包含PBP基因的DNA转化棒状杆菌，所述PBP基因用内部缺失修饰以便不产生通常起作用的PBP(缺失型PBP基因)，并在缺失型PBP基因和染色体上的PBP基因之间进行重组，可以破坏在染色体上的PBP基因。已经确立了这种利用同源重组的基因破坏，并有使用线性DNA、含有温度敏感复制控制区的质粒等的方法。在本发明中，优选使用含有温度敏感复制控制区的质粒的方法。
可以用缺失型PBP基因如下置换在宿主染色体上的PBP基因。即首先通过插入温度敏感复制控制区、突变PBP基因和抗诸如氯霉素的药物的标记基因，制备重组DNA，用所述重组DNA转化棒状杆菌。此外，在温度敏感复制控制区不起作用的温度培养产生的转化菌株，接着可以在含有所述药物的培养基中培养该转化菌株，以获得其中重组DNA掺入到染色体DNA中的转化体菌株。
在这种其中重组DNA掺入到染色体DNA中的菌株中，突变PBP基因与最初存在于染色体上的PBP基因重组，将染色体PBP基因和缺失型PBP基因的两个融合基因插入到所述染色体中，以便使重组DNA的其它部分(载体区段、温度敏感复制控制区和药物抗性标记)存在于所述两个融合基因之间。因此，所述转化体表达PBP，因为正常的PBP基因在此状态下是占优势的，所述它可以生长。
然后，为了仅去掉在染色体DNA上的缺失型PBP基因，通过重组两个PBP基因从染色体DNA中消除一个PBP基因的拷贝和所述载体区段(包括所述温度敏感复制控制区和所述药物抗性标记)。在此情况下，在染色体DNA上留下正常的PBP基因，而缺失型PBP基因从染色体DNA上切除，或与此相反，在染色体DNA上留下缺失型PBP基因，而正常的PBP基因从DNA上切除。在这两种情况下，当细胞在温度敏感复制控制区可以起作用的温度培养时，切除的DNA可以在细胞中作为质粒保留。接着，在温度敏感复制控制区不能起作用的温度培养所述细胞。在该培养中，当在染色体DNA上留下缺失型PBP基因时细胞不能增殖，因为包含正常PBP基因的质粒从细胞中丢失(drop)。另一方面，当在染色体DNA上留下正常PBP基因时，细胞可以增殖。因此，通过选择在温度敏感复制控制区起作用的温度可以增殖，但在温度敏感复制控制区不起作用的温度不能增殖的菌株，可以获得其中染色体DNA上的PBP基因被破坏，而质粒上带有正常PBP基因的菌株。
当在温度敏感复制控制区起作用的温度(例如低温)培养如上所述获得的具有破坏的PBP基因的菌株时，该菌株在细胞中保留了PBP基因，而当在温度敏感复制控制区不起作用的温度(例如高温)培养该菌株时，它丢失了PBP基因。在以下的描述中，温度敏感质粒不能复制的温度是指高温。然而，不想排除所述温度是低温的可能性，如果获得的温度敏感复制控制区在低温时不能复制但在高温时可以复制，那么也可以使用它。
在染色体DNA上的PBP基因被破坏，正常的PBP基因掺入到质粒中之后被制成recA-的菌株最好用作在本发明中使用的微生物，因为在这种菌株中，防止了在培养过程中质粒上的PBP基因在低温下掺入到染色体中，并因此保证所述基因的丢失。
通过在棒状杆菌细胞中进行质粒的自主复制并得到对诱变处理的药物抗性，用所述质粒转化棒状杆菌，并由在包含所述药物的培养基中于低温下可以生长但在高温下不能生长的转化体中提取质粒，可以获得所述温度敏感复制控制区。
至于诱变质粒的方法，可以提及利用羟胺于体外处理质粒的方法(G.O.Humpherys等，Molec.Gen.Genet.,145,101-108(1976)等)。
本文使用的术语“低温”和“高温”为相关的概念，低温和高温之间的界限没有特别限定。所述“低温”是指一个温度范围，当在此范围内培养棒状杆菌时它们至少可以增殖。所述“高温”是指一个温度，在此温度下棒状杆菌本身不会死亡。在含有药物的培养基中于不同的温度培养带有温度敏感质粒的转化体，以确定下限温度，在此温度以上所述转化体不能生长，可以以此确定所述低温和所述高温之间的界限。
