专利名称：花粉特异性启动子的制作方法
技术领域：
本发明涉及花粉特异性启动子序列，含有该启动子的构建体和转基因植物细胞及植物，转化花粉的方法以及使用该启动子控制植物能育性的方法。
为了将两种植物的所需遗传性状导入一种植物，如品种或杂种，传统的方法是杂交繁育。为了可靠地获得性状一致的杂种，必需确保亲本植物不会自花传粉。
通过确保亲本系之一为雄性不育可以做到这一点。产生雄性不育的多种技术是已知的，也是本领域推荐使用的。其中一种方法包括人工地或机械化地除去雌性亲本植物的花药或穗状雄花。该植物只有通过雄性亲本的花粉才具有能育性，因此其后代为杂种。然而，该方法费力而且不完全可靠，因为一些雌性植物可能未被除去穗状雄花，或者在某些情况下，植物在被除去穗状雄花之后还会长出第二个穗状雄花。另外，在此系统中，雄性亲本能自花传粉，因此必需物理分离雄性和雌性亲本，从而使杂种的收获变得容易。这种分段种植法对于玉米很适用，因为其花粉较轻且量大。然而，该方法并不适用于花粉较重的种以及雄性和雌性花器包含在同一朵花中的种，如小麦，水稻。
防止花粉产生的化学方法也是已知的，美国专利4,801,326描述了可应用于植物或土壤以防止花粉产生的化合物。然而，这种技术也是费力的，而且不是十分可靠。必需以适当的时间间隔施用足够的化合物以确保传粉不会发生，这会对环境造成污染。另外，这些化合物还很昂贵。
基因工程提供了另一种替代方法，籍此在植物中产生，维持和/或随后恢复雄性不育。
已描述了一些系统，其中可诱导的启动子可根据外部化合物的施用或有效性来启动或关闭能育性。例如，WO 90/08830描述了通过表达破坏花粉生物合成的蛋白质的基因序列级联系统诱导植物雄性不育。WO 93/18171描述了使用GST启动子诱导型表达查耳酮合酶(chs)，并恢复了通过“敲除”内源性chs基因而具有不育性状的雄性不育植物的能育性。
WO 93/25695(PGS)中描述了不同的方法，该方法依靠使用绒毡层特异性启动子在绒毡层细胞中表达花粉致死基因芽孢杆菌RNA酶，该酶对花粉的产生是至关重要的，因此可破坏花粉产生。可使用恢复基因芽孢杆菌RNA酶抑制剂来恢复能育性(Mariani等，自然，Vol357:384-387)。
直接以可控制的方式在花粉中表达对花粉产生有影响的基因将是有利的。必要时，能育性应能被恢复。
基因工程雄性不育系统的组成成分是使用在花粉中或花粉产生或发育所依赖的组织中特异性地驱动表达的启动子。
很多在花粉和萌发的花粉中特异性表达或高表达的特征性基因编码对细胞壁代谢可能起作用的蛋白质，例如，与编码参与果胶降解的酶；多聚半乳糖醛酸酶(SM Brown等..，植物细胞(1990)2:263-274,SJ Tebbutt等..，植物分子生物学。(1994)25:283-299)，果胶酸裂解酶(HJ Rogers等.，植物分子生物学，20:493-502(1992),RAWing等.，植物分子生物学，14:17-28(1989))和果胶甲基酯酶(PME)(JH Mu等.，植物分子生物学，25:539-544(1994))的基因具有同源性的基因。