在棒状杆菌细胞中具有起作用的温度敏感复制控制区的质粒的实例包括pHS4、pHS22和pHS23。质粒pHSC4也可以作为温度敏感质粒用于本发明，该质粒通过将由pHS4切除的并含有来自棒状杆菌的复制控制区的DNA片段连接到大肠杆菌载体pHSG398获得。pHSC4在棒状杆菌和大肠杆菌中自主增殖，并赋予宿主氯霉素抗性。带有pHSC4的大肠杆菌AJ12571于1990年10月11日保藏在国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术代理处，国际贸易和工业部，获得的保藏号为FERM P-11763。然后，根据布达佩斯条约的规定于1991年8月26日转移到国际保藏单位，获得的保藏号为FERM BP-3524。
这些温度敏感质粒在棒状杆菌细胞中在大约10-32℃可以自主增殖，但它们在大约34℃或更高的温度下不能自主增殖。
通过例如用BamHⅠ和KpnⅠ消化上述pHSC4，可以获得具有温度敏感复制控制区的DNA片段。
在日本专利公布(kokoku)第7-108228号中公开了上述质粒的结构和包含其温度敏感复制控制区的区的核苷酸序列。
也已知在大肠杆菌中一些青霉素结合蛋白基因形成基因簇，并且murE基因和PBP3基因(ftsⅠ)互相紧密定位(F.Ishino,NipponNogeikagaku,Kaishi，第63卷，第11期，1755-1764(1989))。因此，通过用包含得自棒状杆菌的染色体DNA的质粒转化作为宿主的已经由棒状杆菌获得的murE温度敏感突变体，以获得在所述宿主不能生长的温度能够生长的转化体菌株，从而可以得到与murE基因一起的PBP基因。本发明的发明人如在下文提及的实施例中所述成功获得了基于此原理的PBP基因。
此外，因为本发明阐明了PBP基因和侧翼区的核苷酸序列，所以通过制备基于所述序列的引物和利用棒状杆菌染色体DNA作为模板进行PCR(聚合酶链式反应；参见T.J.White等，Trends Genet.,5,185(1989))，可以容易地获得PBP基因。
含有在以后提及的实施例中获得的PBP基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO:1所示。在此核苷酸序列中存在三个开放读框(ORF)(核苷酸数881-2623,2790-4454和4467-5345)。由所述ORF编码的氨基酸序列示于SEQ ID NO:2-4。
当在现有蛋白数据库中检索显示与这些氨基酸序列同源的序列时，发现由第一个ORF编码的氨基酸序列显示与大肠杆菌的PBP3基因(ftsⅠ)编码的氨基酸序列在氨基酸水平上大约31％同源。由第二个ORF和第三个ORF编码的氨基酸序列显示分别与大肠杆菌的murE基因和murF基因编码的氨基酸序列同源。这些结果表明第一个ORF是对应于大肠杆菌的ftsⅠ的PBP基因。
本发明的PBP基因可以编码一个或几个置换、缺失、插入、添加或翻转的氨基酸，只要用于结合青霉素的编码蛋白的活性不被降解。由本文使用的术语“几个”代表的数字可以根据在蛋白质三维结构中的定位和氨基酸残基的种类有所变化。这是缘于以下事实，即在氨基酸中诸如异亮氨酸和缬氨酸的类似的氨基酸和在这些氨基酸中的差异基本上不影响蛋白质的三维结构。因此，所述编码蛋白可以是具有相对于构成所述蛋白的完整氨基酸序列30-40％同源或更高，优选55-65％同源或更高，并具有结合青霉素的活性的蛋白。
通过用例如定点诱变修饰所述核苷酸序列，以使特定位点的氨基酸残基应包括置换、缺失、插入、添加或翻转，由此可以获得这种编码与如上所述的青霉素结合蛋白基本相同的蛋白的DNA。以上提及的这种修饰的DNA也可以通过已知的诱变处理获得。所述诱变处理的实例包括用羟胺等体外处理编码青霉素结合蛋白的DNA、利用紫外线照射或利用用于通常诱变处理的诱变剂(诸如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)或亚硝酸)处理具有编码青霉素结合蛋白的DNA的微生物(例如大肠杆菌)。
上述的核苷酸的置换、缺失、插入、添加或翻转也包括由于个体差异、具有青霉素结合蛋白的微生物的物种或属的差异而天然产生的突变(突变体或变种)。
通过在合适的细胞中表达具有如上所述的这种突变的DNA，并检测表达产物的青霉素结合活性，可以获得编码同青霉素结合蛋白基本相同的蛋白的DNA。通过由编码具有突变的青霉素结合蛋白的DNA中或由具有该DNA的细胞中分离在严格条件下可与具有例如序列表中SEQ ID NO:1的核苷酸数881至2623的核苷酸序列、并编码具有青霉素结合活性的蛋白的DNA杂交的DNA，也可以获得编码与青霉素结合蛋白基本相同的蛋白的DNA。本文提到的“严格条件”是一种条件，在此条件下形成所谓的特异性杂交，而不形成非特异性杂交。难以用数值清楚表达此条件。但是，所述严格条件例如包括以下条件，在此条件下两个具有高同源性的DNA(例如同源性不小于50％的两个DNA)互相杂交，而两个具有低于上述的同源性的DNA互相不杂交。另一方面，用以下条件，即60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，举例说明所述严格条件，在该条件下在相当于DNA杂交中一般洗涤条件的盐浓度下，两个DNA互相杂交。
在如上所述的条件下可杂交的基因包括那些具有在所述基因中产生的终止密码子的基因和那些由于活性中心的突变而不具有活性的基因。然而，通过将所述基因与市售的活性表达载体连接，并检测青霉素结合活性，可以很容易除去这类突变基因。<3>生产L-谷氨酸通过培养如上所述的这样一种其中PBP通常不起作用且在液体培养基中具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌，以在所述培养基中产生和积累L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，可以生产L-谷氨酸。按照本发明的方法，在含有显著量的生物素(如糖蜜)而不加入生物素活性抑制剂的培养基中可以生产L-谷氨酸。
当使用的棒状杆菌是其中PBP在第一温度通常起作用，而在第二温度通常不起作用的细菌时，在第一温度培养所述细菌，以让其增殖，然后将温度转换到第二温度培养，以生产L-谷氨酸。
具体而言，所述温度转换例如可以通过在低温下进行种子培养，并在高温下在主培养基中进行培养(主培养)实现。在预培养或主培养过程中也可以转换温度。不能明显区分细胞增殖的步骤和质粒丢失的步骤，质粒丢失的步骤伴随有细胞增殖。
关于温度转换的时间，通过进行温度转换的不同培养时间段的初步实验，可以容易地确定在低温下的培养时间段。通常，该培养可以持续至在对数生长阶段达到所需的细胞浓度，然后可以将温度转换到在该温度下所述质粒不能复制的水平。
用于所述培养的培养基没有特别限制，可以使用通常的含有碳源、氮源和无机离子以及根据需要的有机痕量营养物的培养基。具体来说，在本发明中可以使用含有显著量生物素的培养基。
至于所述碳源，可以使用诸如葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖和淀粉的水解产物的糖类；诸如乙醇和肌醇的醇类；诸如乙酸、延胡索酸、柠檬酸和琥珀酸的有机酸等。
至于所述氮源，可以使用诸如硫酸铵、氯化铵和磷酸铵的无机铵盐，诸如大豆水解产物、氨气、氨水的有机氮等。
至于所述无机离子或其来源，可以加入少量的磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。至于痕量有机营养物，理想的是根据需要加入适量的诸如维生素B1和酵母提取物等的所需物质。
所述培养最好在有氧条件下进行16至72小时，在培养过程中培养温度控制在20-45℃,pH控制在5-8.5。至于调节pH，可以使用无机或有机酸性或碱性物质、氨气等。
通常可以通过使用已知技术的组合，诸如使用离子交换树脂、沉淀方法等的技术，从所述培养物收集L-谷氨酸。
附图简述

图1是一幅曲线图，显示了氮脒青霉素对PBP3和青霉素G结合的抑制。箭头指示最小抑制浓度。
实施本发明的最佳方式以下将说明本发明的实施例。