其它在花粉中高表达的基因包括编码细胞骨架蛋白(I.Lopez等..，Proc.Natl,Acad Sci USA 93:7415-7420(1996),HJ Rogers等..，植物杂志4:875-882(1993)和CJ Staiger等..，植物杂志4；631-641(1993))，推定的抗坏血酸氧化酶，Kunitz蛋白抑制剂的基因和很多其功能不能由与已知基因的同源性推断的其它基因。已研究了这些基因的时序表达，发现在成熟的小孢子母细胞中，很多基因在小孢子发生的晚期表达量最高。在某些情况下，阐明了花粉管中的持续表达(AK Kononowicz等.，植物细胞4；513-524(1992))。这些基因被称为“晚期基因”。此阶段的大多数表达来自营养细胞而不是生殖细胞，大多数晚期基因可能由营养核转录而来；但仅证实了一个“晚期”基因是由营养核转录得到的(D.Twell，植物杂志2:887-892(1992)。已发现花药中表达的不同类别的基因具有不同的表达程序，四分体阶段后不久即可首次检测到表达，而在花粉成熟之前表达量已直线减少。这些“早期”基因的主要作用可能在小孢子分化和发育而不是花粉管生长的过程中体现。另外，美国专利5.086,169(Mascarenhas)描述了从玉米中分离出的第一个花粉特异性启动子。
发明人已分离出另一个仅在花粉组织中特异性表达的启动子。该启动子得自分离自玉米的“晚期”花粉表达基因ZmC5。
因此，根据本发明的第一方面，提供了含有玉米ZmC5基因的启动子序列或其变体或其片断的重组核酸序列，所述核酸序列可用作花粉中的启动子。
本文所用术语“片断”包括保留启动子活性的基本序列的一个或多个区域。当片断含有一个或多个区域时，可直接将它们连接在一起，或者用其它碱基将它们隔开。
本发明所用术语“变体”指的是对上述核酸序列进行一个或多个核苷酸的任何取代，变异，修饰，替换，缺失或添加，仍表现出花粉启动子表达的序列。该术语还包括可与上述核酸序列基本上杂交的序列。
本文所用术语“ZmC5基因”指的是编码本文所述563个氨基酸长的序列的玉米基因。编码该序列的cDNA序列在EMBL Y13285中限定。
本发明的启动子序列包含在1998年1月26日保藏于国立工业和海洋细菌保藏中心的克隆NCIMB 40915中。该启动子序列是可按下文所述得到的SalⅠ片断。启动子区域位于由下文
图1所示的玉米ZmC5基因转录起始位点上游约2kb序列组成的区域内。
根据本发明的优选实施方案，提供了含有启动子序列或其变体或其片断的重组核酸序列，所述启动子序列至少含有图5所示DNA序列的一部分或至少含有与图5编码的启动子具有基本类似活性的启动子的编码序列的一部分。
术语“基本上类似的活性”包括与本发明的DNA互补和杂交的DNA序列，所述序列编码在花粉中起作用的启动子。优选所述杂交在低度和高度严紧的条件下进行，或在介于两者之间的条件下进行。通常，低度严紧条件为约60℃-约65℃的温度，3 x SSC，高度严紧条件为约65℃,0.1x SSC。SSC是0.15M NaCl,0.015M柠檬酸三钠的缓冲液名称。3 x SSC的浓度为SSC的三倍，依此类推。
可使用本发明的花粉特异性启动子，通过驱动能干扰花粉产生或生存能力的基因而导致雄性不育，或在花粉粒中特异性表达目的基因。
根据本发明的第二方面，启动子序列可以与需要在花粉，尤其是晚期花粉生成中表达的基因一起形成表达盒的一部分。所述基因包括对花粉或花粉生成有影响的基因。所述基因可以是参与控制雄性能育性的基因，编码杀昆虫毒素(然后可靶向以花粉为食的昆虫)的基因，或可增强或修饰花粉的营养价值的基因。另外，可使用启动子序列驱动选择标记的表达以用于花粉转化。适当选择标记基因的例子包括抗生素抗性基因，如卡那霉素抗性基因，潮霉素抗性基因和PAT抗性基因以根据种(如玉米，水稻，小麦)鉴定稳定的转化体。