实施例1检测棒状杆菌的PBP根据前述的Spratt等的方法进行棒状杆菌的PBP的检测，具体如下。<1>制备膜部分PBP被认为是一种膜蛋白。如下制备棒状杆菌的膜部分。将棒状杆菌的野生菌株乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株接种到20ml的A培养基(在1升水中含有10克聚蛋白胨、5克酵母提取物、5克NaCl和5克葡萄糖)中，于30℃振荡培养，并在660nm的吸收达到约1.0时收获。在50mM的磷酸钠缓冲液pH7.0中清洗细胞。然后，将玻璃珠加入到该缓冲液中并超声处理破碎细胞。通过离心除去破碎碎片后，将所述缓冲液于100,000×g超速离心30分钟，收集膜部分。用相同的缓冲液清洗获得的部分，将最后悬浮于500μl相同缓冲液中的部分用作所述膜部分。通过使用蛋白定量试剂盒(由PIERCE生产，Micro BCA蛋白检测试剂盒)测定此膜部分的蛋白浓度，实测值为4mg/ml。<2>青霉素结合反应将3μl的14C-青霉素G(由Amersham生产)加入到体积为30μl的所制备的膜部分中，并使其于30℃反应10分钟。然后，加入2μl 15％的十二烷基肌氨酸钠(N-月桂酰肌氨酸钠)和45mg/ml青霉素G，置于室温20分钟。然后，于20℃以13,000rpm离心所述部分30分钟，得到可溶性部分。对此部分的样品进行SDS-PAGE(使用含有10％聚丙烯酰胺的凝胶)，混合凝胶，干燥并用Fuji Photo Film Co.,Ltd生产的图象分析仪BAS2000分析。结果在110kDa、100kDa和60kDa检测到三条带，分别命名为PBP1、PBP2和PBP3。<3>使用PBP结合抑制剂进行分析研究衍生自青霉素G的氮脒青霉素和PBP之间的亲和性。通过在前述青霉素结合反应之前加入不同浓度的氮脒青霉素，并检测对与同位素(14C)标记的青霉素G结合的抑制程度，由此研究所述衍生物和PBP之间的亲和性。结果，加入氮脒青霉素只抑制了PBP3与标记的青霉素G的结合。即阐明氮脒青霉素选择性地结合PBP3(图1)。
实施例2加入氮脒青霉素诱导棒状杆菌生产谷氨酸将乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株接种到前述的A培养基中，于30℃振荡培养2小时，然后加入0.01μM至100μM的氮脒青霉素，再振荡培养8小时。然后，使用Biotech Analyzer AS210(由AsahiChemical Industry Co.,Ltd.生产)检测所述培养基中的谷氨酸浓度(表1)。
表1

因为在加入氮脒青霉素诱导L-谷氨酸生产的条件下只有PBP3结合氮脒青霉素，所以证明至少是由抑制PBP3的作用促成了由加入青霉素或氮脒青霉素诱导的谷氨酸生产。
实施例3克隆乳发酵短杆菌ATCC 13869的PBP基因(1)制备乳发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA在10ml L培养基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5gNaCl、0.1％葡萄糖，pH7.2)中过夜培养乳发酵短杆菌ATCC 13869菌株，并收获。用50mM Tris-HCl、50mM EDTA缓冲液(pH8.0)清洗细胞，并在800μl相同缓冲液中悬浮。
向上述细胞悬浮液中加入40μl的50ml/ml溶菌酶溶液和20μl的10mg/ml RNA酶溶液，于37℃温育该混合物1小时。向混合物中加入20μl的20％SDS溶液，并于70℃温育1小时。然后，向混合物中加入24μl的20mg/ml蛋白酶K溶液，于50℃温育1小时，再加入24μl的蛋白酶K溶液，并温育1小时。
向如上所述获得的细胞裂解液中加入等量的苯酚并搅拌。将所述裂解液置于4℃过夜，然后离心收集水层。用苯酚/氯仿提取水层2小时，并用氯仿/异戊醇提取30分钟。通过在搅拌预定的一段时间后，对其离心以收集水层，留下裂解物，从而进行提取。通过乙醇沉淀由获得的提取物中收集DNA。在300μl的TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA,pH8.0)中溶解DNA沉淀。(2)制备乳发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA文库用限制酶HindⅢ(Takara Shuzo)消化如上所述获得的乳发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA和高拷贝数的大肠杆菌载体pHSG398(Takara Shuzo)。以合适的量混合这两种DNA，并使用TakaraDNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)连接，以构建乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA文库。(3)选择PBP基因克隆用如上所述获得的乳发酵短杆菌ATCC 13869的染色体DNA文库转化大肠杆菌的murE突变株TLKll(murE温度敏感型突变，J.Bacteriol.,1972,110:41-46)，并于42℃在含有20μg/ml氯霉素的L琼脂培养基(含有1.5％琼脂的L培养基)上培养过夜。
将形成的菌落接种到L液体培养基培养，从获得的细胞收集质粒。结果在该质粒中克隆了约5.3kb的HindⅢ片段。该质粒命名为pHSGH-H。(4)测定克隆的DNA片段的核苷酸序列使用具有7-脱氮-2-脱氧鸟苷三磷酸的Thermo测序酶荧光标记引物循环测序试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech)对前述的克隆片段进行双脱氧反应，并使用DNA测序仪DSQ-1000L(Shimadzu)测定所述核苷酸序列。测定的核苷酸序列示于SEQ ID NO:1。
实施例4构建PBP基因被破坏的乳发酵短杆菌菌株使用在日本专利公开第5-7491号中公开的温度敏感质粒经过同源重组，产生在染色体上具有破坏的PBP基因的乳发酵短杆菌。
使用pHSGH-H作为模板，使用具有SEQ ID NO:5和6所示的核苷酸序列的寡核苷酸作为引物，进行PCR，以扩增PBP基因片段。SEQ ID NO:5所示的引物含有对应于SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的核苷酸数31-50的序列，SEQ ID NO:6所示的引物含有对应于SEQID NO:1所示核苷酸序列的核苷酸数2991-3014的序列，而它们每个在5′末端序列中都具有EcoRⅠ识别序列。使用市售PCR仪器(由TakaraShuzo等生产的DNA热循环仪，型号PJ2000)和TaqDNA聚合酶(Takara Shuzo)，按照厂商的方法进行所述PCR反应。
用EcoRⅠ处理获得的扩增片段，并将其插入到pHSG299(由TakaraShuzo生产)的EcoRⅠ位点，产生pHSGE。另外用BamHⅠ和KpnⅠ消化棒状杆菌的温度敏感质粒pHSC4，获得含有复制控制区的基因片段，使用由Takara Shuzo生产的平端试剂盒平端化获得的片段，并使用XbaⅠ接头(由Takara Shuzo生产)将其插入到pHSGE的XbaⅠ位点，产生pHSGX。然后，用BamHⅠ和KpnⅠ消化pHSGX，用由TakaraShuzo生产的平端试剂盒平端化，并使用Takara DNA连接试剂盒2型(Takara Shuzo)使其产生自连接。获得的质粒pHSGXΔBK具有内部缺失的PBP基因。
使用如上所述获得的用于PBP基因置换的质粒pHSGXΔBK，利用双重组技术进行缺失型PBP基因和在乳发酵短杆菌染色体DNA上的PBP基因之间的基因置换。具体而言，如下完成所述置换。通过电脉冲法(参见日本专利公布第2-207791号)，用pHSGXΔBK转化乳发酵短杆菌ATCC 13869。于25℃在M-CM2G液体培养基中振荡培养转化体6小时，并将其接种到含有25μg/ml卡那霉素的M-CM2G培养基上。获得于34℃形成菌落的菌株。
在获得的菌株中，将缺失型PBP基因与原来存在于染色体上的PBP基因重组，将染色体PBP基因和缺失型PBP基因的两个融合基因插入到染色体中，这样在两个融合基因之间应当存在所述重组DNA的其它部分(载体区段、温度敏感复制控制区和药物抗性标记)。因此，所述转化体菌株在高温下可以生长，因为正常的PBP基因在此状态下是占优势的。