术语“表达盒”与术语“DNA构建体”，“杂合体”和“缀合体”是同义词，其包括直接或间接与调节启动子结合的效应基因，从而形成盒。间接结合的例子是提供适当的间隔基，如启动子和靶基因中间的内含子序列。DNA序列可进一步位于不同的载体上，因此，不必位于相同的载体上。本发明中所述的术语“融合”同样包括直接或间接结合。所述构建体还包括适于转化目的细胞的质粒和噬菌体。
根据优选实施方案，本发明的表达盒含有上述启动子序列，处于适当位置的该序列可以控制对花粉发育有害的基因的表达，如编码芽孢杆菌RNA酶，腺嘌呤核苷酸转运蛋白，突变的微管蛋白，(WO 97/04116中所要求的)T-urf或海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)的基因。
例如，WO 93/25695描述了编码细胞毒性蛋白质芽孢杆菌RNA酶的基因的用途，该基因受绒毡层特异性启动子的控制。芽孢杆菌RNA酶在绒毡层细胞中的表达对这些细胞有破坏作用，并会破坏花粉的产生。
核酶是能催化内切核酸酶裂解反应的RNA分子。它们能反式催化反应并能靶向不同的序列，因此，可以替代反义核酸而成为调制基因表达的工具。Hasselhof和Gerlach((1988)自然Vol 334:585-591)或Wegener等(1994)Mol Gen Genet 245(465-470)已阐明通过在植物中表达核酶基因而产生反式-显性突变。必要时，可使用本发明的花粉特异性启动子控制核酶的表达以使它们在花粉中特异性表达。
Baulcombe(1997)描述了通过使用可复制的病毒RNA载体(AmpliconsTM)使转基因植物中基因沉默的方法，所述方法也可用作敲除内源性基因表达的工具。该方法的优点是产生显性突变(即在杂种状态下可计数)并敲除所有拷贝的靶基因，也可敲除同种型。在身为六倍体的小麦中这是明显的优点。然后可通过使用可诱导的启动子驱动敲除基因功能性拷贝的表达，从而恢复能育性。通过将花粉特异性启动子作为组件插入AmpliconTM载体，基因表达将特异性地在花粉中进行。
将细胞毒性或破坏性基因用作破坏花粉产生的工具需要表达恢复基因以重新获得能育性。适当的构建体还含有表达盒，其中含有能克服所述有害基因的影响的核苷酸序列，如恢复基因(如对芽孢杆菌RNA酶而言为芽孢杆菌RNA酶抑制剂，或对TPP而言为TPS)或编码对有害基因而言为有义或反义的构建体的序列。
控制有害基因表达的另一种方法是使用操纵基因序列。可按WO90/08830所述将如lac,tet,434等的操纵基因序列插入启动子区域。然后阻抑物分子可与这些操纵基因序列结合并阻止下游基因(如对花粉发育有害的基因)转录(Wilde等。(1992)EMBO J.11,1251)。另外，可以按(Lehming等。(1987)EMBO.6,3145-3153)所述制备结合能力有所增强的操纵基因序列，如Lac IΔHis突变体。该突变体第17位氨基酸由酪氨酸转变为组氨酸，从而能严格控制表达。与阻抑物的诱导型表达联合使用可以表达关闭的失活基因。
籍此，可在表达系统中掺入表达盒以按上文所述控制植物的能育性。
术语“表达系统”指的是上述系统可在适当的生物，组织，细胞或培养基中表达。所述系统可含有一个或多个表达盒，也可含有确保通过使用调节启动子来增加靶基因表达的其它组分。
根据本发明的第三方面，提供了表达系统，其含有(a)在花粉中特异性表达的第一启动子序列；(b)第一基因，当它在所述花粉特异性启动子的控制之下表达时能破坏花粉生物发生；(c)第二启动子序列，其对外源性化学诱导剂的存在或缺乏有所反应；和(d)第二基因，它编码可抑制所述第一基因的表达，或可抑制所述第一基因编码的蛋白质的元件，并与所述第二启动子序列可操作相连并受该启动子序列的控制。