然后，于25℃培养所述转化体菌株，由在25℃可以生长但在34℃不能生长的菌株中选择其中染色体上的PBP基因用缺失型基因置换的菌株，并命名为ΔP3/p3菌株。在所述ΔP3/p3菌株中，在染色体DNA上留下缺失型PBP基因，而含有正常PBP基因的质粒存在于细胞中。通过测定缺失区之后留下的连接区的核苷酸序列，证实染色体上的PBP基因是否由缺失型置换。
工业适用性按照本发明，提供棒状杆菌的编码青霉素结合蛋白的基因(PBP基因)。使用具有所述基因的棒状杆菌(其中染色体上的PBP基因被破坏)，在存在显著量的生物素而不加入生物素活性抑制剂的情况下可以生产L-谷氨酸。
序列表<110>Ajinomoto Co.,Inc.<120>编码青霉素结合蛋白的基因和生产L-谷氨酸的方法<130>0P843-PCT<141>1999年3月5日<150>JP10-55608<151>1998年3月6日<160>6<170>ParentIn，版本2.0<210>1<211>5347<212>DNA<213>乳发酵短杆菌<220><221>CDS<222>(881)..(2623)<220><223>CDS<224>(2790)..(4454)<220><225>CDS<226>(4467)..(5345)<400>1aagcttcggg gaggggcgcg tcgataagca cgcaacctcg tcgtgacatg gcgccggaaa 60ggaaacaacc cgggccctgg tgaaccctgg cgtgcagcaa cgcgtaattg atgcagcaca 120agctgggctc tcagcaggtt atgtcggtgc gtggtcgccg cgttgaggca aaacgtgctg 180atcctaaggt gatccagctg tctgtgctgg tggttatcct gctgtgcgtt ggtgttggcg 240cgaccatggg tctgtccgga acgtctacac agcagacttt ccagttgcag gaacttcagg 300caactgaaac ggatttgagc aatcgcattg agtctctcaa ccgagatgtg gaagatgctc 360gctcagcagc aaccttggca gcgaatgcta cggagatggg cttggtatcc ccagtggaac 420ctggcgtgct cgcagtgcag gaaaacggtg atgttgtgga ggagcgcgaa caaatccaga 480gacacgccct atagttgaca tcaatggaca acagacccga ccaaatcggg catcaagcaa 540ccctgacgag actaacgcat actgaaaacc tccaggcgat tccacaagaa gcagcagctc 600cgccgtatca gaccaacact gttccttatg 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130 135 140Ile Ala Thr Val Leu Gly Gln Asp Gly Pro Thr Val Ala Pro Pro Gly145150 155 160Ser Phe Asn Asn Glu Leu Gly Leu Pro His Thr Val Arg Cys Thr Thr165 170 175Asp Thr LyS Tyr Leu Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Gly Ile Gly His180 185 190Ile Lys His Leu Thr Glu Ile Arg Pro Pro Arg Ile Ala Ala Val Leu195 200 205Asn Val Gly His Ala His Leu Gly Glu Phe Gly Ser Arg Glu Asn Ile210 215 220Ala Gln Ala Lys Gly Glu Ile Ile Glu Ala Leu Pro Ser Lys Lys Thr225 230 235 240Gly