上述元件(a),(b),(c)和(d)可由一个或两个独立的载体提供，但优选包含在相同的载体中以确保共-分离。可用它们转化或共转化植物细胞以使元件之间发生适当的相互作用。
第二启动子序列和第二基因为第一基因提供了化学开关。当第二启动子序列对外源性化学诱导剂的存在有所反应时，对花粉或植物使用化学诱导剂会使第二基因开始发挥作用，籍此与第一基因的作用相抗衡。如果第二启动子序列仅在缺乏化学诱导剂时有活性，那么化学诱导剂的缺乏会起到与上述类似的作用。
元件(c)和(d)适于采取表达盒的形式，该表达盒中含有能克服所述有害基因的影响的核苷酸序列，如恢复基因(如对芽孢杆菌RNA酶而言为芽孢杆菌RNA酶抑制剂，或对TPP而言为TPS)或编码对有害基因而言为有义或反义的构建体的序列，或当所用操纵基因序列与诱导型启动子可操作地相互连接时为编码阻抑物分子的基因。
本发明的表达系统还可含有选择标记，如除草剂抗性基因或抗生素抗性基因以根据种(如玉米，水稻，小麦)鉴定稳定的转化体。除草剂抗性基因的存在也可选择分离群体中的雄性不育子代。
用这种表达系统转化植物会导致产生雄性不育植物，产生这种植物的方法构成本发明的第四方面。
根据本发明此实施方案的表达系统(其中的基因对有活力的花粉的生成有害)可用于产生杂合体，但是，当雄性不育品系可被制备成纯合子时，该表达系统尤其有用。当使用“晚期”启动子，如上述ZmC5启动子时，由于基因产物在花粉发育的晚期表达，主要转化子和杂合子所产生花粉的不育性按1∶1分离，即50％花粉是能育的，因此可自花传粉，产生非-杂合的种子。
为了得到纯合的不育植物，必须使用适当的化合物，如对AlcA/R开关而言为乙醇或对GST开关而言为安全剂，使诱导型启动子发挥作用以驱动恢复基因的表达，籍此灭活有害基因，允许根据下列模式进行自花传粉。MS=显性雄性不育Rcs=诱导型恢复系杂合基因型MSRcs--配子 MSRcs…自花传粉进行化学诱导之后
MSRcs ...MSRcs MSMSRcsRcs ...MSRcs... MSRcs---......
纯合子代(MSMSRcsRcs)的所有花粉都是不育的，杂合子代(MSRcs--)的50％花粉是不育的，无效(……)子代的所有花粉都是能育的。用活体染料，如DAPⅠ染色这些品系的花粉可以鉴定产生100％不育花粉的植物。或者，可对这些分离的群体重复进行诱导和自花传粉，并分析子代不育性的分离。显然，由纯合品系自花传粉得到的所有子代自身是纯合的和雄性不育的，即它们将产生100％不育的花粉，而由杂合品系自花传粉产生的后代将持续分离不育性。或者，如果导致雄性不育的基因与赋予除草剂抗性的基因连接，即可在幼苗阶段用除草剂喷洒后代，除草剂耐受性将与不育性基因一起分离。通过这种方法可鉴定和选择雄性不育亲本以用于产生杂合体。
一旦鉴定完毕，可使用该纯合不育品系，通过被未经修饰的近交雄性亲本品系异花传粉而产生F1杂合体。具体内容见下文雌性亲本 雄性亲本MSMSRcsRcs******配子MSRcs ***MSRcs MSRcs*** MSRcs*** MSRcs***F1*** MSRcs*** MSRcs***因此，所有F1种子都是杂种，其不育性是杂合的，这意味着各个植物50％的花粉是能育的。在如玉米的作物中，这是足够有活力的花粉，能确保因各个雄花穗所产生花粉的量相当可观而在整块田里进行完全的传粉。对小麦而言，这也是足够有效的花粉，能确保自花传粉时没有产量损失，这是因为传粉时花仍旧闭合从而降低了风造成的损失。在收集植物营养部分的种中，花粉生存能力的降低不是要考虑的因素。
杂交种子生产者的另一个优点在于如果农民想保留F2种子供以后的种植，将会因为杂种优势的丧失而导致产量损失。具体内容见下文F1 MSRcs***配子MSRcs(无活力) ***MSRcs 无 ***MSRcsF2*** 无 *** ***通过使用诱导型启动子进行激活，这些方法也可回复例如杂合体生产过程中的不育性。
根据本发明的第五方面，提供了控制植物能育性的方法，所述方法包括用上述表达系统转化所述植物，并当能育性回复时，激活诱导型启动子。
适当的诱导型启动子包括通过使用外部化学刺激物如除草剂安全剂来控制的启动子。诱导型启动子的例子包括例如二组分系统，如我们的公开国际申请WO 93/21334中描述的alcA/aIcR基因开关启动子系统，我们的公开国际申请WO 96/37609中描述的蜕皮激素开关系统或公开的国际专利申请WO 90/08826和WO 93/031294中描述的GST启动子(上述专利申请皆列入本文作为参考)。本文将这种启动子系统称为“开关启动子”。与开关启动子联合使用的开关化合物是农业上可接受的化合物，从而使该系统对本发明的方法特别有用。
如果本发明的花粉特异性启动子被用于得到雄性不育性，由于花粉是单倍体，通过此方法不能完全回复能育性。这意味着激活恢复基因之后产生的花粉中仅有50％是能育的。但使用本发明启动子的表达是高度组织特异性的事实与此结论相悖。
这一特性使得在一些非常特别的应用中使用本发明的启动子特别有用。例如，当需要转化花粉时，使用花粉特异性的启动子是非常合乎需要的。已知这种应用的一个例子为MAGE LITER(雄性种系转化)，它描述于Stoger等(植物细胞报道14(1995)273-278)。在此方法中，通过微粒轰击转化花粉。使用花粉特异性启动子驱动例如选择标记基因。启动子是花粉特异性的，这一事实赋予了几个优点。首先，标记仅在花粉而不在植物的其余部分中表达，因此其余的植物组织不含不需要的标记。另外，只有花粉中具有选择标记使得通过常规方法再次转化而无需具有不同的选择标记成为可能，即使得基因堆积较为容易。花粉转化之所以重要的原因是花粉需经受孢子体发育阶段，即产生单倍体和双倍体植物。这意味着可一步获得纯合性。或者，可使用转化的花粉传粉于野生型植物，从而得到携有导入的转基因的种子，这也是比传统转化途径更加快速的方法。
可通过任何可以使用的方法将本发明的表达系统导入植物或植物细胞，所述方法包括通过含有重组Ti质粒的根瘤农杆菌进行感染，电穿孔，微量注射植物细胞和原生质体，微粒轰击，细菌轰击，尤其是“纤维”或“(噬菌体)颈须”法，和花粉管转化，所用的具体方法取决于被转化的特定植物种。然后在适当条件下将转化细胞再生为完整的植株，其中新的核物质被稳定掺入基因组。以此方法可得到转化的单子叶和双子叶植物。可参照详细描述已知方法的文献。该方法构成了本发明的另一方面。
本发明的方法可用于产生多种杂合植物，如小麦，水稻，玉米，棉花，向日葵，糖甜菜和莴苣，油菜子和番茄。
含有上述植物基因表达系统的植物细胞以及含有这些细胞的植物共同构成本发明的另一方面。
根据本发明的第九方面，提供了可复制的病毒DNA载体(AmpliconTM)，其含有上述重组核酸。
根据本发明的第十方面，提供了用上述表达系统转化花粉细胞的方法。
下面将参照附图通过实施例具体描述本发明。