Gly Val Ala Val Leu Asn Ala Asp Asp Pro Phe Val Ala Arg Met245 250 255Ala Pro Arg Thr Lys Ala Arg Val Val Trp Phe Thr Thr Asp Ala Gly260 265 270Gln Ala Lys Lys Ser Asp Tyr Trp Ala Thr Ser Ile Ser Leu Asp Ala275 280 285Val Ala Arg Ala Ser290<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5gcgcgaattc cgcaacctcg tcgtgacatg 30<210>6<211>340<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>6gcgcgaattc aagaccaata gccgcgattg cttg 3权利要求
1．生产L-谷氨酸的方法，该方法包括以下步骤在液体培养基中培养棒状杆菌，以在该培养基中生产和积累L-谷氨酸；收集L-谷氨酸，其中在所述棒状杆菌中青霉素结合蛋白(PBP)通常不起作用，且所述棒状杆菌具有生产L-谷氨酸的能力。
2．按照权利要求1的方法，其中所述棒状杆菌是其中青霉素结合蛋白通常在第一温度起作用、而在第二温度通常不起作用的细菌；该方法包括以下步骤在第一温度培养所述细菌，以增殖该细菌，在第二温度培养该细菌，以生产L-谷氨酸。
3．按照权利要求2的方法，其中所述棒状杆菌是带有包含编码青霉素结合蛋白的基因(PBP基因)和温度敏感复制控制区的质粒的细菌，其中在染色体上的所述PBP基因不起作用，且所述质粒在第一温度可以复制，而在第二温度不能复制。
4．按照权利要求2的方法，其中由所述棒状杆菌产生的青霉素结合蛋白具有温度敏感型突变。
5．按照权利要求1-4中任一项的方法，其中当所述青霉素结合蛋白结合青霉素G时，所述青霉素结合蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示的分子量约60,000。
6．按照权利要求1-4中任一项的方法，其中所述青霉素结合蛋白具有在序列中的SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。
7．按照权利要求3的方法，其中所述PBP基因具有至少包含在序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸数881-2623的序列的核苷酸序列。
8．编码在下述(A)或(B)中定义的蛋白的DNA(A)具有在序列表中的SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；(B)具有在序列表中的SEQ ID NO:2的氨基酸序列并具有结合青霉素的活性的蛋白，所述氨基酸序列包括一个或几个氨基酸的置换、缺失、插入、添加或翻转。
9．按照权利要求7的DNA，该DNA是在以下(a)或(b)中定义DNA(a)至少包含在序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸数881-2623的核苷酸序列的DNA；(b)在严格条件下可与至少包含在序列表中的SEQ ID NO:1的核苷酸数881-2623的序列的核苷酸序列杂交，并编码具有结合青霉素的活性的蛋白的DNA。
全文摘要
生产L－谷氨酸的方法,该方法包括在不让温度敏感复制调节区发挥其作用的温度培养棒状杆菌的步骤,在所述棒状杆菌中染色体上的编码青霉素结合蛋白的青霉素结合蛋白基因(PBP基因)已经被破坏,且在具有所述温度敏感复制调节区的质粒上带有正常的PBP基因;包括在让所述温度敏感复制调节区发挥其作用的温度培养所述细菌的步骤,藉此生产L－谷氨酸。
文档编号C12P13/00GK1299418SQ9980565
公开日2001年6月13日 申请日期1999年3月5日 优先权日1998年3月6日
发明者和地正明, 永井和夫 申请人:味之素株式会社