图1图示了ZmC5 cDNA的序列排布，该cDNA具有其相应基因5’区域的2.4kb片断。转录起始位点以*表示，下划线的是推定的翻译起始位点。Sa=SalⅠ,S=SmaⅠ,Sp=SphⅠ,H=HindⅢ,X=XhoⅠ,P=PstⅠ；图2显示了玉米(近交系A188)基因组DNA的Southern印迹。各泳道含有15微克经消化的基因组DNA，泳道1的消化酶为Eco RⅠ，泳道2为Hind Ⅲ，泳道3为BamHⅠ。将Southern印迹与经放射性标记的ZmC5 cDNA探针杂交。
图3为显示出多种玉米组织总RNA的18S RNA经溴化乙锭染色的凝胶和用ZmC5 cDNA探针探测的相同凝胶的Northern印迹。(A)用10微克多种玉米组织的总RNA上样凝胶；(B)用10微克分离自茎，不同发育阶段的小穗，花粉和萌发花粉的总RNA上样凝胶。
图4显示了(A)ZmC5::uidA构建体和连接序列的物理图谱。由*， 与◆表示的A残基分别对应于ZmC5转录起始位点，除去HindⅢ位点(为了易于克隆)的T至A突变和ZmC5启动子区域的3’末端。下划线的是uidA翻译起始位点。(B)显示出蓝染分离的转基因ZmC5::uidA烟草花粉的GUS活性组化分析。(C)得自两个转基因品系GC5-2(白柱)和GC5-7(灰柱)的转基因烟草组织中的ZmC5启动子活性。各个品系的数据描述了对非转基因对照而言为标准化的两次独立试验的平均值。出芽阶段如下所述Bud-1相当于5-8mm的芽(减数分裂/四分体阶段的小孢子)，Bud-2:10-12mm的芽(单核小孢子)，Bud-3:13-15mm的芽(小孢子有丝分裂)，Bud-4:(17-22mm)早期至中期双核配子体，Bud-5:(27-45mm)中期至晚期双核配子体(Tebbutt等，文献同上)。
图5显示了编码玉米ZmC5启动子序列的DNA序列。下划线的A是推定的转录起始位点，黑体和下划线的ATG是翻译起始位点。
图6显示了含有C5-芽孢杆菌RNA酶/芽孢杆菌RNA酶抑制剂-nos的表达盒。
使用PCR片断筛选玉米(近交系B73)基因组文库(8×106个噬斑)，所述片断对应于经随机引发(Ausubel等，文献同上)标记的cDNA克隆ZmC5c的5’270bp。对一个阳性克隆ZmC5g进行噬斑纯化。将亚克隆至pUC19的ZmC5g 2.5kb SalⅠ片断的序列与ZmC5c(保藏为NCIMB40915)相比较，结果表明两个序列重叠，它们是相同的，克隆代表的是相同的基因。有关基因组克隆2.5kb片断与cDNA之间重叠的描述示于图1。
使用与编码序列(数据未显示)核苷酸1至21(5’-ACCTAGGAGAGCCTTTGCCAT-3’)和56至82(5’-AGCGGGTGACGGTGGCGACCACACCGA-3’)互补的两个寡核苷酸引物作图转录起始位点。产物的转录起始位点明确位于推定ATG上游仅15个碱基处的A核苷酸(图1)。已发现其它花粉特异性基因具有长的5’非翻译序列(SJ Tebbutt等..，植物分子生物学(1994)25:283-299)，因此，这一ZmC5g区域似乎异常短。经计算，这一短的5’UTL的自由能为0.9kJ/mol(M.Zuker，酶学方法。(1989)180:262-288)，使得它不可能形成任何稳定的二级结构。
鉴定出1692bp的开放阅读框，推定的ATG起始密码子(图1)与共有序列(HA Lutcke等..，EMBO J6:(1987)43-48)较好地符合。推定的TATAA基元(CP Joshi，核酸研究，15:6648-6653(1987))从-32位开始，然而，在转录起始位点(图1)上游60bp处未发现在很多其它植物基因中可发现的可识别的CAAAT基元。ZmC5c缺乏清楚可识别的AATAAA聚腺苷酸化位点信号，这并不奇怪30％植物基因缺乏可识别的AATAAA基元(BD Mogen等..，植物细胞2(1990)1261-1272)。在ZmC5c中，polyA添加位点上游16bp处5个A残基的一段序列可用作聚腺苷酸化信号，但已发现其它花粉特异性转录物的AATAAA基元与poly(A)+添加位点之间的距离大于平均距离(Tebbutt等，文献同上)。
用acto-胭脂红染色花药将小穗分为几个阶段，发现花药含有处于下列阶段的细胞减数分裂前的sporpogenous细胞(0.25cm)，分裂前期Ⅰ中期(0.5cm)，成熟的花粉粒(1.0cm)。然而，连续的阶段之间的一些重叠是不可避免的，因为相同小穗内的两个小花之间发育阶段有所不同。Northern分析表明ZmC5表达局限于成熟的裂开的花粉和萌发的花粉，在包括小穗的任何其它玉米组织中未检测到表达，所述小穗含有处于小孢子发生较早阶段的细胞。
收集转基因植物裂开的花药中的花粉粒，按J.A.Jefferson(植物分子生物学报道(1987)5:387-405)所述染色其GUS活性。两个植株为显示出约50％蓝染花粉的阳性(图4B)。在非转基因对照中未检测到蓝色。为了研究整合位点的数目，将两个转基因品系的植株自交，对后代的卡那霉素抗性进行评分。转基因植物GC5-2的后代中，303个为卡那霉素抗性，8个对卡那霉素敏感，平均比例为38∶1，表明至少有两个整合位点。转基因植物GC5-7的后代的卡那霉素抗性∶卡那霉素敏感的平均比例为3.8∶1，表明只有单个整合位点(一个整合位点的预期比例为3∶1，两个整合位点的预期比例为15∶1，三个整合位点的预期比例为63∶1)。
从包括5个发育阶段的花药的多种组织中制备提取物，通过荧光测定法分析fir GUS表达(Jefferson，文献同上)。图4(C)显示了两个转基因植物的GUS活性。除发育中的和成熟的裂开花药外，在其它组织中仅检测到很低水平的表达。在烟草中，芽发育的阶段与芽的长度相关(Tebutt等，文献同上)，但这取决于生长条件。因此，Bud-1相当于减数分裂/四分体阶段的小孢子，Bud-2单核小孢子，Bud-3小孢子有丝分裂，Bud-4早期至中期双核配子体，Bud-5中期至晚期双核配子体。由DAPⅠ染色(数据未显示)评估的小孢子阶段表明烟草中ZmC5启动子的表达时序与其在玉米中的表达(根据Northern数据)符合得较好(图3；图4C)。因此，在玉米和转基因烟草的天然环境中，ZmC5启动子在花粉发育的晚期起作用，在小孢子有丝分裂之前实际上无活性。两个转基因品系之间存在一些表达上的差异，GC5-2在受试的大多数组织中有较高水平的表达。转基因群体中经常存在表达水平的差异，这是因为转基因9SLA的插入位点所致(Hobbs等，植物分子生物学21:17-26(1993))。
诱导后，番茄花药和花粉的GUS染色显示出明显的GUS表达。希望得自其它种的花粉也有相同的结果。
对本发明的其它改动对本领域技术人员而言是显而易见的，并且不脱离本发明的范围。
权利要求
1．重组核酸序列，所述核酸序列含有玉米ZmC5基因的启动子序列或其变体或其片断并可用作花粉中的启动子。
2．权利要求1的重组核酸序列，其含有由下文图1所示的玉米ZmC5基因转录起始位点上游约2kb序列。
3．权利要求1或2的重组核酸序列，其含有启动子序列或其变体或其片断，所述启动子序列至少含有图5所示DNA序列的一部分或至少含有与图5所述的启动子具有基本类似活性的启动子的编码序列的一部分。
4．表达盒，其含有权利要求1至3中任一项的核酸序列，其中处于适当位置的表达盒可以控制需要在花粉中表达的基因，所述基因编码的产物对花粉产生，杀昆虫毒素，或增强或修饰花粉的营养价值有影响。
5．权利要求4的表达盒，其中所述基因含有对花粉发育有害的基因。
6．权利要求5的表达盒，其中所述基因含有编码芽孢杆菌RNA酶，腺嘌呤核苷酸转运蛋白，突变的微管蛋白，T-urf或海藻糖磷酸磷酸酶(TPP)或核酶的基因。
7．权利要求4的表达盒，其中所述基因含有选择标记基因。
8．权利要求7的表达盒，其中选择标记基因含有抗生素抗性基因。
9．表达系统，其含有权利要求4至8中任一项的表达盒。
10．权利要求9的表达系统，其含有对花粉有害的基因，还含有表达盒，所述表达盒含有与可被化合物诱导的启动子可操作相连的第二核酸序列，所述核酸序列编码能克服所述有害基因影响的肽或蛋白质。
11．权利要求10的表达系统，其中所述核酸序列含有恢复基因。
12．权利要求11的表达系统，其中所述恢复基因是芽孢杆菌RNA酶抑制剂或TPS。
13．权利要求10的表达系统，其中所述核酸序列编码对所述有害基因而言为有义或反义的构建体以抑制其表达。
14．权利要求10的表达系统，其中所述第二核酸序列编码lac,tet,434,lac-His的阻抑蛋白，它与同权利要求1至3中任一项的核酸序列或AmpliconTM可操作相连的操纵基因序列相互作用以阻止需要在花粉中表达的第一基因的表达。
15．权利要求10至14任一项的表达系统，其中可诱导的启动子是AlcA/R,GST或可被蜕皮激素诱导的启动子。
16．权利要求9至15任一项的表达系统，其进一步含有选择标记。
17．权利要求9至16任一项的表达系统，其中需要在花粉中表达的基因与除草剂抗性基因相连。
18．表达系统，其含有(a)在花粉中特异性表达的第一启动子序列；(b)第一基因，当它所述花粉特异性启动子的控制之下表达时能破坏花粉生物发生；(c)第二启动子序列，其对外源性化学诱导剂的存在或缺乏有所反应；和(d)第二基因，它编码可抑制所述第一基因的表达，或可抑制所述第一蛋白质的元件，并与所述第二启动子序列可操作相连并受该启动子序列的控制。
19．生产植物的方法，所述方法包括用权利要求9至18任一项的表达系统转化植物细胞。
20．植物细胞，其含有权利要求9至18任一项的表达系统。
21．含有权利要求20的细胞的植物。
22．诱导植物雄性不育的方法，所述方法包括用权利要求10至18任一项的表达系统转化植物。
23．控制植物能育性的方法，所述方法包括用权利要求11或权利要求18的表达系统转化所述植物，当能育性需要被恢复时，激活诱导型启动子。
24．权利要求23的方法，其中通过给植物使用化合物来激活诱导型启动子。
25．可复制的病毒RNA载体(AmpliconTM)，其含有权利要求1至3任一项的重组核酸。
26．转化花粉的方法，所述方法包括用权利要求9或权利要求18的表达系统转化花粉细胞。
27．参照任一附图，基本上如上所述的重组核酸，表达盒，表达系统或方法。
全文摘要
含有玉米ZmC5基因的启动子序列或其变体或其片断并可用作花粉中的启动子的重组核酸序列。启动子的DNA序列示于图5。本发明还包括表达盒和表达系统以及转化方法,包括本发明启动子序列的转化植物。核酸可特别地用于生产雄性不育植物和/或杂合体以及转化花粉。
文档编号C12N15/82GK1301300SQ9980526
公开日2001年6月27日 申请日期1999年1月22日 优先权日1998年2月20日
发明者A·J·格林兰德, H·J·罗杰斯, P·J·赫西 申请人:曾尼卡有限公司